絳蟲基因組學(xué)研究進(jìn)展

李秀榮，閆鴻斌，李 立，付寶權(quán),2，薄新文，朱興全，賈萬忠,2

絳蟲屬于三大類蠕蟲之一，因其種類眾多，生物學(xué)特性各異，分布廣泛，對人和動(dòng)物危害嚴(yán)重，數(shù)據(jù)表明，全球棘球蚴病和囊尾蚴病的負(fù)擔(dān)為每年數(shù)以百萬計(jì)的傷殘調(diào)整生命年，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法和治療藥物，絳蟲病容易被忽視，患病后通常難以治療，而且是致命的。絳蟲的生活史，除了個(gè)別寄生在人類和嚙齒動(dòng)物的絳蟲可以不需要中間宿主外，寄生在家畜的絳蟲，其發(fā)育需要1個(gè)或2個(gè)中間宿主，才能完成其整個(gè)生活史。因其特別的生活史，成為研究寄生蟲生長發(fā)育、入侵、寄生、致病等機(jī)理的理想模式生物[2]。

隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的日臻完善，人類、動(dòng)植物和微生物的基因組研究得以迅猛發(fā)展。近年來，寄生蟲的基因組計(jì)劃也引起了寄生蟲學(xué)家的極大興趣。通過寄生蟲基因組計(jì)劃，將會(huì)幫助科學(xué)家對生物學(xué)中的寄生現(xiàn)象有一個(gè)更加全面的理解，同時(shí)為人類的健康和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供保障。

1 絳蟲基因組測序現(xiàn)狀

絳蟲的基因組包括核基因組和線粒體基因組，本文提及的基因組指前者。自2004年起，開始了絳蟲全基因組的測序工作，包括多房棘球絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲(G1)、加拿大棘球絳蟲(G7)、微口膜殼絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲、亞洲帶絳蟲等基因組序列測定的完成并進(jìn)行了公開發(fā)表，肥頭帶絳蟲基因組序列的匯編和注解正在進(jìn)行中，還有其他一些絳蟲基因組序列測定正在進(jìn)行中(表1)。隨著棘球絳蟲基因組的接近完成，以及絳蟲基因組的進(jìn)一步完善，研究人員開始探索它們的全部內(nèi)容、結(jié)構(gòu)和一般特征[3]。這將有助于解決一些基礎(chǔ)性問題：1)物種的起源和進(jìn)化；2)絳蟲宿主特異性和組織特異性及其變化的分子基礎(chǔ)和機(jī)制；3)絳蟲致病機(jī)制；4)絳蟲逃避宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制；5)絳蟲生活史過程中為適應(yīng)宿主在不同分化階段控制其基因表達(dá)的信號調(diào)控機(jī)制；6)疾病預(yù)防和診斷的抗原譜或者分子遺傳標(biāo)記的篩選；7)新藥物設(shè)計(jì)時(shí)絳蟲與宿主代謝途徑上的異同分析和藥物靶標(biāo)篩選。

表1 已完成基因組測序的絳蟲種類及相關(guān)信息[4-9]

2 絳蟲基因組特征

目前已經(jīng)測序的絳蟲中除微口膜殼絳蟲染色體數(shù)目為2N=12外，其余絳蟲染色體數(shù)目均為2N=18[9]，基因組大小多為115～170 Mb(見表2)，比秀麗隱桿線蟲基因組(約100 Mb)稍大[11]，是曼氏血吸蟲基因組(約380 Mb)的1/3。絳蟲為了適應(yīng)寄生生活，其基因組也發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，基因組中重復(fù)序列少，但歐猥迭宮絳蟲等例外[5,10]。不同絳蟲基因組之間GC堿基含量差異明顯，從表2可以看出，其他絳蟲的GC含量都在43%左右，顯著高于微口膜殼絳蟲。通過鑒定多房棘球絳蟲全基因組可知，共有308個(gè)潛在多順反子，多順反子中基因的排列次序在絳蟲之間、絳蟲和吸蟲之間較為相似[12]。在營寄生生活的扁形動(dòng)物中，持家基因的數(shù)目大幅減少，絳蟲是持家基因丟失最多的一類物種，其特異性缺失基因中有一些是參與神經(jīng)發(fā)育的基因家族，也喪失了一些參與消化道形成的ParaHox基因和參與發(fā)育的Wnt補(bǔ)充物[13]。在絳蟲基因組也有擴(kuò)充，主要擴(kuò)充基因家族為熱休克蛋白70(Hsp70)家族。棘球絳蟲和豬帶絳蟲細(xì)胞質(zhì)Hsp70進(jìn)化枝的基因擴(kuò)充數(shù)目最多，總拷貝數(shù)分別達(dá)到22和32個(gè)，而人只有2個(gè)和6個(gè)Hsp70基因。絳蟲Hsp70缺乏典型細(xì)胞質(zhì)Hsp70特征，例如不含EEVD基序和GGMP重復(fù)單元，同時(shí)表達(dá)水平很低，幾乎不表達(dá)，而典型細(xì)胞質(zhì)Hsp70在不同的生活史階段呈組成性表達(dá)，這些基因家族與絳蟲的營養(yǎng)吸收、宿主環(huán)境適應(yīng)等機(jī)制相關(guān)[5]。絳蟲有一新的Argonaut亞家族蛋白，它可能結(jié)合一個(gè)新發(fā)現(xiàn)潛在小RNA前體分子，有研究發(fā)現(xiàn)棘球絳蟲Ago蛋白位于Piwi結(jié)構(gòu)域“DEDH”中[14]，這對于該蛋白在靶mRNA上的剪切活性至關(guān)重要。

表2 7種重要帶科絳蟲基因組總體特征

3 表觀基因組學(xué)研究

表觀基因組學(xué)是利用全基因組測量來表征真核生物的染色質(zhì)狀態(tài)和DNA修飾，主要使用DNA微陣列或深度測序方法對核酸群體(無論是DNA還是RNA)進(jìn)行全面分析[15]。絳蟲具有傳遞表觀遺傳信息的第二遺傳系統(tǒng)，與DNA鏈中核苷酸堿基序列的遺傳并行。表觀遺傳至少基于4種信息載體：通過胞嘧啶甲基化介導(dǎo)的DNA的化學(xué)修飾，組蛋白和其他染色質(zhì)蛋白的修飾，非編碼RNA和基因在細(xì)胞核中的相對位置[16]。表觀遺傳信息具有相對可塑性，并且可以直接受環(huán)境刺激的影響[17]，表型可以由基因型和表觀基因型共同編碼。表觀基因型可以通過環(huán)境的變化而改變，環(huán)境既是表型改變的有道因子，也是選擇因子[18]。從理論上講，擁有雙重遺傳系統(tǒng)的物種進(jìn)化速度快于只具有基因型遺傳能力的物種。許多寄生蟲能夠利用雙重遺傳系統(tǒng)，從相同的基因型種群中呈現(xiàn)多種表型變異[19]。測序(ChIP-Seq)后的DNA甲基化和染色質(zhì)免疫共沉淀，通過表觀遺傳基因的定位解讀基因活性和表達(dá)以及染色質(zhì)狀態(tài)。寄生蟲的表觀遺傳學(xué)研究大多與瘧疾和血吸蟲病有關(guān)，只有少數(shù)與腸道寄生蟲有關(guān)。在旋毛蟲中，鑒定出甲基化DNA，以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或其編碼基因的存在[20]。此外，在蠕蟲誘導(dǎo)的免疫抑制中證實(shí)了表觀遺傳宿主過程的調(diào)節(jié)[21]。絳蟲未來表觀基因?qū)W的研究將為人們更好地提供環(huán)境信號與寄生蟲傳感器和執(zhí)行分子之間的可能聯(lián)系，它們決定不同的寄生蟲發(fā)育和毒力編程[22]，這些結(jié)果將為我們提供疾病干預(yù)的潛在機(jī)會(huì)。

4 絳蟲miRNA研究

小RNA(micro RNA)是一類參與調(diào)節(jié)寄生蟲生長發(fā)育、寄生蟲感染和免疫以及宿主-病原體相互作用的調(diào)節(jié)性非編碼RNA。采用測序方法，在豬帶絳蟲后絳幼蟲鑒定出47個(gè)保守的miRNA和4個(gè)新的miRNA。miRNA的核苷酸偏倚分析顯示腺嘌呤(A)是miRNA起始處的顯性核苷酸，特別是在第3和第7核苷酸的位置[7]。不同miRNA家族之間的豐度差異顯著，可能是由于組織或發(fā)育階段特異性表達(dá)。在秀麗隱桿線蟲中，miR-71含量豐度高，調(diào)控發(fā)育和壽命[23-24]。在扁形蟲中，日本血吸蟲miR-71在卵中高表達(dá)，而在雌性成蟲中低表達(dá)，說明其在胚胎發(fā)育中起作用[25]。miR-71是棘球蚴不同生命周期階段中表達(dá)量最高的一種miRNA[26]。研究表明，多房棘球絳蟲miR-71在原頭節(jié)發(fā)育的不同階段存在差異表達(dá)，提示其在原頭節(jié)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[27]。47個(gè)miRNA在其他絳蟲中也被發(fā)現(xiàn)，不是棘球絳蟲特異的。鑒定的miRNA屬于34個(gè)不同的miRNA家族，其中miR-2家族由miR-2a、miR-2b-3p、miR-2b-5p、miR-2c-3p、miR-2c-5p、miR-2d-5p這6個(gè)成員組成。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同一家族中某些成員也存在較大差異，提示miRNA家族中存在功能差異[25]。絳蟲基因組的擴(kuò)展測序，可能解決有關(guān)絳蟲預(yù)防和控制問題，通過確定新的藥物和疫苗靶標(biāo)以及診斷測試、分析寄生蟲宿主的相互作用，從而中斷或阻斷寄生蟲的免疫逃避。

5 基于蛋白質(zhì)的基因組學(xué)

在囊型棘球絳蟲包囊中，抗原結(jié)合是最具代表性的分子功能，并發(fā)現(xiàn)天然免疫應(yīng)答蛋白功能。它們是不同類型的免疫球蛋白，與先天免疫有關(guān)。運(yùn)用質(zhì)譜(MS)的分析方法，對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量[28-30]，鑒定的85種蛋白中有6種匹配到細(xì)粒棘球絳蟲物種。在囊壁中，184個(gè)蛋白中有3個(gè)和卵細(xì)胞匹配，即磷脂酶D1、Ras相關(guān)蛋白Rab6B和肌聯(lián)蛋白，并發(fā)現(xiàn)了許多參與免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。其中囊壁的30種蛋白質(zhì)中，囊腔中不存在人類白細(xì)胞抗原(HLA)組織相容性抗原I和II類[30-32]?？铺厥现兄晨捉{蟲的成蟲和幼蟲的蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究發(fā)現(xiàn)，在鑒定的蛋白中，幼蟲和成蟲共有207個(gè)蛋白，其中157個(gè)是階段特異性蛋白，31個(gè)來自幼蟲，126個(gè)來自成蟲。幼蟲的功能主要與基礎(chǔ)代謝有關(guān)，通過無性繁殖，負(fù)責(zé)生長和營養(yǎng)發(fā)育。成蟲具有更廣泛的功能，包括大分子生物合成過程、基因表達(dá)和控制途徑[33-34]。絳蟲蛋白質(zhì)不僅在模式生物中存在，其他絳蟲中也存在，通過對其時(shí)空表達(dá)模式研究，一些已識別的階段特異性蛋白與特定的組織、結(jié)構(gòu)或分化過程相關(guān)。幼蟲期和成蟲期蛋白質(zhì)有明顯的生物學(xué)差異，這可能和與寄生蟲在不同宿主體內(nèi)代謝的變化有關(guān)[35]。利用這些技術(shù)可以了解疾病和其在宿主條件下的細(xì)胞和分子機(jī)制，以及蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物篩選提供有關(guān)絳蟲分子入侵宿主過程的功能信息，這些過程與寄生蟲的生存和發(fā)育有關(guān)。

6 藥物靶標(biāo)

利用生物信息學(xué)方法分析絳蟲基因組和用藥物處理前后蛋白質(zhì)變化差異，可以發(fā)現(xiàn)寄生蟲的基因(特別是必需基因)可能就是抗寄生蟲藥物的潛在靶標(biāo)或新藥物作用靶點(diǎn)[35]。分析豬帶絳蟲(T.solium)基因組序列，成蟲階段的16 000條EST序列中，與人類1.5%序列無同源性，這些基因成為豬帶絳蟲藥物治療、診斷、疫苗研制的候選基因[36]。通過結(jié)合基因組的代謝網(wǎng)絡(luò)和在電腦模擬分析來確定藥物靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)血吸蟲的胞苷酰轉(zhuǎn)移酶可以作為藥物靶標(biāo)分析，開發(fā)一種血吸蟲胞苷轉(zhuǎn)移酶特異性抑制劑[35, 37]。氯喹和青蒿素作用后惡性瘧原蟲，運(yùn)用蛋白組學(xué)方法分析滋養(yǎng)體階段蛋白質(zhì)表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)數(shù)量增加了30%，部分蛋白質(zhì)在藥物作用下表達(dá)量發(fā)生應(yīng)激性變化，蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于抗寄生蟲藥物作用機(jī)理的研究[38]。絳蟲和吸蟲的酶-硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶(TGR)是吸蟲內(nèi)一個(gè)必需的蛋白，并證實(shí)可以作為藥物靶標(biāo)[5]。對棘球絳蟲115個(gè)保守蛋白質(zhì)進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白具有催化或結(jié)合功能。加拿大棘球絳蟲所對應(yīng)的蛋白質(zhì)藥物靶標(biāo)與細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲有很高的同一性。篩選出42種絳蟲高度保守性蛋白，作為潛在的藥物靶標(biāo)，主要是涉及防御、抗原、轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、信號分子、運(yùn)輸和保守性較好蛋白質(zhì)[4,39]。絳蟲基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出來的差異蛋白主要與營養(yǎng)攝取、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫逃避應(yīng)答等重要生理過程有關(guān)，為藥物靶標(biāo)、疫苗候選分子、診斷抗原的篩選奠定了基礎(chǔ)。

7 展 望

絳蟲棘球蚴病是一類重要的人獸共患病，阻礙了社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，造成畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，絳蟲基因組的研究為絳蟲和宿主之間的作用機(jī)制提供了更廣闊的視角，了解寄生蟲的寄生機(jī)制，為絳蟲病的診斷提供新的依據(jù)。有關(guān)機(jī)構(gòu)已經(jīng)對多房棘球絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、豬帶絳蟲、微口膜殼絳蟲、猬迭宮絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲完成并公布全基因組測序結(jié)果[5,7]，從基因組學(xué)層面，絳蟲的機(jī)制研究對絳蟲疾病的發(fā)展以及人類的健康等具有重要意義。但是關(guān)于絳蟲的免疫逃避、宿主蛋白消化、入侵過程中的分泌蛋白酶等[7,40-41]的作用機(jī)制還待研究。

隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，全基因組分子標(biāo)記的發(fā)展將使從野外采集的寄生蟲中更準(zhǔn)確地估計(jì)種群遺傳和重組參數(shù)，從而更好地研究絳蟲和其他血吸蟲在人類或宿主之間的傳播[16, 42]。一些棘球絳蟲中，進(jìn)化枝特異性肌醇-五磷酸鹽2-激酶(IP2K)在細(xì)胞外壁中產(chǎn)生肌醇六磷酸鹽沉積物，保護(hù)幼蟲的絳蟲蚴[43]，同時(shí)沉積物增加了吸附宿主蛋白的表面積，促進(jìn)與宿主的相互作用增加了吸附宿主蛋白的表面積[44]。在蠕蟲中，可以觀察到四肽家族的擴(kuò)展，四肽家族是宿主體內(nèi)蠕蟲釋放囊泡的一部分，免疫原性較高[45]。絳蟲中包含2個(gè)具有三磷酸腺苷雙磷酸酶結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增家族，這2個(gè)家族可能參與從受損宿主組織中水解ATP[46]。同時(shí)絳蟲的表面糖蛋白可能與天然免疫細(xì)胞上的凝集素受體以抑制方式相互作用[45, 47]，通過修飾直接暴露于免疫系統(tǒng)的寄生蟲表面分子來逃避或轉(zhuǎn)移宿主免疫。加拿大棘球絳蟲的基因測序和注釋好的完成，證明加拿大棘球絳蟲(G7)的基因組與其他的棘球絳蟲基因組是高度同源，這些基因和蛋白質(zhì)可能成為開發(fā)新的治療干預(yù)措施或新的生物藥物成分的潛在藥物靶點(diǎn)[4,6]?；谏鲜鰧{蟲基因組學(xué)的研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)絳蟲感染的標(biāo)志物，為絳蟲病的診斷提供參考依據(jù)。但是，關(guān)于絳蟲、環(huán)境和宿主三者之間的關(guān)系，基于基因組學(xué)的研究方法需要改革創(chuàng)新。

利益沖突：無