Musca domestica cecropin協(xié)同頭孢曲松鈉抗鼠傷寒沙門氏菌及生物被膜作用研究

曾佳利，桂水清，盧雪梅

沙門氏菌是具有重要意義的人獸共患病原菌之一。對(duì)于人類，沙門氏菌的主要污染源是受污染的食物和水源，沙門氏菌可寄生在人類和動(dòng)物的胃腸道中，其中受威脅最大的是兒童、老年人及免疫缺陷個(gè)體[1]。在我國(guó)，每年由沙門氏菌引起的食物中毒事件占所有食源性中毒事件的比例高達(dá)40%～60%，其中鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonellatyphimurium) 是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一，該菌宿主范圍廣泛，包括人類和動(dòng)物[2-3]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，對(duì)病毒、真菌、原蟲和癌細(xì)胞等均有殺滅作用，且對(duì)革蘭陰性及陽(yáng)性細(xì)菌有著高效廣譜的殺傷力。抗菌肽主要作用機(jī)制大致可分為兩類：膜結(jié)構(gòu)破壞型與非膜結(jié)構(gòu)破壞型[4-9]，并且它們大多數(shù)具有凈正電荷，這種凈電荷與相當(dāng)比例 (高達(dá)30%) 的疏水殘基結(jié)合，是其抗菌活性的基礎(chǔ)[10-12]。抗菌肽由于其特殊的抗菌機(jī)制使菌株不易產(chǎn)生耐藥性，將是一種新型的抗菌藥物。本課題組前期實(shí)驗(yàn)從家蠅幼蟲脂肪體cDNA文庫(kù)中克隆出一種家蠅抗菌肽(Muscadomesticacecropin， MDC)，發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽MDC能夠在體外殺死多種革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌[13-14]，同時(shí)對(duì)多重耐藥大腸桿菌臨床分離株的作用顯著，溶血毒性低[15]。頭孢曲松鈉是第三代頭孢菌素類抗生素，主要抗菌機(jī)制為影響細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成，抗菌譜廣，是臨床上抗菌治療應(yīng)用最廣泛的抗生素類藥物之一[16-17]。但根據(jù)研究表明，頭孢曲松鈉過度使用可導(dǎo)致鼠沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性[18]，所以聯(lián)合用藥不失為一種新選擇。

本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)分別觀察MDC、頭孢曲松鈉及聯(lián)合用藥對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌作用，同時(shí)檢測(cè)MDC與頭孢曲松鈉聯(lián)合用藥對(duì)生物膜活性影響，并初步探討它們之間的協(xié)同抗菌機(jī)制，評(píng)估2種藥聯(lián)用治療鼠傷寒沙門氏菌感染的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株及藥物 鼠傷寒沙門氏菌CMCC5011購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；頭孢曲松鈉1.0 g/瓶購(gòu)自廣東三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；抗菌肽MDC純度97.15%；分子量：4 301.59 Da北京中科亞光生物科技有限公司合成。

1.1.2主要試劑 甲醇、二甲基亞砜購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；無水乙醇、二甲苯購(gòu)自天津市大貿(mào)化學(xué)試劑廠；戊二醛25%溶液購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；TSBg培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；0.5%無菌TTC溶液購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3儀器 MD 2500熒光倒置顯微鏡、DMI 2500顯微鏡，德國(guó)Leica公司；Model 680酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司，721分光光度計(jì)，上海菁華科技有限公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡JSM-6330F、JEM1400透射電鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2方 法

1.2.1MIC和MBC測(cè)定 采用微量肉湯二倍稀釋法分別測(cè)定MDC及頭孢曲松鈉對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)。將100 μL濃度為1×106CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液加入96孔板，然后加入100 μL稀釋好的MDC(2 mg/mL～4 μg/mL)及頭孢曲松鈉(0.25～128)μg/mL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)細(xì)菌18 h后將96孔板取出，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為MIC值。無菌操作下，吸取0.1 mL MIC值對(duì)應(yīng)孔及大于MIC值的4個(gè)孔中的菌液，在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布，在37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌落出現(xiàn)的最大稀釋度對(duì)應(yīng)的藥物濃度值為最低殺菌濃度(MBC)值[20]。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2FIC測(cè)定 根據(jù)頭孢曲松鈉(甲)、MDC(乙)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MIC值和MBC值，將甲乙2種藥依次稀釋至濃度為2×MIC、1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC，共8個(gè)藥物濃度梯度并做好標(biāo)記。加入100 μL的菌液然后按梯度濃度依次加入甲50 μL于對(duì)應(yīng)的孔中，隨后再按梯度濃度差異順序在垂直方向加入同體積的乙，標(biāo)記后37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。第2天取出96孔板，觀察各孔菌液的渾濁程度。棋盤法則計(jì)算聯(lián)合指數(shù) (fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)，根據(jù)FIC指數(shù)=MIC(聯(lián)合用藥組)/MIC(甲組單用)+MIC(聯(lián)合用藥)/MIC(乙組單用)。其中FIC值≤0.5時(shí)，表示甲與乙之間為協(xié)同抑菌作用；當(dāng)FIC值處于0.5

1.2.3MDC和頭孢曲松鈉對(duì)生物被膜的作用 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)中MDC組濃度為2×MIC，1×MIC，0.5×MIC；頭孢曲松鈉組濃度為2×MIC，1×MIC，0.5×MIC；聯(lián)合用藥組包括MDC與頭孢曲松鈉，2種藥物的終濃度均達(dá)到1×MIC，培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，純菌液為陰性對(duì)照組。無菌6孔板每孔放入1張蓋玻片作為生物被膜的載體，加入500 μL菌液，按照分組依次加入藥液37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后棄上清，無菌NS清洗3次，99%甲醇溶液固定，2%的結(jié)晶紫溶液染色5 min，洗去非特異吸附結(jié)晶紫后封片，于顯微鏡下觀察拍攝。

對(duì)生物被膜初始附著的影響，蓋玻片放入96孔板中，每孔加100 μL的菌液，給藥組加入100 μL藥液，TSBg培養(yǎng)基組為空白組，不加藥組為陰性組，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；無菌NS清洗3次，99%甲醇溶液固定，2%的結(jié)晶紫溶液染色5 min，每孔加入33%冰乙酸溶液160 μL，然后置于搖床振搖10 min；結(jié)晶紫完全溶解后，酶標(biāo)儀(570 nm)測(cè)定OD值，每組重復(fù)3次。

采用96孔板測(cè)定MDC和頭孢曲松鈉對(duì)已形成的鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的破壞作用。使用無菌96孔板接種濃度為1×106CFU/mL的菌液，每孔各100 μL；37 ℃培養(yǎng)24 h；棄去孔中的溶液，用NS清洗3次；按照分組依次加入藥液100 μL (每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔) ，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去孔中溶液后按照上述步驟操作酶標(biāo)儀檢測(cè)，每組重復(fù)3次。

1.2.4對(duì)胞外物質(zhì)含量測(cè)定 搖菌管內(nèi)加入5 mL稀釋好的菌液，同時(shí)加入終濃度為128 μg/mL 的MDC和終濃度為1 μg/mL的頭孢曲松鈉，生理鹽水作為對(duì)照組，每組重復(fù)6次。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，EP管中加入1.8 mL菌液，離心20 min后，將沉淀加入蒸餾水重溶，然后加入37%的甲醛，4 ℃放置3 h后轉(zhuǎn)移至室溫，再加入1 mol/L的NaOH溶液在4 ℃放置3 h，離心后留取沉淀待查。采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖的含量，BCA試劑盒法測(cè)定胞外蛋白的含量。

1.2.5熒光染色與流式細(xì)胞術(shù) (Flow cytometry，F(xiàn)CM) 采用PI染液和SYTO 9染液對(duì)生物被膜進(jìn)行熒光染色。將活化的鼠傷寒沙門氏菌菌液濃度稀釋為5×108CFU/mL，以蓋玻片為載體加入菌液培養(yǎng)18 h；加入藥物后37 ℃ 靜置處理1 h；取NS 1 mL，加入SYTO 9 (5 mmol/L) 0.5 μL、PI (7.5 mmol/L) 3.7 μL，混合均勻后加入6孔板中，室溫避光染色15 min，用NS洗去未結(jié)合的熒光染液，熒光防淬滅劑封片，熒光顯微鏡下拍攝。

FCM的基本處理同上，避光染色15 min，將樣品轉(zhuǎn)移至流式管，流式上樣處理。

1.2.6掃描電子顯微鏡 (Scanning electron microscope，SEM) 與透射電子顯微鏡 (Transmission electron microscope，TEM) 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的鼠傷寒沙門氏菌用PBS洗3次，調(diào)整濃度至1.5×108CFU/mL；將菌液加入Eppendorf 管中，再分別加入MDC和頭孢曲松鈉以及MDC和頭孢曲松混合組 (使各管中藥物終濃度為MIC)，對(duì)照組加入等量的PBS；給藥60 min后，離心收集菌體，在2.5%戊二醛中避光固定，PBS洗3次后制成菌懸液；依次用30%、50%、5%和95%乙醇脫水，每次10 min，無水乙醇重復(fù)脫水2次，每次10 min；將樣品放入二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器內(nèi)，干燥后的標(biāo)本放入高真空蒸發(fā)器內(nèi)，噴金鍍膜，掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察拍攝。

細(xì)菌培養(yǎng)和樣本制備同SEM，藥物作用60 min后，用2.5%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 M PBS (pH 7.2) 在4℃固定2 d；0.1 M PBS (pH 7.2) 漂洗3次，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀4℃固定1.5 h，0.1 mol/L PBS (pH 7.2) 漂洗3次，將樣品脫水，制樣后切片采用乙酸鈾-檸檬酸進(jìn)行染色。保存樣品，于TEM下拍攝。

1.2.7數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Graphpad Prism 5 軟件進(jìn)行分析繪圖，采用方差分析(ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1MDC和頭孢曲松鈉抗菌結(jié)果與FIC值 MDC對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MIC為128 μg/mL，MBC為256 μg/mL；頭孢曲松鈉對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MIC為1 μg/mL，MBC為4 μg/mL，表1為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。MDC和頭孢曲松鈉聯(lián)用后FIC指數(shù)為0.218，F(xiàn)IC<0.5說明MDC與頭孢曲松鈉有較強(qiáng)的協(xié)同作用，這與預(yù)期結(jié)果相一致。其中，聯(lián)合用藥時(shí)MDC的MIC值是自身單用的1/4，頭孢曲松的MIC值是其單用時(shí)的1/32。

2.2MDC和頭孢曲松鈉對(duì)生物被膜作用 藥物對(duì)生物被膜的形成影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示：MDC組和頭孢曲松鈉組梯度MIC倍數(shù)的藥物濃度對(duì)其生物被膜形成能力的影響力也呈相應(yīng)梯度，且相較于空白對(duì)照組也具有一定的抑制作用。在同MIC倍數(shù)濃度中，MDC和頭孢曲松鈉聯(lián)合用藥組對(duì)生物被膜形成能力的抑制作用最強(qiáng)，結(jié)果顯示MDC和頭孢曲松鈉能協(xié)同抑制鼠傷寒沙門氏菌所形成的生物被膜。

表1 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌MIC、MBC和FIC的測(cè)定

A為空白對(duì)照組；B為1/2×MIC組；C為1×MIC組；D為2×MIC組。1為MDC組；2為頭孢曲松鈉組；3為聯(lián)合用藥組。

如圖2所示，可知MDC和頭孢曲松鈉在所有濃度下均能一定程度上抑制初始生物被膜的附著，且抑制效果與藥物濃度成正相關(guān)。在同比MIC倍數(shù)下，頭孢曲松鈉組效果更好。MDC和頭孢曲松鈉聯(lián)合用藥組對(duì)生物被膜附著的抑制作用最強(qiáng)。對(duì)成熟生物被膜的破壞作用結(jié)果如圖3所示，MDC和頭孢曲松鈉在低濃度劑量(0.5×MIC)下對(duì)成熟生物被膜的破壞作用微弱，當(dāng)藥物濃度升高后具有一定的破壞作用，高劑量(2×MIC)下效果明顯增強(qiáng)，聯(lián)合用藥組的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組。

注：①與空白對(duì)照組相比，P<0.001

2.3生物被膜胞外物質(zhì)含量測(cè)定 胞外物質(zhì)含量如圖4所示，MDC組、頭孢曲松鈉組和聯(lián)合用藥組胞外多糖濃度均小于對(duì)照組，說明3組均對(duì)胞外多糖的產(chǎn)生具有一定抑制作用。MDC組蛋白含量過高，可能與細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白外泄有關(guān)，頭孢曲松鈉組蛋白含量相較于對(duì)照組有明顯的減少，聯(lián)合用藥組雖然蛋白含量高于空白對(duì)照組，但總體低于MDC。

注：①與空白對(duì)照組相比，P<0.05; ②與空白對(duì)照組相比，P<0.001

2.4熒光染色和流式細(xì)胞術(shù) 圖5為鼠傷寒沙門氏菌熒光染色，SYTO 9能與細(xì)菌內(nèi)的DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，PI具有更強(qiáng)的與DNA結(jié)合能力，但PI不能對(duì)結(jié)構(gòu)完整的細(xì)菌染色，只有細(xì)菌死亡后才能被染成紅色。被SYTO 9染色的活菌呈綠色熒光，紅色熒光為被PI染色的死菌，SYTO 9和PI標(biāo)記熒光可以反映細(xì)菌的死亡率和細(xì)菌的存活狀態(tài)。圖中陰性對(duì)照組呈均勻綠色熒光，而MDC組和頭孢曲松鈉組細(xì)菌有不同程度死亡，聯(lián)合用藥組死亡的細(xì)菌數(shù)目遠(yuǎn)大于單獨(dú)用藥組，這進(jìn)一步證明MDC和頭孢曲松鈉在抑菌殺菌過程中存在一定協(xié)同作用。流式結(jié)果如圖6所示，用PI染色后M2區(qū)域表示細(xì)胞膜破壞數(shù)量，MDC組和頭孢曲松鈉組均有一部分細(xì)胞膜被破壞，兩藥同濃度下MDC對(duì)細(xì)胞膜破壞率達(dá)47%，頭孢曲松鈉為30%對(duì)細(xì)胞膜破壞作用低于MDC，兩藥聯(lián)合后細(xì)胞膜破壞率達(dá)89%，死亡細(xì)菌的數(shù)量顯著上升。

2.5SEM觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)變化 掃描電鏡結(jié)果如圖7所示，對(duì)照組細(xì)菌整體結(jié)構(gòu)完整。MDC組整體結(jié)構(gòu)明顯破壞，細(xì)胞膜出現(xiàn)一定的損傷，有部分內(nèi)容物溢出形成絮狀。頭孢曲松鈉組出現(xiàn)菌體斷裂，個(gè)別菌株嚴(yán)重變形，出現(xiàn)縊痕，具有凹陷結(jié)構(gòu)。聯(lián)用組不僅出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)容物外泄，同時(shí)損壞程度相較于單獨(dú)用藥組明顯增強(qiáng)。

2.6TEM觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 圖8中可看出對(duì)照組中的鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻。MDC組中的細(xì)菌發(fā)生菌體變形，大部分的胞內(nèi)物質(zhì)外泄，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空腔。頭孢曲松鈉組中出現(xiàn)菌體變形嚴(yán)重，表面粗糙，界限模糊，具有凹陷結(jié)構(gòu)。聯(lián)用組不僅出現(xiàn)細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間隙增寬，同時(shí)胞內(nèi)物質(zhì)降解，呈現(xiàn)亂絮狀，只剩下細(xì)胞壁的空腔，且細(xì)胞壁疏松，外層模糊，損壞程度也明顯強(qiáng)于MDC與頭孢曲松鈉組。

A為對(duì)照組，B為 MDC組，C為頭孢曲松鈉組，D為聯(lián)用組，1為SYTO 9染色，2為PI染色，3為 merge

A為空白對(duì)照組，B為MDC組，C為頭孢曲松鈉組，D為聯(lián)用組

A為空白對(duì)照組，B為MDC組，C為頭孢曲松鈉組，D為聯(lián)用組

A為空白對(duì)照組，B為MDC組，C為頭孢曲松鈉組，D為聯(lián)用組

3 討 論

沙門菌病是危害嚴(yán)重的人獸共患病之一，在抗生素類藥物濫用的大環(huán)境下，頭孢曲松鈉單獨(dú)使用容易導(dǎo)致沙門氏菌耐藥株的產(chǎn)生。家蠅抗菌肽(MDC)屬于抗菌肽的一種，擁有特殊的抗菌機(jī)制，不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，使其具有良好的應(yīng)用前景。從機(jī)制上看，頭孢曲松鈉其主要抗菌機(jī)制為影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，MDC則主要作用于細(xì)胞膜，二者聯(lián)用具有可行性，這為聯(lián)合用藥抗鼠傷寒沙門氏菌開辟一條新途徑。

細(xì)菌生物被膜是粘附于非生物或生物表面的微生物細(xì)胞菌落, 并由細(xì)胞外多聚基質(zhì)包裹[22]。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性除了與耐藥菌株的大量產(chǎn)生有關(guān)，亦同細(xì)菌在體內(nèi)形成的生物被膜相關(guān)，生物被膜被公認(rèn)是造成包括抗生素治療在內(nèi)的多種疾病治療手段失敗的重要原因[23]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)生物被膜能對(duì)抗機(jī)體的免疫防御機(jī)制，不利于抗感染治療[24]，以抗菌肽為代表的肽類抗菌物質(zhì)是治療生物被膜的重要途徑，能治療野生型和多藥抗性生物被膜并防止致命的銅綠假單胞菌感染。在銅綠假單胞菌生物被膜感染的無脊髓生物模型中，抗菌肽與抗生素聯(lián)合應(yīng)用明顯增強(qiáng)了殺菌效果[25]。生物被膜的附著是細(xì)菌形成生物被膜的第一個(gè)步驟，同樣也是生物被膜形成最關(guān)鍵的一步。給藥后，結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示兩種藥單獨(dú)用藥都能對(duì)生物被膜的初始附著與形成產(chǎn)生抑制作用，并且能破壞成熟生物被膜，兩藥聯(lián)用后以上效果更為顯著，能有效降低細(xì)菌的耐藥性。生物被膜胞外物質(zhì)含量的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，頭孢曲松鈉組中鼠沙門氏菌的胞外多糖含量最低，這或許與頭孢曲松鈉的抗菌機(jī)制有關(guān)，頭孢曲松鈉對(duì)細(xì)菌胞外多糖分泌的抑制作用需要進(jìn)一步研究。有報(bào)道稱抗菌肽能在細(xì)胞膜上形成環(huán)孔，致使胞內(nèi)容物大量外泄[26]。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果顯示MDC能損傷菌體細(xì)胞膜和結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌內(nèi)容物溢出，出現(xiàn)空腔；而頭孢曲松鈉會(huì)破壞菌體細(xì)胞壁，使其變形斷裂。兩藥聯(lián)用后則會(huì)更大程度的破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

綜上所述，家蠅抗菌肽MDC和頭孢曲松鈉能協(xié)同抑制鼠傷寒沙門氏菌及初始生物膜，破壞成熟生物膜。MDC主要作用于細(xì)胞膜致使內(nèi)容物泄露，頭孢曲松鈉破壞細(xì)胞壁使細(xì)菌菌體斷裂，兩藥聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同作用，增強(qiáng)抗菌和抗生物膜活性，二者機(jī)制形成互補(bǔ)，相輔相成。

利益沖突：無