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    白藜蘆醇/富勒烯納米組裝體的制備
    ——在膽管支架抗炎涂層中的應(yīng)用評估

    2021-03-23 10:40:38劉永佳戚曉亮徐汪節(jié)喬中東
    實驗室研究與探索 2021年2期
    關(guān)鍵詞:抗炎膽管涂層

    高 建,劉永佳,戚曉亮,徐汪節(jié),喬中東

    (1.上海交通大學(xué)a.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院;b.分析測試中心,上海 200240;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院,上海 200011)

    0 引言

    膽管狹窄是膽道疾病患者高發(fā)病率和高死亡率的重要原因[1]。外科手術(shù)中的膽管受損、增生性膽管炎以及惡性腫瘤是導(dǎo)致膽道狹窄的主要原因,狹窄形成與成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白沉積、纖維化和腫瘤生長有關(guān)。處置不當(dāng)會引發(fā)胰腺炎,梗阻性黃疸等高風(fēng)險疾?。?-3]。目前外科手術(shù)治療可以通過植入膽管支架直接改善膽道狹窄[4]。據(jù)統(tǒng)計,有30%的患者在第1次手術(shù)后出現(xiàn)了良性膽道狹窄,需要再次手術(shù)治療[5]。因此,降低術(shù)后增生性膽管炎的發(fā)生率和隨后的纖維化是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。

    白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是一種天然多酚類黃酮,在不同的組織和器官中均表現(xiàn)出抗纖維化作用[6]。Res參與巨噬細(xì)胞的活化,抑制促炎基因的表達(dá)。Res具有激活Sirt1 和抑制炎癥的能力,Sirt1 會破壞TLR4/NF-kB/STAT 信號,從而降低巨噬細(xì)胞衍生的促炎因子產(chǎn)生[7]。膽管狹窄可通過Res洗脫球囊或支架來實現(xiàn)擴(kuò)張[8],但Res 直接作用于膽道狹窄部位的藥量有限,且膽汁會降低藥物作用濃度,但如果使用高濃度的Res又會帶來副作用。因此,研究能在膽管狹窄部位局部用藥并能持續(xù)緩慢釋放Res的藥物洗脫支架十分重要。

    富勒烯(Fullerene,C60)作為一種強(qiáng)大的抗氧化劑,其中空分子結(jié)構(gòu)可負(fù)載藥物,是一種潛在的藥物遞送載體。C60 可通過抑制肥大細(xì)胞和外周血嗜堿性粒細(xì)胞抑制促炎介質(zhì)的釋放,達(dá)到抗炎作用[9]。

    本文運(yùn)用分子自組裝技術(shù)將具有抗炎功能的Res和C60 組裝成納米結(jié)構(gòu),并選取聚氨酯(Polyurethane,PU)這一力學(xué)強(qiáng)度、生物相容性良好的高分子材料做載體,并將該納米組裝體負(fù)載PU中,研究其用于膽管支架抗炎涂層領(lǐng)域的可能性。

    1 材料與方法

    1.1 試 劑

    主要試劑:Res和C60 購于SIGMA公司,異丙醇、間二甲苯、PU、購于常熟市楊園化工有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI1640)固體粉末購買于Gibco 公司,胎牛血清(FBS)購于四季青公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVECs)購于中科院上海細(xì)胞所。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 Res/C60 納米組裝體的制備

    配制2 mg/mL的Res異丙醇溶液和6 mg/mL C60間二甲苯溶液。Res 溶液與C60 溶液以不同體積比(2∶1,3∶1,5∶1,10∶1)混合,立即將混合液置于超聲儀(KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司)中,室溫超聲20 min,4 ℃冰箱靜置過夜,留存待用?;旌先芤河? 000 r/min離心后,取沉淀風(fēng)干后獲得Res/C60 組裝體粉末。

    1.2.2 載Res/C60 的PU(PU-Res/C60)涂層制備

    稱取3 g PU,溶于20 mL 四氫呋喃,室溫超聲20 min,制成15%的PU 溶液。將不同體積(1,2,3 mL)的選定納米組裝體溶液加入相應(yīng)體積(9,8,7 mL)的15%PU溶液中,渦旋30 min,制成含有納米組裝體溶液體積比10%、20%、30%的載納米組裝體的PU混合溶液。打開自動涂膜機(jī)(AFA-II,魅宇儀器),預(yù)熱至70 ℃,將12 mL混合溶液傾倒在無塵玻璃板一端,用200 nm的金屬滾動涂膜器將溶液緩慢滾動成20 cm×10 cm薄膜,將玻璃板放置在通風(fēng)櫥風(fēng)干,待溶劑完全揮發(fā),揭下薄膜涂層待用。

    1.3 Res/C60 納米組裝體理化性能表征

    (1)不同投料比例的Res/C60 納米組裝體表面形貌和直徑分布。將Res/C60 納米組裝體溶液分別滴在潔凈硅片上,保持表面潔凈,置于通風(fēng)櫥中過夜讓溶劑揮發(fā)。樣品表面做噴金處理,使用掃描電子顯微鏡(SEM,Sirion 200,F(xiàn)EI)觀察形貌。Nano Measurer 軟件隨機(jī)選擇100 個組裝體來計算組裝體平均直徑分布。

    (2)Res、C60 和Res/C60 納米組裝體的表面形貌。將6 mg/mL的C60 間二甲苯溶液與2 mg/mL 的Res異丙醇溶液以體積比1∶3混合;純Res溶液加入相同比例的間二甲苯,純C60 溶液加入相同比例的異丙醇。將上述3 種溶液分別混合,室溫超聲20 min,4 ℃冰箱靜置過夜。同樣條件下經(jīng)掃SEM 觀察納米組裝體的表面形貌。

    (3)拉曼光譜分析。將純Res、C60 和Res/C60組裝體粉末分別用鑷子挑取少量置于干凈的硅片上,用玻璃片壓平,用色散型共聚焦拉曼光譜儀(Senterra R200-L,Bruker Optics)進(jìn)行測試。

    (4)X-射線衍射圖分析。分別取Res、C60 和Res/C60 粉末用多功能X 射線衍射儀(D8 ADVANCE Da Vinci,Bruker)進(jìn)行測試。測試條件為40 kV、40 mA和掃描范圍2θ=3°~50°。

    1.4 PU-Res/C60 涂層的機(jī)械性能評價

    載藥納米組裝體PU涂層的機(jī)械性能通過拉伸測試儀(H5K-S,Hounsfield,UK)進(jìn)行測定。將樣品膜裁成50 mm×10 mm 的平行樣品,兩夾具之間間距為30 mm,以10 mm/min 的速度進(jìn)行拉伸。每個樣條平行測試5 次。

    1.5 PU-Res/C60 涂層的藥物緩釋實驗

    藥物緩釋過程采用動態(tài)透析法進(jìn)行研究,具體過程為:取PU-Res/C60 涂層20 mg 置于透析袋中(截留相對分子質(zhì)量為3.5 kD)。將透析袋浸沒在10 mL PBS(0.2 mol/L,pH 7.4)中,放置在搖床中震蕩(設(shè)定溫度為37°C,速度為120 r/min)。一定時間間隔后,將透析袋外液體全部移除,重新加入10 mL PBS(0.2 mol/L,pH 7.4)。收集不同時間點的透析液并離心(5 000 r/min)保管上清,取2 mL上清用2 mL無水乙醇稀釋,用紫外分光光度計測定305 nm處藥物的特征紫外吸收值。用PBS與無水乙醇體積比為1∶1為溶劑,測定一系列已知濃度的Res溶液紫外吸收值,獲得Res標(biāo)準(zhǔn)曲(Y=0.013 03+0.129 63X,R2=0.999 8)。透析液中Res的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出。將組裝體溶液離心取上清,通過測得上清液中殘留的Res濃度,計算得組裝體溶液載藥量為8.35%,包封率為20.75%。

    1.6 MTT法測定細(xì)胞活性

    選用HUVECs 進(jìn)行Res/C60 納米組裝體的MTT(methyl-thiotetrazole)法細(xì)胞毒性評價。96 孔板中鋪入1 ×104個細(xì)胞/孔,用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在含5%CO2和37℃培養(yǎng)12 h。加入Res、C60和組裝體藥物保持其終濃度為10 μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按MTT 試劑盒進(jìn)行后續(xù)操作,用酶標(biāo)儀(Multiskan MK3;Thermo Labsystems)在492 nm 下測量吸光度。取6 個平行樣品的平均值。

    1.7 白藜蘆醇清除DPPH自由基能力的評價

    取0.1 mL 不同濃度(10,20,30,40,50,80,100 μg/mL)梯度的Res、C60 和Res/C60 納米組裝體溶液分別同1.0 mL 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)乙醇溶液混勻,DPPH 乙醇溶液為空白樣液,于37 ℃反應(yīng)60 min 后在波長517 nm比色,DPPH 自由基清除率D采用如下公式計算。

    1.8 Res/C60 納米組裝體的抗炎效果評價

    (1)原代樹突狀細(xì)胞的提取。選取6~8 周齡的C57BL/6 小鼠,頸椎脫臼處死,用注射器反復(fù)吸取無菌的PBS緩沖液沖洗出骨髓腔中細(xì)胞,1 000 r/min離心10 min后,取細(xì)胞沉淀,接種于培養(yǎng)皿中,加入終濃度為100 ng/mL 脂多糖(LPS)刺激骨髓造血細(xì)胞成熟,培養(yǎng)的第3 天半量換液,第5 天全量換液,第7 天得成熟的樹突狀細(xì)胞。

    (2)Res/C60 納米組裝體對炎癥因子抑制效果評價。將樹突狀細(xì)胞以1 ×104個細(xì)胞/孔的密度接種于24 孔板中,培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞完全貼壁后,設(shè)定實驗分組為空白對照(培養(yǎng)基)、LPS 陽性對照和Res/C60 納米組裝體,陽性組和組裝體組分別加入50 μL LPS 溶液,保持其終濃度為100 ng/mL,組裝體組加入50 μL組裝體原液,其余組用相同體積培養(yǎng)基補(bǔ)齊,培養(yǎng)12 h后通過檢測細(xì)胞中白細(xì)胞介素1(IL-1),白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的mRNA的表達(dá)水平來評價納米組裝體的抗炎效果。數(shù)據(jù)統(tǒng)計P <0.05。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    以上所有實驗都至少做3 次平行,通過使用單向方差分析比較數(shù)據(jù)獲得統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD,統(tǒng)計學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P <0.05。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 Res、C60 和不同比例納米組裝體的表面形貌及直徑分布

    觀察Res、C60 和Res/C60 納米組裝體的表面形態(tài)。純Res呈花瓣樣片狀,純C60 呈細(xì)長的棒狀,截面為規(guī)整的六邊形,兩者通過分子自組裝技術(shù)組裝后,為短棒狀,且棱柱的棱角更圓潤。

    Res溶液與C60 溶液以體積比3∶1混合后得到的組裝體(Res/C60-3∶1),直徑分布在250~450 nm,標(biāo)準(zhǔn)差值最小,說明這種比例下的組裝體尺寸分布均勻,為最佳的Res/C60 組裝體的投料比,文中提到Res/C60 組裝體均采用此種制備條件。

    圖1 Res(a)和C60(b)和組裝體(c)Res/C60-2∶1,(d)Res/C60-3∶1,(e)Res/C60-5∶1,(f)Res/C60-10∶1的表面形貌和直徑分布

    2.2 拉曼光譜及X-射線衍射圖

    拉曼光譜反映分子的振動頻率信息,可用于分析物質(zhì)的組分和結(jié)構(gòu)。圖2(a)拉曼光譜圖譜中有較強(qiáng)的C60 信號峰,同樣可以說明組裝體中存在C60,組裝體中新生成的峰可能由于兩者組裝形成。

    圖2(b)X-射線衍射圖譜顯示,純Res 高度結(jié)晶,并在2θ 的范圍觀察到以16.31°、19.14°、22.39°、23.56°、25.16°、28.26°的尖銳的衍射峰,說明了Res是晶體性質(zhì)。此外,在Res/C60 的組裝體上也出現(xiàn)了部分Res和C60 疊加的特征峰。說明Res與C60 組裝成功,且大部分是包括在C60 分子內(nèi)部,因此未顯示出強(qiáng)烈特征性的尖峰。

    2.3 PU-Res/C60 涂層表面形貌分析

    圖2 Res、C60和Res/C60納米組裝體的拉曼光譜圖和X-射線衍射圖譜

    圖3 (a)裸支架、覆膜支架和擴(kuò)張后的覆膜支架,(b)覆膜支架SEM圖,(c)、(d)分別為裸支架SEM圖和EDS能譜,(e)、(f)分別為覆膜支架的SEM圖和EDS能譜圖

    從圖3(a)、(b)可觀察出,該覆膜彈性良好,擴(kuò)張后有足夠的柔韌性和強(qiáng)度來支持臨床使用。比較圖3(c)~(f)可知,覆膜的金屬支架對應(yīng)的能譜圖中(c)、(d)含量升高,驗證了PU-Res/C60 涂層的成功涂覆。

    2.4 PU-Res/C60 涂層薄膜的力學(xué)性能評價

    載藥納米涂層薄膜的機(jī)械性能是其在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域應(yīng)用的重要因素。圖4(a)中所有樣品均呈現(xiàn)較好的彈性,隨著載藥量的增加,PU-Res/C60 涂層薄膜的最大斷裂強(qiáng)度逐漸增加。如圖4(b)所示,PURes/C60 涂層薄膜的彈性模量較純PU膜大,且隨著載藥量的增加與增大的趨勢。機(jī)械性能的結(jié)果表明,在PU中載入Res/C60 納米組裝體后形成的涂層薄膜,彈模量增加,彈性稍有降低,但總體滿足其應(yīng)用需求。

    圖4 載有不同藥量的納米組裝體涂層薄膜的機(jī)械性能

    2.5 PU-Res/C60 涂層薄膜的藥物緩釋實驗和Res/C60 納米組裝體的自由基清除能力

    從圖5(a)可看出,PU-Res/C60-10%納涂層在30天后釋放出約63%的Res藥物,相比較,PU-Res/C60-20%和PU-Res/C60-30%納米組裝體涂層僅釋放出約45%和39%,比PU-Res/C60-10%納米組裝體涂層藥物釋放得更加緩慢,能夠持續(xù)發(fā)揮藥效。

    通常,聚合物載藥體系在藥物緩釋初始階段易形成藥物突釋現(xiàn)象,隨后藥物以相對穩(wěn)定的緩釋速度持續(xù)釋放[10]。PU-Res/C60 涂層在第1 天的藥物緩釋實驗中藥物累積釋放量最高達(dá)20%左右,在30 天的長周期內(nèi)PU-Res/C60-10%涂層能夠持續(xù)累積釋放60%左右的藥量。由于白藜蘆醇不溶于水,故其在血液中的半衰期較短,生物利用度低,不能長時間對免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎作用[11],所以需要設(shè)計Res 藥物緩釋系統(tǒng),達(dá)到藥物持續(xù)釋放和在較長時間內(nèi)發(fā)揮抗炎效果。本研究設(shè)計的PU-Res/C60 納米組裝體涂層,可以通過添加不用含量的Res/C60 納米組裝體來實現(xiàn)不同載藥量的需求,Res 與C60 形成的自組裝結(jié)構(gòu),再與PU形成涂層,兩者都有助于控制其藥物釋放速度,使其在長時間內(nèi)可達(dá)到藥物持續(xù)釋放的目的。

    羥自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物分子,造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷,易引發(fā)炎癥反應(yīng),羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)。據(jù)圖5(b)可知,Res、C60 和Res/C60 納米組裝體這3 種物質(zhì)的羥自由基清除能力隨濃度增大逐漸成上升趨勢。組裝體濃度達(dá)100 μg/mL時,有50%以上的自由基清除率。

    圖5 (a)PU-Res/C60 涂層在PBS 緩沖液(pH 7.4)中的體外藥物釋放曲線;(b)Res、C60和Res/C60納米組裝體的自由基清除能力

    2.6 Res、C60 和Res/C60 納米組裝體對體外細(xì)胞存活率的影響及其抗炎效果評估

    如圖6(a)所示,各實驗組在培養(yǎng)48 h 后,HUVECs存活率均在90%以上,說明Res、C60 和Res/C60 納米組裝對正常細(xì)胞毒性較低,有較好的生物相容性。

    通過對與組裝體共培養(yǎng)12 h 后的炎癥因子的表達(dá)水平進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)LPS 炎癥因子出現(xiàn)明顯下降,如圖6(b)所示,IL-1,IL-6,TNF-α 3 個代表性的炎癥因子,在LPS誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著上升,在持續(xù)的Res釋放條件下,3 種炎癥因子的mRNA 表達(dá)水平受到明顯抑制。

    圖6 MTT法測定Res/C60 納米組裝體48 h 后HUVECs 的存活率;Res/C60納米組裝體孵育12 h后各炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

    有研究發(fā)現(xiàn)Res可以減少巨噬細(xì)胞中IL-1 和IL-6的表達(dá)[12],而IL-1 和IL-6 表達(dá)量增加說明細(xì)胞處在促炎狀態(tài)[13]。在慢性膽道梗阻所致大鼠肝損傷動物模型實驗中[14],Res 具有顯著性保護(hù)作用,可抑制導(dǎo)管增生和淋巴細(xì)胞炎癥,能很好抑制組織中慢性疾病有關(guān)的低度炎癥狀態(tài)[15]。同時,Res 可用作膽道梗阻的保護(hù)劑,治療膽管結(jié)扎后的肝功能受損,減少凋亡細(xì)胞數(shù)量[16]。本實驗中Res 表現(xiàn)出與上文一致的抗炎效果,說明納米組裝體對炎癥因子的釋放有明顯的抑制作用。

    3 結(jié)語

    本文基于分子自組裝技術(shù)得到Res/C60 納米組裝體,在此基礎(chǔ)上研究了該組裝體的理化性能與其應(yīng)用于藥物洗脫支架的可能性。更進(jìn)一步運(yùn)用PU作為組裝體載體,制備得到PU-Res/C60 涂層,驗證了其在膽管支架抗炎涂層領(lǐng)域的應(yīng)用。Res/C60 納米組裝體具有良好的藥物緩釋性能、低毒性和抗炎功能,且在膽管支架抗炎涂層領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景,未來有希望用于臨床改善膽管炎性狹窄。

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