骨肉瘤診療相關(guān)生物標(biāo)記物研究進(jìn)展

鄭來(lái) 韓旭 李宏倬

【摘要】 全世界青少年和兒童都受到骨肉瘤的威脅，這種腫瘤主要好發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端，是該年齡段最常見(jiàn)的高度惡性骨腫瘤。早期腫瘤檢測(cè)是有效治療該疾病的關(guān)鍵，生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和對(duì)分子及其復(fù)雜相互作用的不斷認(rèn)識(shí)改善了骨肉瘤臨床試驗(yàn)結(jié)果。本文簡(jiǎn)述了骨肉瘤的生物標(biāo)志物，并重點(diǎn)介紹了骨肉瘤相關(guān)生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展，以期對(duì)骨肉瘤臨床治療的進(jìn)展產(chǎn)生積極影響。

【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤 化療 治療 惡性骨腫瘤 生物標(biāo)志物

Research Progress of Biomarkers Related to Diagnosis and Treatment of Osteosarcoma/ZHENG Lai， HAN Xu， LI Hongzhuo. //Medical Innovation of China， 2021， 18（27）： -172

[Abstract] Adolescents and children all over the world are threatened by osteosarcoma， this tumor mainly occurs in the epiphysis of the long shaft， it is the most common highly malignant bone tumor in this age group. Early tumor detection is the key to the effective treatment of this disease. The discovery of biomarkers and the continuous understanding of molecules and their complex interactions have improved the results of clinical trials of osteosarcoma. This paper briefly describes the biomarkers of osteosarcoma， and focuses on the research progress of osteosarcoma related biomarkers， in order to have a positive impact on the progress of clinical treatment of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma Chemotherapy Treatment Malignant bone tumor Biomarkers

First-author’s address： Graduate School of Changzhi Medical College， Changzhi 046000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.27.042

骨肉瘤是于1807年在“波耶爾講座”首次提出的一種骨骼疾病。好發(fā)于20歲以下的兒童和青少年，男性發(fā)病率高于女性，每百萬(wàn)人約有8.7人患有骨肉瘤，是該年齡組中最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤[1]。骨肉瘤多發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端（股骨遠(yuǎn)端43%，脛骨近端23%，肱骨近端10%）[2]，因此其主要癥狀包括患處腫脹、關(guān)節(jié)疼痛及活動(dòng)受限。病理檢查可提供明確的診斷及腫瘤分級(jí)信息。骨肉瘤大多數(shù)早期發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，與肺轉(zhuǎn)移患者相比，未轉(zhuǎn)移患者五年生存率更高。新輔助化療以及手術(shù)切除已經(jīng)將此類患者5年生存率由1970年之前的10%提高到50%～70%。骨肉瘤的異質(zhì)性是影響治療效果的主要原因。生物標(biāo)記物可用于診斷骨肉瘤患者，特別是骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，生物標(biāo)記物可能是早期診斷骨肉瘤以及確定潛在治療靶點(diǎn)的有效途徑。因此，本文針對(duì)這一方向綜述了骨肉瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型及組織學(xué)標(biāo)本中生物標(biāo)記物的研究。

1 MicroRNA

MicroRNA或miRNA是高度保守、內(nèi)源性、受到嚴(yán)格調(diào)控的非編碼小RNA（18～25個(gè)核苷酸），通過(guò)直接降解或抑制翻譯來(lái)靶向抑制mRNA轉(zhuǎn)錄。其主要在細(xì)胞凋亡、分化以及細(xì)胞周期等多項(xiàng)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用，其表達(dá)受到表觀遺傳學(xué)（如DNA甲基化、組蛋白去乙?；捌渌D(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制）的嚴(yán)格調(diào)控。

miRNA可抑制癌基因或抑癌基因的表達(dá)，而這些基因在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。以骨肉瘤為例，多個(gè)研究報(bào)道了不同miRNA在細(xì)胞系或樣本中的表達(dá)譜[3]，例如miR-195、miR-99、miR-181及miR-148a在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，而其他如miR-539、miR-145及miR-335在MG-63人類骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。

Cai等[4]進(jìn)行了一項(xiàng)關(guān)于miRNA作為骨腫瘤標(biāo)志物作用的研究，他們通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清中的miR-195水平低于正常對(duì)照組，表明miRNA具有作為骨肉瘤標(biāo)志物的潛在可能，其可有效用于骨肉瘤的篩查與監(jiān)測(cè)。Zhou等[5]進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，血清miR-199a-5p在骨肉瘤樣本中濃度較高。Ouyang等[6]測(cè)量了6個(gè)miRNA（miR-21、miR-199a-3p、miR-143、miR-34、miR-140和miR-132）的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-21在骨肉瘤患者中表達(dá)水平較高，而miR-199a-3p和miR-143在骨肉瘤患者中表達(dá)水平較低。

2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌的小蛋白質(zhì)，其是宿主對(duì)創(chuàng)傷、感染和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子。血漿中促炎細(xì)胞因子的異常升高與肥胖、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥有關(guān)。多項(xiàng)研究表明與健康對(duì)照相比，骨肉瘤患者的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）水平升高[7]。Tu等[8]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞刺激間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）產(chǎn)生促腫瘤細(xì)胞因子的分泌，他們通過(guò)Saos-2和U2骨肉瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)基刺激了MSCs中IL-6和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的產(chǎn)生，而TGF-β抗體可以中和這種作用。目前，抑制TGF-β的藥物也已用于臨床前研究和臨床試驗(yàn)。而VEGF也被觀察到在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種類型的癌癥中上調(diào)，其參與骨肉瘤的血管生成，已被用作骨肉瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。此外，VEGF的表達(dá)也與總生存率和無(wú)病生存率有關(guān)，VEGF表達(dá)高的患者無(wú)病生存率及總體生存率較低，這表明VEGF可能作為骨肉瘤預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。

Zhu等[9]研究了骨肉瘤患者細(xì)胞因子水平，他們發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中包括ILS-6、TGF-β、生長(zhǎng)相關(guān)癌基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、趨化因子配體16、內(nèi)切蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA在內(nèi)的21種細(xì)胞因子上調(diào)，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)得到證實(shí)，其中已知間充質(zhì)干細(xì)胞分泌ILS-6可以促進(jìn)骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移[10]。在另一項(xiàng)研究中，通過(guò)對(duì)骨肉瘤患者血清的免疫測(cè)定，發(fā)現(xiàn)β-異構(gòu)化C端末端肽（β-CTx）和總1型前膠原氨基末端肽（tP1NP）顯著升高。因此認(rèn)為，這些蛋白質(zhì)可以作為骨肉瘤生物標(biāo)志物[11]。

TIM3表達(dá)異常與多種癌癥有關(guān)，其屬含有T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域的分子（TIM）家族，并由包括T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞表達(dá)。Shang等[12]發(fā)現(xiàn)TIM3也在人類骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)。此外，TIM3還被發(fā)現(xiàn)與已在骨肉瘤患者中檢測(cè)到的Slug、Snail和Smad共表達(dá)。因此，TIM3有望作為診斷和治療骨肉瘤的工具。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌，參與包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解和重構(gòu)、形態(tài)形成、創(chuàng)面愈合、組織修復(fù)和重塑等多種生理和病理過(guò)程。此外，MMPs通過(guò)激活細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一項(xiàng)研究表明在亞洲和非亞洲人群中，MMP-9的表達(dá)與骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著相關(guān)性[13]。

半乳糖凝集素是凝集素家族的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，其與細(xì)胞遷移，凋亡和分化等細(xì)胞過(guò)程有關(guān)。在這個(gè)家族的成員中，半乳糖凝集素1和3與胰腺癌、乳腺癌和胃癌以及骨肉瘤等癌癥有關(guān)。Zhou等[14]的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者的血清半乳糖凝集素3水平高于正常對(duì)照組，并且在癌癥晚期該蛋白水平越來(lái)越高。類似地，Lei等[15]的研究中發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素3在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，敲除半乳糖凝集素3可抑制骨肉瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。Park等[16]報(bào)告了類似的結(jié)果，他們證實(shí)半乳糖凝集素3的沉默導(dǎo)致骨肉瘤遷移和侵襲減少，這與侵襲介質(zhì)（如Lyn、β-連環(huán)蛋白和Src）的表達(dá)減少有關(guān)。與半乳糖凝素3相似，通過(guò)敲除絲裂原活化蛋白激酶途徑中的半乳糖凝集素1，可抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲特性。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了半乳糖凝集素1和3作為骨肉瘤生物標(biāo)志物的作用，并且其表達(dá)水平可能與疾病的進(jìn)展相關(guān)。

3 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）可催化糖酵解途徑中丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化，是包括骨肉瘤在內(nèi)的多種癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物。Chen等[17]的研究表明，血清高LDH水平與骨肉瘤患者總生存率較低有關(guān)。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶B亞基（LDHB）在胚胎干細(xì)胞系中高度表達(dá)。相反，敲除LDHB導(dǎo)致這些細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲減少。與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者相比，在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或晚期的骨肉瘤患者骨組織中檢測(cè)到更高水平的LDHB基因。這些結(jié)果表明，LDHB有可能作為骨肉瘤的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。

4 Ezrin蛋白

Ezrin屬于（ezrin/radixin/moesin，ERM）蛋白家族，起連接質(zhì)膜和細(xì)胞骨架的作用，在組織細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)黏附、遷移中起重要作用。多項(xiàng)研究表明Ezrin的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。在骨肉瘤中，Ezrin的表達(dá)與肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制Ezrin可減少肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Park等[19]的研究發(fā)現(xiàn)所有低分化腫瘤患者都存在Ezrin高表達(dá)。Li等[20]分析發(fā)現(xiàn)Ezrin的表達(dá)與骨肉瘤的復(fù)發(fā)和存活率低相關(guān)。表明Ezrin可能是骨肉瘤患者預(yù)后的有效標(biāo)志。

5 其他蛋白標(biāo)記

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1（APE1）是另一種可能用于預(yù)后的生物標(biāo)志物，參與DNA堿基切除修復(fù)途徑，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期中起作用，并調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子（如HIF、NF-κB和p53）的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)APE1的高表達(dá)與骨肉瘤患者生存期的縮短相關(guān)。

缺氧也可導(dǎo)致環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達(dá)的激活。已有研究表明COX-2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了骨肉瘤的發(fā)生。此外，COX-2的表達(dá)與骨肉瘤患者的疾病特異性生存率呈負(fù)相關(guān)。COX-2抑制劑塞來(lái)昔布可以抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡，這進(jìn)一步證實(shí)了COX-2在骨肉瘤中的作用。一項(xiàng)Meta分析收集了來(lái)自14項(xiàng)研究的765例患者，分析了COX-2與腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期和3年總生存率之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及臨床晚期相關(guān)，提示COX-2可能是骨肉瘤的備選生物標(biāo)志物[21]。Chen等[22]的一項(xiàng)研究證實(shí)了化療前經(jīng)病理活檢后HIF-1、APE1、VEGF和COX-2蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，并確定其預(yù)后價(jià)值。有研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIF細(xì)胞與COX-2、VEGF和APE1相關(guān)。

Src蛋白也屬于在骨肉瘤發(fā)展和進(jìn)展中有前景的生物標(biāo)志物。骨肉瘤中，Src蛋白通過(guò)多種信號(hào)途徑被激活成為磷酸化Src，在不同的細(xì)胞過(guò)程（如細(xì)胞存活、黏附和遷移）中發(fā)揮重要作用。Hu等[23]研究了Src在骨肉瘤患者中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Src過(guò)度表達(dá)與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，并表明預(yù)后不良。Urciuoli等[24]發(fā)現(xiàn)了Src細(xì)胞定位在確定骨肉瘤預(yù)后中的重要性，強(qiáng)細(xì)胞核染色預(yù)示著預(yù)后良好，而強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)染色與預(yù)后不良相關(guān)。

Skoda等[25]研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog蛋白可以調(diào)節(jié)骨肉瘤的進(jìn)展，并影響骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Lo等[26]研究表明，高水平的Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)與高級(jí)別骨肉瘤的進(jìn)展相關(guān)。關(guān)于Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)的治療潛力也有報(bào)道，例如，Hedgehog/Gli途徑抑制劑可以防止骨肉瘤的生成[27]。因此，抑制Hedgehog途徑可能是治療骨肉瘤的新途徑。

綜上所述，目前許多基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究已經(jīng)報(bào)道了與骨肉瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物?；谶@些研究，各種生物標(biāo)志物可能被用于監(jiān)測(cè)骨肉瘤的進(jìn)展或預(yù)后。然而，目前很少有標(biāo)志物能夠作為疾病早期確診指標(biāo)。要成功地將生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，還需要更多隨機(jī)對(duì)照臨床研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Mirabello L，Troisi R J，Savage S A.Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004[J].Cancer，2009，115（7）：1531-1543.

[2] Bielack S S，Kempf-Bielack B，Delling G，et al.Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk： an analysis of 1，702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols[J].J Clin Oncol，2002，20（12）：2910-2911.

[3] Won K Y，Kim Y W，Kim H S，et al.MicroRNA-199b-5p is involved in the Notch signaling pathway in osteosarcoma[J].Hum Pathol，2013，44（8）：1648-1655.

[4] Cai H，Zhao H，Tang J，et al.Serum miR-195 is a diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma[J].The Journal of Surgical Research，2015，194（2）：505-510.

[5] Zhou G，Lu M，Chen J，et al.Identification of miR-199a-5p in serum as noninvasive biomarkers for detecting and monitoring osteosarcoma[J].Tumour Biol，2015，36（11）：8845-8852.

[6] Ouyang L，Liu P，Yang S，et al.A three-plasma miRNA signature serves as novel biomarkers for osteosarcoma[J].Med Oncol，2013，30（1）：340.

[7] Lamora A，Talbot J，Bougras G，et al.Overexpression of Smad7 Blocks Primary Tumor Growth and Lung Metastasis Development in Osteosarcoma[J].Clin Cancer Res，2014，20（19）：5097-5112.

[8] Tu B，Peng Z X，F(xiàn)an Q M，et al.Osteosarcoma cells promote the production of pro-tumor cytokines in mesenchymal stem cells by inhibiting their osteogenic differentiation through the TGF-β/Smad2/3 pathway[J].Exp Cell Res，2014，320（1）：164-173.

[9] Zhu Z Q，Tang J S，Gang D，et al.Antibody microarray profiling of osteosarcoma cell serum for identifying potential biomarkers[J].Mol Med Rep，2015，12（1）：1157-1162.

[10] Bing T，Du L，F(xiàn)an Q M，et al.STAT3 activation by IL-6 from mesenchymal stem cells promotes the proliferation and metastasis of osteosarcoma[J].Cancer Lett，2012，325（1）：80-88.

[11] Hu T，Yang Q Xu J，et al.Role of β-isomerized C-terminal telopeptides （β-CTx） and total procollagen type 1 amino-terminal propeptide （tP1NP） as osteosarcoma biomarkers[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：890-896.

[12] Shang Y，Li Z，Li H，et al.TIM-3 expression in human osteosarcoma： Correlation with the expression of epithelial-mesenchymal transition-specific biomarkers[J].Oncol Lett，2013，6（2）：490-494.

[13] Li H，Zhang K，Liu L H，et al.A systematic review of matrix metalloproteinase 9 as a biomarker of survival in patients with osteosarcoma[J].Tumor Biology，2014，35（6）：5487-5491.

[14] Zhou X，Jing J，Peng J，et al.Expression and clinical significance of galectin-3 in osteosarcoma[J].Gene，2014，546（2）：403-407.

[15] Lei P，He H，Hu Y，et al.Small interfering RNA-induced silencing of galectin-3 inhibits the malignant phenotypes of osteosarcoma in vitro[J].Mol Med Rep，2015，12（4）：6316-6322.

[16] Park G，Kim D J，Kim Y S，et al.Silencing of galectin-3 represses osteosarcoma cell migration and invasion through inhibition of FAK/Src/Lyn activation and β-catenin expression and increases susceptibility to chemotherapeutic agents[J].Int J Oncol，2015，46（1）：185-194.

[17] Chen J，Sun M X，Hua Y Q，et al.Prognostic significance of serum lactate dehydrogenase level in osteosarcoma： A meta-analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol，2014，140（7）：1205-1210.

[18] Li C，Chen Y，Bai P，et al.LDHB may be a significant predictor of poor prognosis in osteosarcoma[J].Am J Transl Res，2016，8（11）：4831-4843.

[19] Park H R，Cabrini R L，Araujo E S，et al.Expression of Ezrin and Metastatic Tumor Antigen in Osteosarcomas of the Jaw[J].Tumori，2010，95（1）：81-86.

[20] Li H，Min D，Hui Z，et al.The Prognostic Role of Ezrin Immunoexpression in Osteosarcoma： A Meta-Analysis of Published Data[J/OL].PLoS One，2013，8（6）：e64513.

[21] Jiao G，Ren T，Lu Q，et al.Prognostic significance of cyclooxygenase-2 in osteosarcoma： a meta-analysis[J].Tumor Biology，2013，34（5）：2489-2495.

[22] Chen Y，Yang Y，Yuan Z，et al.Predicting chemosensitivity in osteosarcoma prior tochemotherapy： An investigational study of biomarkers with immunohistochemistry[J].Oncol Lett，2012，3（5）：1011-1016.

[23] Hu C，Deng Z，Zhang Y，et al.The Prognostic Significance of Src and p-Src Expression in Patients with Osteosarcoma[J].Med Sci Monit，2015，21：638-645.

[24] Urciuoli E，Coletta I，Rizzuto E，et al.Src nuclear localization and its prognostic relevance in human osteosarcoma[J].J Cell Physiol，2018，233（2）：1658-1670.

[25] Skoda A M，Simovic D，Karin V，et al.The role of the Hedgehog signaling pathway in cancer： A comprehensive review[J].Bosn J Basic Med Sci，2018，18（1）：8-20.

[26] Lo W W，Pinnaduwage D，Gokgoz N，et al.Aberrant Hedgehog Signaling and Clinical Outcome in Osteosarcoma[J].Sarcoma，2014，2014：261804.

[27] Yao Z，Han L，Chen Y，et al.Hedgehog signalling in the tumourigenesis and metastasis of osteosarcoma， and its potential value in the clinical therapy of osteosarcoma[J].Cell Death Dis，2018，9（6）：701.

（收稿日期：2021-01-07） （本文編輯：姬思雨）