南方紅豆杉天然居群葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量特征的變異規(guī)律

羅芊芊， 周志春， 鄧宗付， 喻龍華， 孫建軍， 徐剛標(biāo)

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室， 浙江 杭州 311400；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 3. 中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實驗中心， 江西 分宜 336600)

在長期的自然生長過程中，植物通過調(diào)節(jié)自身的資源配置適應(yīng)特定的生境，在不同生境下演化出各自特有的生長特性和物質(zhì)分配規(guī)律[1]。植物的表型性狀反映了基因型對環(huán)境變化的適應(yīng)性，分析植物表型性狀變異對研究植物的環(huán)境適應(yīng)性和演化有重要意義[2]，是植物遺傳多樣性研究的重要內(nèi)容之一[3]，并廣泛用于揭示植物天然居群的遺傳變異規(guī)律及地理分布格局[4-5]。植物葉片形態(tài)與其營養(yǎng)元素組成等一系列生理生態(tài)因子密切相關(guān)[6]，研究葉片氮磷化學(xué)計量特征有助于了解植物對外界環(huán)境的生長適應(yīng)策略[7]，其中，葉片氮磷比在指示生態(tài)系統(tǒng)限制性元素方面應(yīng)用廣泛[8]。

南方紅豆杉〔Taxuswallichianavar.mairei(Lemée et H. Lév.) L. K. Fu et Nan Li〕是集藥用、材用和觀賞于一體的珍稀瀕危樹種[9-11]，主要分布于中國東部和南部地區(qū)，其中，浙江、湖南、江西、福建和廣東等省的南方紅豆杉天然資源蘊藏量較多。南方紅豆杉幼樹生長需要特定的溫度、濕度和光照條件，但由于群落中喬木層郁閉度大、林內(nèi)光照有限，導(dǎo)致南方紅豆杉易出現(xiàn)小范圍聚集分布現(xiàn)象，其天然居群的個體多以老齡為主、幼齡為輔，幼齡個體的數(shù)量和生長速度難以支撐居群的擴展進程[12-13]。迄今為止，研究者已對南方紅豆杉的瀕危機制[14]、生理生態(tài)特征[15-16]、基因流[17]、基因克隆[18]和遺傳多樣性[19]等方面進行了深入研究。謝偉東[19]對南嶺山地南方紅豆杉天然居群遺傳多樣性的研究結(jié)果表明：南方紅豆杉不同居群間的分化程度較高，且葉片性狀在不同居群間存在顯著差異，這種差異可能與地理位置和氣候等因子有關(guān)，加之居群間和居群內(nèi)存在自然雜交，導(dǎo)致不同居群產(chǎn)生了不同程度的分化。

植物葉片的可塑性較大且對生境變化較敏感，生境的改變常導(dǎo)致葉片形態(tài)及氮磷化學(xué)計量特征的變化[20]。南方紅豆杉為典型的陰性樹種，對生境變化較為敏感。費永俊等[21]的觀察結(jié)果表明：當(dāng)南方紅豆杉由高海拔山地引種至低海拔平原湖區(qū)后，一些個體的葉片和孢子形態(tài)發(fā)生了變化，但其化學(xué)計量特征是否存在顯著差異仍沒有明確的研究結(jié)論。Du等[22]對全球171個地點優(yōu)勢樹種的葉片進行了研究，發(fā)現(xiàn)全球自然陸地生態(tài)系統(tǒng)(農(nóng)田、城市和冰川除外)中有18%的區(qū)域受到較強的氮限制，而43%的區(qū)域受到較強的磷限制，其他39%的區(qū)域則受氮和磷的共同限制或氮與磷任一元素的微弱限制?？傮w上看，氮限制在苔原、北方針葉林、溫帶針葉林以及山地草原和灌叢較為普遍；磷限制在熱帶及亞熱帶森林，溫帶闊葉林，沙漠和地中海植被，熱帶、亞熱帶和溫帶草原，以及稀樹草原和灌叢較為常見[22]。植物生長的限制性元素是否會隨生長環(huán)境不同而改變？這種變化在不同居群間是否具有普遍性？這些疑問均有待進一步研究。

對南方紅豆杉不同居群間葉片的表型性狀及氮磷化學(xué)計量特征的變異進行研究，不僅可以揭示環(huán)境變化對南方紅豆杉分布的影響，還可以為其生長的限制性元素研究提供參考依據(jù)，從而為南方紅豆杉天然居群的繁衍和保護提供幫助。作者以中國東部和南部地區(qū)分布的南方紅豆杉天然居群為研究對象，對葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)進行比較，從形態(tài)學(xué)、數(shù)量學(xué)和生態(tài)化學(xué)計量學(xué)等方面揭示葉片表型性狀在居群間和居群內(nèi)的變異狀況以及葉片氮磷化學(xué)計量指標(biāo)在居群間的差異，分析葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)以及地理-氣候因子間的相關(guān)關(guān)系，以期為南方紅豆杉種質(zhì)資源遺傳保育和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 研究區(qū)概況和研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于中國東部和南部，包括浙江省的臨安、麗水、江山和龍泉，湖南省的桑植、瀏陽、新晃和桂陽，江西省的婺源、銅鼓、分宜和信豐，福建省的南平、明溪、福州和武平，以及廣東省的樂昌和連州，共18個南方紅豆杉天然居群。地理位置為東經(jīng)109°05′～119°56′、北緯24°55′～30°01′，海拔300～990 m，供試各居群的地理-氣候概況見表1，各居群的經(jīng)度、緯度和海拔采用GPS記錄，氣象數(shù)據(jù)提取自DIVA-GIS的數(shù)據(jù)包。

研究區(qū)的地帶性植被為常綠及落葉闊葉林，土壤多為紅黃壤；居群內(nèi)的主要伴生樹種為毛竹〔Phyllostachysedulis(Carrière) J. Houzeau〕、杉木〔Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.〕和楓香樹(LiquidambarformosanaHance)等。

1.2 研究方法

1.2.1 樣株選擇和樣品采集 于2018年6月至7月，在18個南方紅豆杉天然居群中選擇株齡80～100 a的成年個體為樣株；為防止樣株間存在半胞親緣關(guān)系，樣株間距均大于30 m。根據(jù)居群的規(guī)模確定樣株數(shù)：若居群中成年植株數(shù)量少于或等于50株，全部作為樣株；若居群中成年植株數(shù)量多于50株，則隨機選擇50株作為樣株。18個居群共選擇樣株670株，各居群的樣株數(shù)見表1。

在各樣株冠層中部的向陽面，隨機采集無病蟲害的2年生葉片50 g，裝入塑封袋并置于冰盒中，帶回實驗室，于4 ℃保存、備用。因各居群的樣株分布較為分散，故未采集土樣。

1.2.2 表型性狀測定 每株隨機選取90枚完整葉片，分成3組，記為3次重復(fù)。采用Epson Perfection LA2400掃描儀〔愛普生(中國)有限公司〕掃描葉片，并采用WinRHIZO軟件測定葉片的葉長(葉基至葉尖的距離)、葉寬(葉片最寬處的寬度)、葉面積和葉周長，測量精度為0.01 cm；根據(jù)葉長和葉寬計算葉寬長比。

1.2.3 氮和磷含量測定 將掃描后的葉片以居群為單位混合，置于105 ℃下殺青30 min，然后于80 ℃烘干至恒質(zhì)量；冷卻后研磨，過2 mm篩，備用。

分別稱取各居群葉片干粉3份，每份2.0 g，共計54份樣品，采用凱氏定氮法[8]和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[23]檢測葉片中的氮和磷含量；根據(jù)葉片的氮和磷含量計算氮磷比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2016軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理；參照文獻[24]，采用SAS 8.0軟件中的GLM過程進行表型性狀方差分析；參照文獻[25]中的方法計算表型分化系數(shù)。

對葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)間以及葉片表型性狀與地理-氣候因子間的相關(guān)性進行分析，并依據(jù)葉片表型性狀對18個居群進行聚類分析。采用SPSS 10.0軟件進行多重比較(Duncan’s新復(fù)極差法)、相關(guān)性分析和聚類分析(中位數(shù)聚類法)，并計算各性狀的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

表1 南方紅豆杉18個天然居群的地理-氣候概況和樣株數(shù)

2 結(jié)果和分析

2.1 南方紅豆杉各居群間葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的差異

南方紅豆杉18個天然居群葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的比較結(jié)果見表2；各表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的方差分析結(jié)果見表3；各表型性狀的方差分量和表型分化系數(shù)見表4。

2.1.1 葉片表型性狀的比較 由表2可見：南方紅豆杉不同居群間葉片表型性狀差異明顯，葉長、葉寬、葉面積、葉周長和葉寬長比的變幅分別為2.32～3.00 cm、0.33～0.48 cm、0.64～1.12 cm2、5.43～7.03 cm和0.14～0.17，均值分別為2.62 cm、0.38 cm、0.81 cm2、6.11 cm和0.15；各性狀的變異系數(shù)為12.79%～29.56%，其中，葉寬的變異系數(shù)最小，葉寬長比的變異系數(shù)最大。

在供試的南方紅豆杉18個天然居群中，福建武平居群的葉長(3.00 cm)、葉寬(0.48 cm)、葉面積(1.12 cm2)和葉周長(7.03 cm)總體上顯著(P<0.05)大于其他17個居群，該居群的葉寬長比(0.16)也較大；浙江龍泉居群的葉長和葉周長最小(分別為2.32和5.43 cm)，浙江麗水居群的葉寬最小(0.33 cm)，湖南桂陽居群的葉面積最小(0.64 cm2)，浙江麗水、浙江江山、湖南瀏陽、江西婺源、江西分宜和江西信豐居群的葉寬長比最小(均為0.14)。

方差分析結(jié)果(表3)顯示：南方紅豆杉的葉長、葉寬、葉面積、葉周長和葉寬長比在居群間和居群內(nèi)的差異均達到極顯著(P<0.01)水平。

2.1.2 葉片氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的比較 由表2還可見：南方紅豆杉不同居群間葉片氮磷化學(xué)計量指標(biāo)也存在明顯差異，氮含量、磷含量和氮磷比的變幅分別為14.30～20.83 g·kg-1、0.96～1.61 g·kg-1和10.62～22.28，均值分別為17.81 g·kg-1、1.22 g·kg-1和14.94；各指標(biāo)的變異系數(shù)為11.13%～20.90%，其中，氮含量的變異系數(shù)最小，氮磷比的變異系數(shù)最大。

在供試的南方紅豆杉18個天然居群中，浙江臨安、江西分宜、江西信豐和廣東連州居群的葉片氮含量均在20.00 g·kg-1以上，且顯著高于除江西婺源外的其他居群；而福建明溪居群的葉片氮含量最低(14.30 g·kg-1)，且與其他居群差異顯著。江西婺源居群的葉片磷含量最高(1.61 g·kg-1)，且與其他居群差異顯著；而江西分宜和福建武平居群的葉片磷含量最低(0.96 g·kg-1)，且與多數(shù)居群差異顯著。江西分宜居群的葉片氮磷比最大，且與其他居群差異顯著；而浙江麗水居群的葉片氮磷比最小，且與多數(shù)居群差異顯著。

方差分析結(jié)果(表3)顯示：南方紅豆杉的葉片氮含量、磷含量和氮磷計量比在居群間的差異均達到極顯著水平。

表2 南方紅豆杉18個天然居群間葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的比較

表3 南方紅豆杉天然居群葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的方差分析結(jié)果1)

表4 南方紅豆杉天然居群葉片表型性狀的方差分量和表型分化系數(shù)

2.1.3 葉片表型性狀的方差分量和表型分化系數(shù)

由表4可見：南方紅豆杉天然居群葉片的5個表型性狀在居群間和居群內(nèi)的方差分量百分比均值分別為22.88%和51.54%，居群內(nèi)的方差分量百分比明顯大于居群間，說明南方紅豆杉葉片表型性狀的變異主要來源于居群內(nèi)。

從葉片5個表型性狀的居群間表型分化系數(shù)看，葉寬的居群間表型分化系數(shù)最大，為43.48%；而葉寬長比的居群間表型分化系數(shù)最小，僅為15.25%；各表型性狀的居群間表型分化系數(shù)均值為24.94%，說明南方紅豆杉天然居群葉片表型性狀的變異約25%來自居群間。

2.2 南方紅豆杉葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)以及地理-氣候因子間的相關(guān)性

南方紅豆杉天然居群葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)見表5；葉片表型性狀與地理-氣候因子間的相關(guān)系數(shù)見表6。

由表5可見：在南方紅豆杉葉片的5個表型性狀中，僅葉長與葉寬長比無顯著相關(guān)性，其他表型性狀間均極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)正相關(guān)，說明葉片較長，葉片的寬度和面積也較大。在3個氮磷化學(xué)計量指標(biāo)中，氮磷比與氮含量顯著正相關(guān)，與磷含量極顯著負相關(guān)，但氮含量與磷含量無顯著相關(guān)性。在表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)間，僅氮磷比與葉長顯著負相關(guān)，并與葉面積和葉周長顯著正相關(guān)，氮含量和磷含量與各表型性狀均無顯著相關(guān)性，說明葉片氮磷比越大葉片越寬大。

由表6可見：葉片各表型性狀與年均溫、最冷月最低溫、年均降水量、最濕月降水量和最干月降水量無顯著相關(guān)性，與緯度和海拔也無顯著相關(guān)性，但葉長、葉面積和葉周長與經(jīng)度顯著負相關(guān)，說明隨經(jīng)度增大葉片趨于短??；葉寬長比與最熱月最高溫極顯著負相關(guān)，說明隨最熱月最高溫增高葉片趨于細長。

表5 南方紅豆杉天然居群葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)1)

表6 南方紅豆杉天然居群葉片表型性狀與地理-氣候因子間的相關(guān)系數(shù)1)

2.3 南方紅豆杉天然居群的聚類分析結(jié)果

基于南方紅豆杉18個天然居群的5個葉片表型性狀進行聚類分析，結(jié)果見圖1。由圖1可見：在歐氏距離15處，可將18個居群分為2類，第1類包含10個居群，第2類包含8個居群；在歐氏距離8處，可進一步將第1類分為2個亞類(第1和第2亞類)，第2類分為3個亞類(第3、第4和第5亞類)。

P1： 浙江臨安Lin’an of Zhejiang； P2： 浙江麗水Lishui of Zhejiang； P3： 浙江江山Jiangshan of Zhejiang；P4： 浙江龍泉Longquan of Zhejiang； P5： 湖南桑植Sangzhi of Hunan； P6： 湖南瀏陽Liuyang of Hunan； P7： 湖南新晃Xinhuang of Hunan； P8： 湖南桂陽Guiyang of Hunan； P9： 江西婺源Wuyuan of Jiangxi； P10： 江西銅鼓Tonggu of Jiangxi； P11： 江西分宜Fenyi of Jiangxi； P12： 江西信豐Xinfeng of Jiangxi； P13： 福建南平Nanping of Fujian； P14： 福建明溪Mingxi of Fujian； P15： 福建福州Fuzhou of Fujian； P16： 福建武平Wuping of Fujian； P17： 廣東樂昌Lechang of Guangdong； P18： 廣東連州Lianzhou of Guangdong.

第1亞類包括湖南瀏陽、福建明溪、浙江臨安、廣東樂昌、浙江麗水、浙江江山和福建南平7個居群；第2亞類包括湖南桂陽、福建福州和浙江龍泉3個居群；第3亞類包括江西銅鼓、廣東連州、江西婺源、湖南桑植和江西分宜5個居群；第4亞類包括湖南新晃和江西信豐2個居群；第5亞類僅包含福建武平1個居群。地理位置相鄰的居群不能完全聚在一起，但總體上看，第1類中的居群大多位于浙江省和福建省，第2類中的居群大多位于江西省。

3 討論和結(jié)論

上述研究結(jié)果顯示：南方紅豆杉天然居群的葉片表型性狀無論是在居群間還是居群內(nèi)均存在極顯著(P<0.01)差異，其葉片氮磷化學(xué)計量指標(biāo)在居群間也存在極顯著差異，表明南方紅豆杉葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量存在豐富的地理變異。福建武平居群的南方紅豆杉葉長、葉寬、葉面積和葉周長總體上顯著(P<0.05)大于其他居群，這可能與該居群的生境有關(guān)。該居群位于福建省梁野山國家級自然保護區(qū)內(nèi)海拔800～1 050 m的區(qū)域，土壤類型為山地黃紅壤，林地土層、腐殖質(zhì)層和地表枯枝落葉層較厚，林下土壤自然肥力高，且該區(qū)域雨量充沛、水力資源較為豐富，這些立地條件均有利于南方紅豆杉葉片生長。南方紅豆杉葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)的變異系數(shù)變幅較大(11.13%～29.56%)，且以葉寬長比的變異系數(shù)最大，表明該性狀可塑性最大，易受到個體發(fā)育和生境的雙重影響。

南方紅豆杉葉片表型性狀的表型分化系數(shù)均值為24.94%，居群內(nèi)方差分量百分比明顯大于居群間，說明居群內(nèi)變異是其表型性狀變異的主要來源。陳潔[26]認為，異花授粉有利于植物居群間基因流動和遺傳物質(zhì)交換，南方紅豆杉以風(fēng)媒傳粉、異交為主，種子有紅色肉質(zhì)假種皮，對鳥類、嚙齒動物有一定吸引作用，這些繁殖特性推進了其基因流動，從而降低了遺傳漂變對居群遺傳結(jié)構(gòu)的影響，而頻繁的基因交流有助于維持居群內(nèi)較高的遺傳變異水平。南方紅豆杉葉片的表型性狀在居群間和居群內(nèi)都存在極顯著差異，這些差異是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果。

基于居群水平的表型變異分析，在空間尺度上研究特定植物類群的表型性狀與地理-氣候因子間的關(guān)系，往往可以更準(zhǔn)確地揭示植物變異格局[27]。通常情況下，經(jīng)緯度和海拔的梯度變化能夠綜合反映氣溫、降水和植被等環(huán)境因子的作用[28]。本研究結(jié)果顯示：南方紅豆杉的葉長、葉面積和葉周長在地理空間上呈現(xiàn)以經(jīng)度為主的單一變異模式，浙江省和福建省內(nèi)的居群葉片較江西省內(nèi)的居群葉片短小，這種在北半球隨內(nèi)陸向海洋過渡引起的地理經(jīng)向變異規(guī)律在尾葉櫻桃〔Cerasusdielsiana(Schneid.) Yü et Li〕[25]和紅椿(ToonaciliateRoem.)[29]等植物種類中也有過報道，通常反映了水分和溫度的梯度變化。劉從等[1]認為，植物體通常能夠通過改變生物量分配和形態(tài)變化來適應(yīng)環(huán)境的改變，即形態(tài)可塑性。植株葉片變短小，有利于削弱植物自身的邊界阻力，增強葉片邊緣對光熱和CO2的傳導(dǎo)能力，進而降低呼吸和蒸騰的成本，使較小的葉片對生境中光熱的變化適應(yīng)性更強[30]。在南方紅豆杉5個葉片表型性狀中，葉寬長比與最熱月最高溫極顯著負相關(guān)，而與年均溫、最冷月最低溫、年均降水量、最濕月降水量和最干月降水量均無顯著相關(guān)性，表明最熱月最高溫是推動南方紅豆杉葉片表型性狀變異的主要氣候因子，也進一步驗證了氣溫對植株葉片的生長具有較大影響。南方紅豆杉各葉片表型性狀與緯度均無顯著相關(guān)性，可能與居群分布地的緯度跨度遠小于經(jīng)度跨度且涉及的葉片表型性狀數(shù)量較少有關(guān)。此外，本研究僅進行了1個年份的采樣分析，沒有年份間重復(fù)采樣，因此，需適當(dāng)增加采樣點和表型性狀數(shù)量并進行年份間的重復(fù)研究，以獲得更為可靠的研究結(jié)果。

除氣候因子外，氮、磷元素對植株葉片生長也有較大影響[28]。研究結(jié)果表明：在供試的南方紅豆杉18個天然居群中，浙江省和福建省內(nèi)的居群葉片較江西省內(nèi)的居群葉片短小，且浙江麗水、浙江江山、浙江龍泉、湖南桂陽、江西婺源、福建明溪和福建福州居群的葉片氮磷比均小于14，表明這些居群的植株葉片生長主要受氮元素限制[31]。而湖南瀏陽、江西銅鼓、江西分宜、江西信豐和福建武平居群的葉片氮磷比均大于16，表明這些居群的植株葉片生長主要受磷元素限制。

由于地理位置和環(huán)境因子的影響，植物會形成連續(xù)變異、區(qū)域板塊變異以及隨機變異等多種地理變異模式[29]。聚類分析結(jié)果顯示：在供試的南方紅豆杉18個天然居群中，湖南新晃、江西信豐和福建武平3個居群的葉長、葉寬、葉面積和葉周長均大于其他居群，聚在第2類的第4和第5亞類；而湖南桂陽、福建福州和浙江龍泉3個居群的葉長、葉寬、葉面積和葉周長較小，且他們的地理位置不相鄰，聚在第1類的第2亞類，這2類居群基本上都是地理距離較遠的間隔居群。湖南瀏陽、福建明溪、浙江臨安、廣東樂昌、浙江麗水、浙江江山和福建南平7個居群的葉片表型性狀值均較小，聚在第1類的第1亞類；而江西銅鼓、廣東連州、江西婺源、湖南桑植和江西分宜5個居群的葉片表型性狀值均較大，聚在第2類的第3亞類，這2類居群中既有地理位置相鄰的居群，也有地理不相鄰的居群。因而，南方紅豆杉葉片表型性狀的地理變異既存在區(qū)域板塊變異也存在隨機變異，且大多為隨機變異，形成這一現(xiàn)象的原因與居群分布的地理隔離有關(guān)，地理隔離導(dǎo)致種子和花粉難以在居群間傳播，即使居群間地理距離較近，但基因交流較少；此外，居群的局部小氣候復(fù)雜多變，環(huán)境的異質(zhì)性也增大了居群間的分化程度。

綜上所述，南方紅豆杉天然居群葉片的表型性狀和氮磷化學(xué)計量指標(biāo)存在明顯的地理變異，這些地理變異大多為隨機變異。葉長、葉面積和葉周長這3個葉片表型性狀在地理空間上呈現(xiàn)以經(jīng)度為主的單一變異模式。隨經(jīng)度增大葉片趨于短小，葉片氮磷比越大葉片越寬大。葉片表型性狀的變異主要來源于居群內(nèi)，以葉寬長比的可塑性最大，易受到個體發(fā)育和生境的雙重影響。

致謝：感謝中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心曾平生高級工程師、姚甲寶高級工程師、厲月橋高級工程師、劉素貞助理工程師和張利利工程師等對本研究提供的幫助！