共載TPE衍生物和納米銀的PLGA復(fù)合載藥體系的抑菌活性研究

匡 昭，張偉偉，項(xiàng)駟文

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

感染性疾病是致死率最高的病癥之一。抗菌藥物的廣泛使用和濫用已經(jīng)導(dǎo)致細(xì)菌多藥耐藥性的出現(xiàn)。耐藥性細(xì)菌感染則需要使用高劑量的抗生素，但這會(huì)導(dǎo)致更高的藥物毒性，更長(zhǎng)的住院時(shí)間和更高的死亡率。耐藥性細(xì)菌的全球影響更難以量化，因此，尋找一種安全、高效且不會(huì)出現(xiàn)耐藥性細(xì)菌的治療方法受到了科研人員的廣泛關(guān)注。

如今納米技術(shù)在諸如醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等大多數(shù)研究領(lǐng)域中起著重要的作用，在生物制藥應(yīng)用中具有潛力。納米材料已開(kāi)始越來(lái)越多地用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，納米醫(yī)學(xué)也成為了治療多種疾病的有力工具。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是遞送系統(tǒng)(例如微球)的首選材料，在過(guò)去的幾十年中，包含乳酸和乙醇酸的聚合物及其共聚物作為藥物和組織工程中的預(yù)期藥物遞送載體而引起了人們的關(guān)注。PLGA由于分子結(jié)構(gòu)、形態(tài)、機(jī)械性質(zhì)和藥物載體而具有出色的生物降解性和生物相容性，所以它是封裝抗菌化合物的合適選擇。

近年來(lái)，無(wú)機(jī)和金屬配合化學(xué)治療領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)，過(guò)渡金屬離子螯合的有機(jī)雜環(huán)配體是潛在的藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。1,10-菲啰啉是研究的N，N'-雜環(huán)螯合配體之一，相關(guān)報(bào)道了基于1,10-菲啰啉化合物的抑菌活性。Raman等合成了一系列具有通式[M(L)(phen)] Cl的配合物，其表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性和抗真菌活性。1,10-菲啰啉-5,6-二酮衍生物(TPE)顯示出對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的高抗菌活性?；?,10-菲啰啉-5,6-二酮的化合物具有良好的抗菌活性，因此具有開(kāi)發(fā)用于預(yù)防和治療由耐藥性細(xì)菌引起的感染的新的化學(xué)治療手段前景。銀及其化合物具有很強(qiáng)的抑菌殺菌作用，對(duì)真菌和病毒具有廣譜抗菌活性。納米銀(Ag NPs)與細(xì)菌的特異性相互作用、隨后的滲透以及局部釋放的Ag離子均可導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此，Ag NPs因其有效的殺菌作用而受到人們的廣泛關(guān)注。

研究通過(guò)復(fù)乳法合成復(fù)合納米載藥體系PLGA@TPE@Ag，通過(guò)表征手段對(duì)其形貌和特性進(jìn)行研究，再進(jìn)一步探究該復(fù)合納米載藥體系對(duì)耐藥性細(xì)菌的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PLGA(50∶50，Mw：7 000～17 000 kDa)、聚乙烯醇(PVA，MW：30 000～70 000 kDa；水解度87%～89%)、二氯甲烷、AgNO粉末(99.99%)、NaBH(≥96%)和NaOH購(gòu)自Sigma-Aldrich Chemical(美國(guó))。所有試驗(yàn)用水均為蒸餾水。TPE衍生物為實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2 Ag NPs合成

十一巰基烷酸和AgNO(0.017 g)等摩爾混合，劇烈攪拌5 min。預(yù)配置的NaBH(0.004 56 g)溶液在同一室溫條件下迅速加入到上述溶液中，劇烈攪拌1 h。在磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌6 h，最后10 000 rpm離心收集產(chǎn)物。

1.3 PLGA載藥納米體系合成

PLGA(500 mg)溶解于2 mL的二氯甲烷中，渦旋5 min后，形成一種乳化液。再次將1 mL的TPE衍生物(四氫呋喃溶液)加入到上述溶液中，繼續(xù)渦旋15 min。將5 mL PVA(5%)溶液加入到上述溶液中，探頭式超聲3 min，形成W1/O溶液。超聲結(jié)束后，加入25 mL PVA(0.3%)溶液，形成W1/O/W2型溶液。然后磁力攪拌過(guò)夜，離心除去有機(jī)溶劑，次日收集納米粒子(5 000 rpm，5 min),合成的納米粒子為PLGA-TPE。如果將TPE衍生物替換成Ag NPs粒子，合成的納米粒子為PLGA-Ag。如果將TPE衍生物和Ag NPs同時(shí)加入，合成的納米粒子為PLGA@TPE@Ag。

1.4 表征試驗(yàn)

紫外-可見(jiàn)光譜(UV-vis，S-3100，Scinco Co.，Korea)檢測(cè)UV-可見(jiàn)吸收光譜。透射電子顯微鏡(TEM，HT7700，Tokyo Japan，Hitachi)觀察Ag NPs和PLGA@TPE@Ag的形態(tài)。掃描電鏡(S-4800,Hitachi,Japan)觀察合成的PLGA形態(tài)。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量PLGA和PLGA@TPE@Ag粒徑分布情況。

1.5 載藥量和包封率試驗(yàn)

稱取一定質(zhì)量干燥的各種PLGA納米體系(PLGA-TPE、PLGA-Ag和PLGA@TPE@Ag)，溶解在1 mL的二氯甲烷溶液中，渦旋震蕩10 min溶解后，再加入1 mL PBS溶液，繼續(xù)渦旋震蕩10 min，吸取一定體積的上清液進(jìn)行不同波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)，目的是檢測(cè)TPE和Ag NPs吸光度。然后根據(jù)已建立的藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液中藥物的含量。PLGA@TPE@Ag載藥體系是將二者的藥物的總量計(jì)算在內(nèi)。

包封率=溶液中藥物質(zhì)量/總的投藥量,載藥量=溶液中藥物質(zhì)量/干燥載藥體系質(zhì)量。

1.6 藥物緩釋試驗(yàn)

探究PLGA載藥納米體系(PLGA-TPE、PLGA-Ag和PLGA@TPE@Ag)的體外緩釋特性試驗(yàn)方法如下：將適量的單個(gè)PLGA載藥納米體系溶解在PBS緩沖液中，然后將溶液轉(zhuǎn)移至已預(yù)處理的透析袋中(MWCO=10 kDa)，透析袋置于合適的裝有PBS緩沖溶液的燒杯中。然后分別在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)溶液的吸光度，計(jì)算材料累積的濃度百分比。

1.7 細(xì)菌培養(yǎng)

常見(jiàn)的革蘭氏菌(大腸桿菌ATCC 8739，金黃色葡萄球菌ATCC 6538和枯草芽孢桿菌ATCC 6633)從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲得，在37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h。將單菌落重新接種至液體培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃、200 rpm搖床條件下培養(yǎng)12 h。最后,將此轉(zhuǎn)接的細(xì)菌混懸液按照1∶40的比例置于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 rpm搖床條件下培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)測(cè)得OD=0.5時(shí)可知，此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.8 抑菌活性試驗(yàn)

對(duì)數(shù)期的細(xì)菌細(xì)胞的溶液(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌)經(jīng)過(guò)合適濃度稀釋后，分別在含有空白PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA-Ag、PLGA-TPE和PLGA@TPE@Ag的溶液中孵育1 h。然后涂布于LB-瓊脂平板，PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA-Ag、PLGA-TPE作為對(duì)照組，無(wú)任何處理的細(xì)胞作為空白組。通過(guò)計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU)來(lái)統(tǒng)計(jì)存活細(xì)胞數(shù)量。

不同材料溶液(PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA-Ag、PLGA-TPE、PLGA@TPE@Ag、氨芐青霉素和卡那霉素溶液)的最小抑制濃度(MIC)是利用液體渾濁度培養(yǎng)法進(jìn)行評(píng)估測(cè)定的。簡(jiǎn)言之，將對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種在含有不同材料梯度稀釋液的液體LB培養(yǎng)基里，并在37 ℃、200 rpm培養(yǎng)12 h。之后將每組藥物對(duì)應(yīng)的試管進(jìn)行渾濁度對(duì)比。MIC值被定義為可以抑制細(xì)菌的最低藥物濃度。每種材料溶液對(duì)應(yīng)的兩種細(xì)菌分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，MIC最終值取3次平均值。

1.9 LIVE-DEAD試驗(yàn)

對(duì)數(shù)期耐藥性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與PLGA@TPE@Ag(20 μg/mL)共同孵育1 h后，繼續(xù)在37 ℃、200 rpm培養(yǎng)12 h。同樣濃度的TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，不作任何處理的細(xì)胞作為空白組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)菌細(xì)胞并使用PBS(0.1 M)洗去培養(yǎng)基兩次。使用LIVE/DEAD細(xì)菌試劑盒(SYTO9和碘化丙啶(PI)，Life Technologies)在黑暗中染色細(xì)菌30 min，染色結(jié)束后繼續(xù)使用PBS(0.1 M)洗滌細(xì)胞兩次，目的是除去多余的染色液。吸取5 μL稀釋至合適濃度的細(xì)胞懸浮液滴在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察染色后的細(xì)胞。

1.10 超薄切片試驗(yàn)

對(duì)數(shù)期耐藥性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與PLGA@TPE@Ag(20 μg/mL)共同孵育1 h后，繼續(xù)在37 ℃下，200 rpm培養(yǎng)12 h。同樣濃度的TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，不作任何處理的細(xì)胞作為空白組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)菌細(xì)胞(3 000 rmp，5 min)并用PBS(0.1 M)洗滌兩次。然后用2.5%戊二醛溶液(w/v)和2%多聚甲醛(w/v)4 ℃過(guò)夜固定，次日同樣使用PBS(0.1 M)洗滌細(xì)胞兩次。最后通過(guò)透射電鏡觀察復(fù)合載藥體系作用細(xì)胞后的細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)的變化。

1.11 毒性試驗(yàn)

對(duì)PLGA@TPE@Ag的生物毒性進(jìn)行評(píng)估，主要是通過(guò)探究小鼠重要器官(心、肝、脾、肺和腎)受到的損傷情況來(lái)斷定。主要的檢測(cè)手段是對(duì)器官切片進(jìn)行HE染色，觀察組織損傷情況。將小鼠分為兩組試驗(yàn)，第一組為空白組，僅僅使用PBS處理小鼠；第二組為PLGA@TPE@Ag，注射劑量為2 mg/kg，連續(xù)30天對(duì)小鼠進(jìn)行注射。30天后安樂(lè)死處死小鼠，收集所有組小鼠的重要器官并進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 表征

合成了一種共載TPE衍生物及納米銀的PLGA復(fù)合載藥體系，該納米載藥體系的表征結(jié)果如圖1所示。首先對(duì)Ag NPs、PLGA、PLGA-TPE和PLGA@TPE@Ag的紫外分光光譜圖進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖1a所示。由圖1a可知，PLGA-TPE相對(duì)于空白的PLGA，其特征峰有明顯的紅移，紅移大約為10 nm左右，此結(jié)果說(shuō)明PLGA包裹TPE是成功的。同時(shí)再比較Ag NPs和PLGA@TPE@Ag的特征峰的位置，明顯發(fā)現(xiàn)Ag NPs被包裹進(jìn)PLGA載藥體系內(nèi)后，其特征峰發(fā)生90 nm的位移。圖1a結(jié)果可作為PLGA@TPE@Ag成功合成的主要判定方法之一。PLGA載藥后的粒徑的分布情況結(jié)果如圖1b所示。 由圖1b可知，空白的PLGA和PLGA@TPE@Ag的平均粒徑的大小是類似的，大約在300 nm左右，從分布情況來(lái)說(shuō)，PLGA@TPE@Ag更加集中。載藥體系形態(tài)是通過(guò)電鏡直接觀察得到，結(jié)果如圖1d和圖1e所示。圖1d是空白的PLGA NPs，可觀察到形態(tài)大小幾乎一致，分散均一，形態(tài)呈現(xiàn)圓形結(jié)構(gòu)，表面光滑；圖1e是PLGA@TPE@Ag的透射電鏡圖像，結(jié)果可發(fā)現(xiàn)大小和空白的PLGA幾乎一致，且形態(tài)方面也類似，可明顯觀察到PLGA@TPE@Ag內(nèi)部顏色較深的核心區(qū)域。此結(jié)果的出現(xiàn)間接證明了其包裹的原子序數(shù)較高的Ag和TPE中的元素存在。同時(shí)我們也通過(guò)透射電鏡觀察了Ag NPs的形態(tài)，其大小在5 nm左右(見(jiàn)圖1c)。綜上所述，表征的相關(guān)試驗(yàn)證明了共載TPE衍生物及Ag NPs的PLGA復(fù)合載藥體系成功合成，其粒徑大小在300 nm左右，分散均一，形態(tài)呈現(xiàn)光滑的圓形結(jié)構(gòu)。

圖1 PLGA@TPE@Ag的表征試驗(yàn)結(jié)果

2.2 PLGA復(fù)合載藥體系藥物緩釋研究

PLGA包裹的小分子藥物具有藥物緩釋的特性，藥物緩釋可將包裹的藥物以適當(dāng)?shù)臐舛瘸掷m(xù)地釋放出來(lái)，使治療效果達(dá)到最大值，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生大的毒性損傷，結(jié)果如圖2所示。研究了Ag NPs和TPE兩種藥物的緩釋，結(jié)果可以看出未包裹的Ag NPs在20 h內(nèi)，其釋放達(dá)到80%左右，說(shuō)明單純的Ag NPs沒(méi)有藥物緩釋特性。而PLGA包裹后的Ag NPs，其藥物釋放明顯減緩，前24 h藥物釋放僅僅達(dá)到32%，且后期三天的內(nèi)釋放也是緩慢的，符合藥物緩釋特性。同樣的釋放曲線出現(xiàn)在PLGA@TPE@Ag載藥體系中，其釋放的Ag NPs比例相對(duì)于PLGA包裹后的Ag NPs略微下降，但是差別不是很明顯。由圖2a可知，PLGA復(fù)合載藥體系具有藥物緩釋特性且可間接判斷PLGA@TPE@Ag包裹Ag NPs含量相對(duì)于PLGA-Ag是相差無(wú)幾的。TPE的藥物緩釋曲線如圖2b所示。由圖2b可知，結(jié)果與Ag NPs緩釋曲線類似，PLGA復(fù)合載藥體系具有藥物緩釋特性且可間接判斷PLGA@TPE@Ag包裹TPE含量相對(duì)于PLGA-TPE是相差無(wú)幾的。說(shuō)明其PLGA復(fù)合載藥體系相對(duì)于單載藥體系，其總載藥量是明顯增加的，結(jié)果如表1所示。在PLGA納米體系的載藥量和包封率的試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果中，PLGA@TPE、PLGA@Ag和PLGA@TPE@Ag包封率分別是68±2.8%、62±1.3%和73±0.9%，載藥量分別是18±2.5%、22±1.1%和35±3.7%。共載TPE衍生物及納米銀的PLGA復(fù)合載藥體系具有明顯的藥物緩釋特性。通過(guò)載藥量和藥物釋放結(jié)果也明確了復(fù)合載藥體系的載藥量明顯高于單一的載藥量。

圖2 PLGA@TPE@Ag緩慢釋放測(cè)試結(jié)果

表1 PLGA納米載藥體系的包封率和載藥量

2.3 抑菌活性初步探究

在MIC試驗(yàn)研究中，結(jié)果如表2所示。PLGA@TPE@Ag對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌MIC值分別是2.3±0.09 μg/mL、1.9±0.04 μg/mL和1.2±0.05 μg/mL。卡那霉素抑制三種細(xì)菌的MIC值分別為0.8±0.03 μg/mL、0.2±0.01 μg/mL和0.5±0.01 μg/mL，氨芐青霉素抑制三種細(xì)菌的MIC值分別為12.3±0.17 μg/mL、3.9±0.08 μg/mL和0.3±0.03 μg/mL。此結(jié)果說(shuō)明PLGA復(fù)合載藥體系對(duì)細(xì)菌具有高效的抑制活性，且具有一定的廣譜抑菌效果。單純的TPE對(duì)三種細(xì)菌的抑制活性較低，這和其極低的水溶性的關(guān)聯(lián)是分不開(kāi)的?？瞻椎腜LGA是不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生任何抑制活性的，因此可排除該材料的抑菌活性影響。PLGA@TPE@Ag的抑菌活性優(yōu)于單一的載藥體系(PLGA-TPE和PLGA-Ag)，此現(xiàn)象也說(shuō)明了復(fù)合載藥體系的優(yōu)越性。

CFU試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3a中是PLGA@TPE@Ag對(duì)大腸桿菌的CFU試驗(yàn)結(jié)果，由圖3a可知，PLGA@TPE@Ag質(zhì)量濃度在20 μg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌的菌落生成的抑制率達(dá)到98%以上，而單純的相同濃度的TPE僅僅為72%，Ag NPs為38%；單一載藥的PLGA-TPE和PLGA-Ag也具有一定的抑制率，效果分別是28%和26%。此結(jié)果說(shuō)明了單一載藥體系的納米材料對(duì)大腸桿菌的抑菌活性低于復(fù)合載藥體系，單一載藥的PLGA-TPE和PLGA-Ag有類似的抑菌效果，間接說(shuō)明水溶性被逆轉(zhuǎn)的TPE本身也具有較強(qiáng)的抑菌活性。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在圖3b中，在抑菌試驗(yàn)的初步研究中可得知PLGA@TPE@Ag展現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性，相對(duì)于單一的載藥體系，說(shuō)明PLGA復(fù)合載藥體系是成功的。

表2 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑制濃度數(shù)值

圖3 PLGA@TPE@Ag抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果注：沒(méi)有任何處理的兩種細(xì)菌細(xì)胞的CFU為空白組、PLGA、TPE、Ag NPs、PLGA@TPE和 PLGA@Ag為對(duì)照組(20 μg/mL)。

2.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

利用熒光染料對(duì)藥物處理的細(xì)胞進(jìn)行染色，活細(xì)胞可被SYTO9染色成綠色熒光細(xì)胞，死細(xì)胞可被PI染色成紅色熒光細(xì)胞，通過(guò)共定位處理后可直觀地觀察到細(xì)胞死亡比例。PLGA@TPE@Ag(20 μg/mL)處理后耐藥性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞的熒光共聚焦成像圖分別如圖4a與圖4b所示。同樣濃度的TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag作用的細(xì)胞的染色結(jié)果作為對(duì)照組，細(xì)胞不經(jīng)過(guò)任何處理的作為空白組。由圖4可知，TPE組含有少量的紅色熒光細(xì)胞，說(shuō)明其導(dǎo)致了部分細(xì)胞的凋亡。相對(duì)于TPE組，Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag三組中出現(xiàn)的紅色熒光細(xì)胞明顯增多，說(shuō)明三者的抑菌活性是增強(qiáng)的，PLGA-TPE組抑菌活性的增強(qiáng)說(shuō)明PLGA包裹TPE后，提高了TPE的抑菌活性。Ag NPs和PLGA-Ag類似的抑菌活性，說(shuō)明PLGA包裹Ag NPs后形成的單一載藥體系對(duì)該納米粒子抑菌活性的提高是不明顯的。通過(guò)觀察復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag作用細(xì)菌后的熒光共定位圖像可得知，大部分的細(xì)菌均被染色成紅色熒光，說(shuō)明細(xì)胞已經(jīng)凋亡。復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag對(duì)耐藥性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率可達(dá)95%以上，該復(fù)合載藥體系的抑菌活性得到進(jìn)一步地肯定。

圖4 PLGA@TPE@Ag熒光共聚焦成像圖注：TPE、Ag NPs、PLGA@TPE和PLGA@Ag為對(duì)照組(20 μg/mL)。SYTO 9(綠色熒光)和PI(紅色熒光)染色細(xì)胞(30 min)。細(xì)胞不經(jīng)過(guò)任何處理的作為空白組。

2.5 細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)的研究

在進(jìn)行了超薄切片試驗(yàn)，觀察復(fù)合載藥體系作用細(xì)胞后其內(nèi)部形態(tài)的變化，結(jié)果如圖5所示。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的空白組細(xì)胞保持完整的內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)，胞內(nèi)的細(xì)胞核和其他細(xì)胞器是清晰存在的。TPE組少部分的細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)破損，細(xì)胞基本保持完整性，說(shuō)明TPE對(duì)細(xì)胞具有一定的破壞。但是在Ag NPs、PLGA-TPE和PLGA-Ag組中細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)大面積的破損，胞內(nèi)物質(zhì)出現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)部分空洞情況。此結(jié)果說(shuō)明了三者具有一定的抑制活性。復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag組中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞破損的區(qū)域非常大，幾乎可觀察到大部分細(xì)胞出現(xiàn)破損情況，內(nèi)含物流出，無(wú)完整的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞變得非?？斩?。復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag相對(duì)于單一載藥體系(PLGA-TPE和PLGA-Ag)，其抑菌活性又得到較大的提高，說(shuō)明相同濃度下復(fù)合載藥體系的抑菌活性更強(qiáng)。復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag可破壞細(xì)胞的內(nèi)部形態(tài)，這也有可能是導(dǎo)致其細(xì)菌被抑制存活的主要機(jī)制。

圖5 PLGA@TPE@Ag超薄切片試驗(yàn)結(jié)果注：TPE、Ag NPs、PLGA-TPE和 PLGA-Ag(20 μg/mL)作用的細(xì)胞被設(shè)置成對(duì)照組，無(wú)任何處理的細(xì)胞設(shè)置成空白組。

2.6 毒性分析

復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag在體內(nèi)體外均展現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性，是一種潛在的納米級(jí)的藥物。但是作為潛在的納米級(jí)藥物，其生物毒性是必須要考慮的主要因素。因此通過(guò)免疫組化，將PLGA@TPE@Ag連續(xù)注射正常小鼠30天，觀察小鼠器官組織學(xué)變化，從而來(lái)判定該納米體系藥物會(huì)不會(huì)對(duì)小鼠造成很大的損傷，結(jié)果如圖6所示。通過(guò)與空白組對(duì)比，主要器官的HE染色結(jié)果是完全類似的，全部展現(xiàn)較好的生理學(xué)特征，無(wú)任何的細(xì)胞凋亡、組織水腫、組織損傷情況。此結(jié)果說(shuō)明該復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag對(duì)小鼠是無(wú)任何毒性的，可作為一種潛在的納米級(jí)的抗菌藥物。

圖6 小鼠HE組織染色評(píng)估PLGA@TPE@Ag毒性結(jié)果注：使用1 mL PBS(0.1 M)處理的小鼠設(shè)置為空白組，使用2 mg/kg 劑量的PLGA@TPE@Ag處理小鼠設(shè)置為處理組。

3 小結(jié)

研究成功合成了復(fù)合納米載藥體系PLGA@TPE@Ag。由共載TPE衍生物及Ag NPs的PLGA復(fù)合載藥體系的表征試驗(yàn)結(jié)果可知，其粒徑大小在300 nm左右，分散均一，形態(tài)呈現(xiàn)光滑的圓形結(jié)構(gòu)。作為一種包裹型的納米粒子，其載藥量達(dá)到了35±3.7%，包封率為73±0.9%。通過(guò)相關(guān)的藥物緩釋肯定了復(fù)合納米載藥體系PLGA@TPE@Ag具有明顯的藥物緩釋特性。通過(guò)載藥量和藥物釋放結(jié)果也明確了復(fù)合載藥體系的載藥量明顯高于單一的載藥量，其抑菌活性相對(duì)于單一的載藥體系理論上也會(huì)有極大的提高。PLGA@TPE@Ag對(duì)耐藥性的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌MIC值分別是2.3±0.09 μg/mL、1.9±0.04 μg/mL和1.2±0.05 μg/mL。PLGA@TPE@Ag濃度在20 μg/mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落生成的抑制率都高達(dá)90%以上。通過(guò)熒光染色試驗(yàn)也進(jìn)一步肯定了復(fù)合載藥體系PLGA@TPE@Ag對(duì)耐藥性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制。該合成的載藥體系PLGA@TPE@Ag對(duì)形態(tài)的破壞是明顯的，這一點(diǎn)也有可能是導(dǎo)致其細(xì)菌被抑制存活的主要機(jī)制。在毒性試驗(yàn)探究中，PLGA@TPE@Ag注射的小鼠的主要器官的HE染色結(jié)果展現(xiàn)較好的生理學(xué)特征，無(wú)任何的細(xì)胞凋亡、組織水腫和組織損傷情況。