基于ARMS-TaqMan的EGFR基因E21突變檢測

金秀妍，宋巖巖，于源華

(長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022)

0 引 言

EGFR基因的主要作用是將細(xì)胞外的信號傳入細(xì)胞內(nèi)部，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化過程。EGFR 基因突變可能導(dǎo)致 EGFR 蛋白的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、分化和血管新生，還能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[1]。EGFR 基因突變主要發(fā)生在外顯子 18、 19、 20 和 21 上[2]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中有多種EGFR 基因突變。針對常用靶向藥物阿法替尼和達(dá)克替尼而言[3]，可將EGFR基因突變分為兩大部分，即敏感性增強(qiáng)突變和耐藥突變。其中敏感性增強(qiáng)突變有19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的L858R點突變，而20號外顯子上的T790M突變?yōu)槟退幫蛔僛4]。采用個性化靶向藥物治療非小細(xì)胞肺癌時，僅對EGFR基因敏感性增強(qiáng)的突變患者效果明顯，而其它耐藥突變患者完全無效。因此對患者基因突變情況進(jìn)行了解，特別是確定是否存在EGFR基因敏感性增強(qiáng)的突變，能否采用上述靶向藥物是進(jìn)行治療的關(guān)鍵[5-6]。

常用的EGFR基因突變檢測方法有DNA測序法、突變體富集PCR法(mutant-enriched PCR)、TaqMan探針法和DNA等溫擴(kuò)增技術(shù)[7-11]。上述方法都能對EGFR的基因突變做出檢測，但各有優(yōu)缺點。如DNA 測序法有檢測精度高的優(yōu)點，但也存在對樣本要求高和測序周期長等缺點，限制了在臨床上的應(yīng)用[12]。

近年來，也有EGFR基因突變檢測試劑盒問世，如Scorpions ARMS EGFR基因突變檢測試劑盒等。但這類試劑盒由其檢測方法決定檢測費用相對昂貴。TaqMan 探針法因其具有優(yōu)異的特異性和靈敏度，與其它方法結(jié)合可以有效、快速地檢測基因突變，引起廣泛關(guān)注。研究擬采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)(Andmplification Refractory Mutation System, ARMS) 技術(shù)和TaqMan熒光探針技術(shù)相結(jié)合，檢測EGFR基因外顯子 21點突變，為開發(fā)新型廉價EGFR基因的檢測方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 技術(shù)原理

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針。熒光基團(tuán)連接在探針的5′末端，淬滅劑連在3′末端。當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，可觀察到熒光。ARMS引物的3′末端設(shè)計在突變位點，最后一個堿基與突變的堿基配對，只有引物3′末端完全配對時，才能正常擴(kuò)增。當(dāng)引物3′末端發(fā)生錯配時，不能有效地擴(kuò)增。ARMS引物特異性擴(kuò)增突變位點，TaqMan探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，兩個技術(shù)相結(jié)合達(dá)到診斷的目的。

傳統(tǒng)TaqMan探針法需要針對每一個突變位點設(shè)計一對特異性探針，與通用引物共同進(jìn)行檢測。而該原理檢測位置相近的突變位點僅需要一條探針，通過引物的改變檢測不同位點，可以大大降低檢測成本。

1.2 樣品與標(biāo)本

方法構(gòu)建實驗所用109例非小細(xì)胞肺癌患者組織切片和組織蠟塊，以及與市售試劑盒對比實驗用36例非小細(xì)胞肺癌患者組織切片和組織蠟塊均由上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司提供。HepG2人體肝癌細(xì)胞、LoVo人結(jié)腸癌細(xì)胞、胎盤細(xì)胞和大腸桿菌為研究組實驗室原有保存。

1.3 試劑與儀器

DP304血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒(北京天根)，DP209普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒(北京天根)。 KT201 2×Taq PCR Master Mix酶(北京天根)，AceTaq○RDNA Polymerase(南京Vazyme)；dNTPs(南京Vazyme)，5X buffer(南京Vazyme)，探針由上海生工合成，引物由長春庫美合成，5810R型冷凍離心機(jī)(Eppendorf)； 凝膠成像系統(tǒng)(GeneSys)；MX3000P實時熒光定量 PCR 儀(Agilent) 。

1.4 EGFR 21號外顯子突變體構(gòu)建與驗證

采用細(xì)胞基因組提取試劑盒對肝癌細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA的提取，根據(jù)EGFR基因序列信息設(shè)計相應(yīng)引物。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，含 2 × Taq DNA聚合酶Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、59 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 5min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化，獲得單克隆菌株。

EGFR基因21號外顯子中涉及兩個點突變，即EGFR基因2 573位置堿基T突變?yōu)镚(L858R)和EGFR基因2 582位置的堿基T突變?yōu)锳(L861Q)。以陰性(即未發(fā)生突變)質(zhì)粒為模板誘導(dǎo)定向突變。mR引物與mF引物互補(bǔ)，引物F及引物R為TA克隆擴(kuò)增外顯子21的引物,見表1。

表1 外顯子21重疊延伸突變引物設(shè)計

首先進(jìn)行第一輪PCR，將EGFR 基因21號外顯子拆分成兩部分，產(chǎn)物中有突變位點。將第一輪膠回收的兩段產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行第二輪PCR，進(jìn)行電泳鑒定無誤后，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒。采用電泳鑒定和DNA測序驗證突變體構(gòu)建效果。

1.5 實時熒光PCR檢測方法建立

設(shè)置檢測管與內(nèi)參(Internal Control)管，對基因突變進(jìn)行檢測。檢測管檢測21號外顯子的 L861Q和L858R點突變。內(nèi)參管檢測 EGFR 基因的 3 號外顯子序列，主要評價 PCR 擴(kuò)增效率，與檢測管的差值ΔCT值的大小是劃定陰陽性的重要指標(biāo)。以檢測管反應(yīng)體系為例，實時熒光PCR反應(yīng)體系為25 μL：上游引物-1 0.9 μL，上游引物-2 0.9 μL，下游引物0.9 μL，探針P 0.9 μL,模板DNA 5 μL，Taq酶 0.2 μL，UNG酶 0.1 μL，dNTPs(AGCT) 0.08 μL，dNTPs(AGCU)0.02 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。實時熒光PCR擴(kuò)增程序：42 ℃孵育5 min，94 ℃預(yù)變性45 s；94 ℃ 45 s、60 ℃ 80 s，共 40個循環(huán)。60 ℃時采集熒光信號。

實時熒光PCR引物及探針序列見表2。

表2 實時熒光PCR引物及探針序列

1.6 特異性、靈敏度、分辨率檢測

提取實驗室培養(yǎng)的HepG2人肝癌細(xì)胞、LoVo人結(jié)腸癌細(xì)胞、人胎盤細(xì)胞基因組，利用上述基因組及構(gòu)建的陰性質(zhì)粒和陽性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行特異性檢測。

根據(jù)提取質(zhì)粒的OD值計算拷貝數(shù)，稀釋為105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、101copies/mL的樣品，共設(shè)置5個梯度,分別作為模板進(jìn)行靈敏度檢測。

為測試其在陰性人基因組DNA背景下的分辨率，在陰性人基因組DNA 中摻入3%及1%的 E21 突變參考品(104copies/mL)進(jìn)行分辨率檢測。

1.7 臨床樣品檢測

利用上述實驗方法，使用109例已知突變的非小細(xì)胞肺癌患者組織切片和組織蠟塊進(jìn)行檢測，測試方法對實際樣品的檢測能力。

購買能夠檢測E21 L858R突變的市售試劑盒與前述方法進(jìn)行對比，對36例未知突變的樣品進(jìn)行檢測和實驗結(jié)果匯總，并利用kappa系數(shù)對兩種方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因突變體的構(gòu)建

突變體構(gòu)建電泳鑒定結(jié)果如圖1所示。

圖1(a)是第一輪 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果(M:DNAMarker D2000； 1～4：E21PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，其中mF與R互為上下游引物，F(xiàn)與mR互為上下游引物，即將EGFR 基因21號外顯子拆分成兩部分。21號外顯子基因大小為397 bp，因此產(chǎn)物條帶大小不應(yīng)超過397 bp，電泳結(jié)果顯示，片段大小正確。將第一輪膠回收的兩段產(chǎn)物作為模板，F(xiàn)與R互為上下游引物進(jìn)行第二輪PCR，經(jīng)過第二輪PCR，帶有突變位點堿基的兩段DNA序列拼接到了一起，合成了帶有突變堿基的線性目的序列。片段大小應(yīng)為397 bp，圖1(b)電泳鑒定結(jié)果(M:DNAMarker D2000 ；1～2：E21PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)顯示，片段大小正確。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定(見圖1(c))(M：DNAMarker DL15000；1～2：E21突變質(zhì)粒)。產(chǎn)物大小約為2 900 bp，電泳結(jié)果顯示，片段大小正確。

(a) E21 PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果圖 (b) E21第二輪PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果圖 (c) E21質(zhì)粒提取電泳結(jié)果

將 EGFR 基因突變陽性質(zhì)粒送往長春庫美生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。E21發(fā)生L858R突變構(gòu)建體DNA 測序結(jié)果如圖2所示。

圖2 E21 L858R 測序鑒定結(jié)果(T堿基突變?yōu)镚堿基)

圖2中上部分為陰性基因序列，下部分為L858R突變體基因序列。由圖2可知，T堿基突變?yōu)镚堿基，可確定L858R突變體構(gòu)建成功。

E21 發(fā)生L861Q突變構(gòu)建體DNA 測序結(jié)果如圖3所示。

圖3 E21 L861Q 測序鑒定結(jié)果(T堿基突變?yōu)锳堿基)

圖中陰性基因序列和L861Q突變體基因序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)T堿基突變?yōu)锳堿基，說明L861Q突變體也構(gòu)建成功。

2.2 特異性驗證結(jié)果

HepG2、胎盤和LoVo三種細(xì)胞提取物特異性驗證結(jié)果見表3。

表3 三種細(xì)胞提取物特異性結(jié)果

由表3可知，陰性對照組均未發(fā)生擴(kuò)增，陽性對照組擴(kuò)增效果良好。以三種細(xì)胞提取物基因組為模板的內(nèi)參管中都發(fā)生了有效擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增效率良好，而E21擴(kuò)增管雖然發(fā)生了非特異性擴(kuò)增，但ΔCT值均大于10，證明ARMS引物特異性良好。

2.3 靈敏度測試結(jié)果

利用靈敏度測試模板對上述所建方法的靈敏度進(jìn)行測試，結(jié)果如圖4所示。

圖4 E21靈敏度擴(kuò)增曲線

因模板的每個濃度設(shè)置復(fù)孔3個，故每個濃度顯示三條擴(kuò)增曲線，三條曲線CT值接近，說明重復(fù)性良好。

根據(jù)圖4將各模板濃度與對應(yīng)的CT值作圖得到靈敏度擴(kuò)增線性圖，如圖5所示。

由圖5可知，模板濃度在105copies/mL至101copies/mL范圍內(nèi)，模板濃度與對應(yīng)的CT值呈線性關(guān)系。當(dāng)模板濃度為101copies/mL時，模板濃度與CT值仍基本符合線性關(guān)系。綜上所述，方法的最低檢測限為101copies/mL。與常規(guī)TaqMan探針法的最低檢測限基本一致。

圖5 E21靈敏度擴(kuò)增線性圖

2.4 分辨率結(jié)果

利用分辨率測試模板對所建方法進(jìn)行分辨率測試,結(jié)果如圖6所示。

圖6 L858R分辨率擴(kuò)增曲線圖

由圖6可見，在陰性基因組DNA的背景下，內(nèi)參管曲線擴(kuò)增平滑，表明反應(yīng)中擴(kuò)增效率良好，PCR反應(yīng)正常。E21檢測管中利用濃度為1%和3%的分辨率測試模板進(jìn)行反應(yīng)，均發(fā)生擴(kuò)增，CT值分別為32.96和31.78，均小于35.00。說明在陰性人基因組DNA中1%的E21突變(104copies/mL)仍能很好地檢出。

2.5 臨床樣品檢測

采用構(gòu)建方法檢測臨床樣品，內(nèi)參管對109例樣品的檢測結(jié)果均為陽性。E21檢測管對109 例臨床樣品進(jìn)行檢驗，檢測結(jié)果顯示共22例發(fā)生E21突變，突變比例為20.10%(22/109)。與樣品實際突變結(jié)果相符。反應(yīng)時間約為2 h，與測序法相比，大大縮短了檢測時間。

采用構(gòu)建的檢測方法與市場上購得的EGFR 基因突變檢測試劑盒共同對36例未知突變的非小細(xì)胞肺癌患者樣品進(jìn)行檢測，L858R突變檢測結(jié)果kappa值見表4。

由表4可知，36例組織樣品中，市售 EGFR 基因突變檢測試劑盒法檢出L858R突變4例(陽性1),未突變32例(陰性1)；構(gòu)建的 ARMS 方法檢出L858R突變 4 例(陽性2),未突變32例(陰性2)，對于L858R檢測來說,兩種方法的檢出一致率34/36=94.4%，kappa值=0.72。說明兩種方法的一致程度高。

表4 L858R突變kappa值

構(gòu)建方法檢測為陽性而市售EGFR基因突變試劑盒檢測為陰性的樣品，進(jìn)行測序，得到測序結(jié)果如圖7所示。

由圖7可見，T堿基突變?yōu)镚堿基，樣品發(fā)生了L858R突變，與構(gòu)建方法測試結(jié)果一致。

3 結(jié) 語

構(gòu)建了可檢測EGFR基因E21突變的檢測方法。該檢測方法靈敏度高，最低檢測限達(dá)到101copies/mL；在陰性人基因組背景下，對濃度為104copies/mL的突變質(zhì)粒分辨率達(dá)到1%，且表現(xiàn)出良好特異性。該方法操作簡單、檢測耗時短，是一種高效的檢測方法。

圖7 差異樣品測序結(jié)果