miR-182、miR-23a-3p聯(lián)合cTnI、CK-MB、Myo在急性心肌梗死早期診斷中的應用價值

王述蓮，李鵬宇，孫 鈞，鄭繼偉，李綿洋，王成彬，郭志強

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于長時間嚴重心肌缺血引起部分心肌急性壞死，具有較高的病死率，胸骨劇烈疼痛是主要臨床表現(xiàn)，檢測顯示血清心肌酶升高，循環(huán)功能障礙等變化[1]。AMI發(fā)病急、早期診斷困難是導致病人死亡率較高的主要原因，因此，早期準確診斷對及時救治病人具有重要的臨床意義。目前主要根據(jù)病人臨床表現(xiàn)、心電圖、實驗室檢測AMI標志物進行診斷，實驗室檢測結(jié)果反映病人病情。血清心肌酶是判斷心肌梗死的標志物之一，但單一血清心肌酶檢測特異性不高[2]。肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌紅蛋白(Myo)等指標聯(lián)合檢測可提高AMI早期診斷率[3-4]。相關研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNAs)在不同疾病中表達不同，具有一定的組織和細胞特異性，心肌梗死后檢測到miRNAs發(fā)生變化，可作為心肌損傷的標志物[5-6]。本研究探討miR-182、miR-23a-3p聯(lián)合cTnI、CK-MB、Myo在AMI早期診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月—2018年12月武警北京市總隊醫(yī)院治療的AMI病人80例作為AMI組，其中男45例，女35例，年齡34～68(59.29±15.38)歲。納入標準：符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]標準診斷(具有以下至少一項臨床指標：如典型胸痛、缺血癥狀、心電圖病理性Q波形成、新發(fā)缺血性心電圖改變；血清肌酸激酶發(fā)病后6 h內(nèi)升高，24 h 達到高峰，4～72 h消失)；年齡30～70歲；病人于發(fā)病后2 h內(nèi)入院。排除標準：伴有心力衰竭、心瓣膜疾病病人；肺部疾病病人；血液系統(tǒng)疾病、急性腦血管疾病、感染性疾病。另選擇同期在醫(yī)院進行體檢的健康體檢者40名作為對照組，其中男28名，女12名，年齡40～69(57.43±15.06)歲。兩組研究對象性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究對象均簽署知情同意書，且本研究獲得醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法 對照組體檢時采集空腹靜脈血3 mL；AMI組發(fā)病后1～2 h、2～4 h、4～8 h、8～12 h分別采集空腹靜脈血3 mL，即時分離血清，-70 ℃保存待測。采用膠體金免疫層析法，使用CK-MB、cTnI、Myo三聯(lián)檢測試劑盒(基蛋生物科技股份有限公司，批號20050035)及FIA8000免疫定量分析儀檢測血cTnI、Myo、CK-MB含量。采用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測miR-182、miR23a-3p，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR儀器上進行擴增，miR-23a引物序列：正向引物5′-ATCACATTGCCAGGGATTTCC-3′，反向引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，miR-182引物序列：正向引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，反向引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反應條件為94 ℃，30 s；55℃，60 s；72 ℃，45 s；進行35個循環(huán)，結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中對比分析，計算相對定量。

1.3 判定標準 cTnI正常參考值為0～0.5 μg/L，CK-MB正常參考值為0～25 U/L，Myo正常參考值為0～80 μg/L，若檢測數(shù)值高于正常參考值判斷為陽性。計算cTnI、CK-MB、Myo特異度和靈敏度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo表達水平 AMI組miR-182、miR-23a-3p表達發(fā)病后1～2 h開始降低，8～12 h達到最低，且均低于對照組(P<0.05)。AMI組cTnI發(fā)病后1～2 h增加，8～12 h達峰值，不同時間均高于對照組(P<0.05)。AMI組CK-MB發(fā)病后1～2 h增加，4～8 h到達最高值，8～12 h開始回落，不同時間均高于對照組(P<0.05)。Myo發(fā)病后1～2 h達最大值，其他時間逐漸降低，AMI組不同時間均高于對照組(P<0.05)。詳見表1。對發(fā)病后1～2 h血清miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo表達進行Pearson相關性分析，結(jié)果顯示：miR-182、miR-23a-3p與cTnI呈負相關(P<0.001)，與CK-MB不相關，與Myo呈正相關(P<0.001)。詳見表2。

表1 兩組不同時間血清miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo表達水平比較

表2 AMI組發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p與cTnI、CK-MB、Myo的Pearson相關性分析

2.2 AMI組miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo陽性檢出率 AMI組不同時間miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo陽性檢出率均高于對照組(P<0.05)；發(fā)病后8～12 h，AMI組miR-182、miR-23a-3p、cTnI檢出率最高，發(fā)病后4～8 h CK-MB、Myo陽性檢出率最高。詳見表3。

表3 AMI組miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo陽性檢出率 單位：例(%)

2.3 AMI病人發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo靈敏度和特異度 AMI病人發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p、cTnI靈敏度均高于80%，其中miR-23-3p靈敏度最高，為92.5%；miR-182、miR-23a-3p、cTnI特異度均高于80%，cTnI特異度最高為87.5%。CK-MB、Myo靈敏度和特異度均較低。詳見表4。

表4 AMI病人發(fā)病后1～2 h miR-182、miR-23a-3p、cTnI、CK-MB、Myo靈敏度和特異度

2.4 AMI病人發(fā)病后1～2 h聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度 miR-182、miR-23a-3p聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度分別為90.0%和85.0%，cTnI、CK-MB、Myo聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度分別為88.8%和82.5%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 AMI病人發(fā)病后1～2 h聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度

3 討 論

AMI死亡率高是由于早期不能做到及時準確診斷，從而延誤了有效的治療時機。傳統(tǒng)的檢測指標如心肌酶譜靈敏度和特異度較低，為37%～49%，易造成誤診漏診，延誤治療時間造成嚴重后果[8-9]。因此，進行心臟損傷標志物的臨床診斷研究，尋找具有較高靈敏度和特異度的指標對臨床檢測至關重要，為了避免單一標志物診斷不足，采用多種指標聯(lián)合檢測方法。AMI病理機制之一是冠狀動脈粥樣硬化導致血管堵塞、脂質(zhì)積累、內(nèi)皮損傷、動脈粥樣硬化斑塊及引發(fā)的炎癥反應導致心肌細胞凋亡[10]。心肌細胞非正常凋亡是造成心肌梗死的主要原因，因此，減少細胞凋亡、誘導心肌細胞存活是治療AMI的主要方法[11]。

miRNA是小分子非編碼RNA，長約20個核苷酸，通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)靶基因表達，對細胞、組織和器官功能發(fā)揮重要的調(diào)控作用，以調(diào)控細胞增殖和凋亡[12]。miRNA在細胞活動中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，有研究顯示，AMI早期缺血性壞死心肌細胞釋放多種miRNA，從而導致血漿miRNA表達譜改變。通過檢測血漿心肌特異性miRNA鑒別AMI，從而為AMI早期診斷提供依據(jù)[13-14]。有研究顯示，高表達miR-182通過調(diào)控p53實現(xiàn)促進AMI細胞凋亡，miR-182表達下調(diào)有利于減少心肌細胞凋亡活動，這可能是由于機體的自我調(diào)節(jié)[15]。聶宇等[16]研究顯示，miR-23a-3p與心肌細胞生長密切相關，在新生大鼠心肌細胞肥大過程中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，miR-182和miR-23a-3p發(fā)生心肌梗死1～2 h均降低，2～4 h、4～8 h、8～12 h均顯著低于對照組，提示這兩種指標在心肌梗死發(fā)展中發(fā)揮作用。miR-182和miR-23a-3p與cTnI、Myo均有相關性，與CK-MB無相關性，分析原因是CK-MB表達隨著時間變化先升高后降低。AMI組不同時間miR-182和miR-23a-3p陽性檢出率均高于對照組，且特異度和靈敏度均較高，提示二者可作為檢測指標。

cTnI對心肌損傷具有較高的靈敏度和特異度，是心肌特有的調(diào)節(jié)蛋白，cTnI特異性良好，具有較寬的時間窗，少量心肌細胞死亡導致血清濃度明顯升高，是臨床確診心肌損傷的標志物[17-18]。CK-MB主要存在于心肌骨骼肌和腎細胞，是重要的能量調(diào)節(jié)酶，CK-MB濃度與心肌梗死關系密切，可反映心肌梗死面積大小[19]。有研究顯示，心肌細胞受損或凋亡后釋放大量CK-MB進入血液，4～5 h后超過正常值，12～24 h到達峰值，48～72 h恢復正常水平[20]。CK-MB是重要的心肌酶譜之一，通常與其他指標聯(lián)合檢測。Myo主要存在于心肌和骨骼肌，心肌梗死早期Myo濃度最早出現(xiàn)升高，心肌損傷后2 h可在血液檢測到，是AMI早期檢測的典型標志物，由于骨骼肌損傷可能影響檢測結(jié)果，特異性較差[21-22]。本研究中血清cTnI、CK-MB、Myo不同時間表達均呈高表達，具有較高的陽性率、特異度和靈敏度。同時，miR-182和miR-23a-3p在AMI發(fā)病1～2 h檢測表達值降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，且特異度和靈敏度較高，二者聯(lián)合檢測靈敏度為90.0%，特異度為85.0%均高于cTnI、CK-MB、Myo三者聯(lián)合診斷，miR-182和miR-23a-3p兩者聯(lián)合檢測與cTnI、CK-MB、Myo三者聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明miR-182和miR-23a-3p聯(lián)合檢測具有診斷AMI的有效性，可作為補充的檢測手段。

綜上所述，miR-182、miR-23a-3p可作為AMI早期檢測新型標志物，聯(lián)合cTnI、CK-MB、Myo有利于提高急性心肌梗死早期診斷的準確度。