通絡(luò)清腦注射粉針對腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦保護作用及神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達的影響研究

陳琰琰，張業(yè)昊，徐立，姚明江，王光蕊，宋文婷*

腦卒中是一類急性腦血管疾病，俗稱“中風(fēng)”，又稱腦血管意外，多由腦部血管突然破裂出血或閉塞而導(dǎo)致血液不能有效灌注腦組織造成，可分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占87%［1］。缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高等特點，會給患者、患者家庭及社會帶來沉重負擔(dān)。腦缺血-再灌注損傷指腦缺血后缺血部位腦組織結(jié)構(gòu)及功能遭受不同程度破壞，但再灌注后部分恢復(fù)血流供應(yīng)的腦組織反而出現(xiàn)更嚴重的功能損傷，并可導(dǎo)致腦組織損傷加重、神經(jīng)元凋亡增多［2］。

通絡(luò)清腦注射粉針由三七總皂苷、黃芩苷、梔子苷組成，其中三七總皂苷的主要功效為活血止血、化瘀通絡(luò)，黃芩苷和梔子苷的主要功效為清熱燥濕、瀉火解毒，由于三者配伍能有效清除淤堵在腦絡(luò)中的“熱毒”，因此通絡(luò)清腦注射粉針治療缺血性腦卒中符合中醫(yī)采用清熱解毒通絡(luò)法治療腦缺血的原則。既往研究表明，通絡(luò)清腦注射粉針治療腦缺血損傷的療效確切［3］，并可有效減輕星形膠質(zhì)細胞腫脹［4］，抑制氨基酸的過量釋放［5］及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）的釋放，進而減輕腦缺血-再灌注損傷大鼠腦水腫癥狀［6］，但通絡(luò)清腦注射粉針的腦保護作用是否與調(diào)控神經(jīng)元自噬相關(guān)，目前尚未見相關(guān)研究報道。本研究旨在探討通絡(luò)清腦注射粉針對腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦保護作用及神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達的影響，以期從神經(jīng)元自噬角度闡釋通絡(luò)清腦注射粉針可能的腦保護作用機制。

本研究背景：

中醫(yī)辨證理論認為，“中風(fēng)”（缺血性腦卒中）以氣虛血瘀型、毒損腦絡(luò)型多見，其中毒損腦絡(luò)型主要采用清熱解毒通絡(luò)療法。筆者所在課題組前期研究證實，通絡(luò)清腦注射粉針治療大鼠腦缺血具有良好療效，提示清熱解毒通絡(luò)療法在只辨病、不辨證的情況下亦能取得良好療效；鑒于細胞自噬所致神經(jīng)元凋亡是腦缺血后神經(jīng)損傷的重要環(huán)節(jié)，因此推測通絡(luò)清腦注射粉針發(fā)揮腦保護作用的機制很可能與抑制細胞自噬有關(guān)。

本研究創(chuàng)新點及價值：

本研究以神經(jīng)元自噬為切入點，通過分析通絡(luò)清腦注射粉針對腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦保護作用及神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達的影響發(fā)現(xiàn)，其發(fā)揮腦保護作用的機制可能與抑制神經(jīng)元過度自噬有關(guān)，這不僅為缺血性腦卒中的臨床治療提供了新的理論依據(jù)與可行思路，也在一定程度上豐富了中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2019年1月—2020年3月實施，共選取SPF級、體質(zhì)量為200～220 g的成年雄性SD大鼠36只，均由維通利華（北京）實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑 通絡(luò)清腦注射粉針（生產(chǎn)廠家：河北神威藥業(yè)，生產(chǎn)批號：111100，規(guī)格：375 mg/支）；抗Beclin1抗體（Ab210498）購自美國ABCAM公司；抗自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3A/3B（LC3A/LC3B）抗體（12741S）、抗磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）抗體（3033S）、抗核因子-κB（NF-κB）抗體（8242S）均購自美國CST公司；抗β-actin抗體（AF7012）、電泳緩沖液（HX1896）、轉(zhuǎn)膜液（HX1895）、羊抗兔二抗（HX2040）、羊抗鼠二抗（HX2032）、蛋白酶抑制劑（HX1863）、蛋白磷酸酶抑制劑（HX1864）、強效放射性免疫沉淀法分析（RIPA）裂解液（HX1862）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）非還原性蛋白上樣緩沖液（HXN1891）、牛血清白蛋白（Albumin Bovine V）（HX3304）購自華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白（Thermo26620）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）超敏發(fā)光液（Thermo34095）購自美國賽默飛公司。

1.3 儀器與設(shè)備 奧豪斯AR2130型電子天平，感量：1 mg；尼龍栓線（2432-A1）（北京西濃科技有限公司）；Synergy 4型酶標儀；多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)（MPIAS-500）；IEC低溫冷凍離心機（美國Thermo公司）；電子顯微鏡H-7500（日本日立家電有限公司）；轉(zhuǎn)移電泳槽（Mini Trans-Blot Transfer Cell，BIO-RAD公司）；垂直板電泳槽（Mini-PROTEAN3 cell，BIO-RAD公司）；DYY-10型電泳儀（北京六一儀器廠）；TS-1型脫色搖床（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；Bio-Rad凝膠成像儀（BIO-RAD公司）；Bio-Rad Image LabTM XRS+凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（BIO-RAD公司）；Image J圖像分析軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）。

1.4 動物分組與造模方法 將36只SD大鼠編號后采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、通絡(luò)清腦組，每組12只。采用線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注損傷模型（假手術(shù)組大鼠只進行血管分離、不進行其他操作）：（1）采用4.0%水合氯醛（100 mg/kg）經(jīng)腹腔注射進行麻醉，麻醉滿意后使大鼠取仰臥位并固定于恒溫電熱毯上，溫度維持在37 ℃左右；（2）分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈并采用絲線打活結(jié)以結(jié)扎頸外動脈、頸總動脈，使之暫時阻斷，并采用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠心端；（3）于頸外動脈做 “V”形切口，插入直徑約為0.24 mm、一端為光滑球形的尼龍線栓，直至有明顯阻力（表明尼龍線栓已到達大腦中動脈起始部），一般插入深度為（20.0±0.5）mm，可造成大鼠大腦中動脈阻塞性缺血；（4）采用0.9%氯化鈉溶液將通絡(luò)清腦注射粉針配制成濃度為18.75 mg/ml的溶液，通絡(luò)清腦組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢推注該通絡(luò)清腦溶液3.2 ml/kg，假手術(shù)組和模型組大鼠經(jīng)尾靜脈緩慢推注等體積0.9%氯化鈉溶液；（5）1.5 h后向外輕拉尼龍線栓，至略有阻力后停止提拉以實現(xiàn)再灌注。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 采用單盲法、ZeaLonga評分標準評估三組大鼠建模24 h后神經(jīng)功能：無神經(jīng)損傷癥狀計0分；不能完全伸展腦缺血對側(cè)前肢計1分；出現(xiàn)向腦缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈行為計2分；行走向腦缺血對側(cè)傾倒計3分；不能自發(fā)行走、處于昏迷狀態(tài)計4分。剔除神經(jīng)功能學(xué)評分為0、4分（除外假手術(shù)組）及死亡大鼠，并在后續(xù)實驗中選擇同批次購買的體質(zhì)量接近的大鼠補足實驗動物數(shù)量，維持每組大鼠數(shù)量為12只。

1.5.2 腦梗死體積占比 完成ZeaLonga評分后從每組各選取4只大鼠，麻醉后經(jīng)腹主動脈取血、安樂死后斷頭取腦，采用0.9%氯化鈉溶液涮去表面血污、置于冰上并將其平均切成5個腦片；將腦片置于2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中進行染色，37 ℃條件下避光孵育15 min后采用磷酸鹽緩沖液（PBS）終止孵育；將染色（TTC可與活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)而將非缺血區(qū)染成玫瑰紅色，缺血區(qū)則為蒼白色）后的腦片置于4%甲醛溶液中進行固定，采用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行拍照、記錄，采用Image J圖像分析軟件進行分析并計算腦梗死體積占比。

1.5.3 海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況 再灌注24 h后從每組各選取4只大鼠并采用HE染色法觀察海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況。HE染色法：經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛麻醉大鼠，安樂死后斷頭取腦并置入固定液中固定24 h以使細胞蛋白質(zhì)變性；固定完成后對腦組織進行修剪并將修剪后的腦組織置于包埋盒內(nèi)，先采用蒸餾水進行沖洗以去除腦組織中的固定液，再依次行脫水、透明、石蠟包埋、切片；切片先采用二甲苯脫蠟，再采用梯度濃度乙醇復(fù)水、蒸餾水沖洗、蘇木素染液染色15 min；采用自來水洗去切片上的蘇木素染液后以1%鹽酸乙醇分化15 s并置于自來水中浸泡10 min，之后取出切片并置入伊紅染液中染色3 min，再之后采用蒸餾水沖洗3 s并置入梯度濃度乙醇內(nèi)脫水，最后采用二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.5.4 海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)自噬體形成情況、海馬區(qū)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達情況 再灌注24 h后從每組各選取4只大鼠并進行安樂死、斷頭取腦，于海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)距缺血中心外側(cè)緣1 mm處取一米粒大小腦組織并置于2.5%戊二醛溶液中固定2 h，采用PBS終止固定后再采用1%鋨酸溶液固定1 h、PBS終止固定；將固定好的腦組織小塊進行丙酮梯度脫水及環(huán)氧樹脂梯度滲透、包埋，并進行超薄切片；采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對切片進行染色并由不知曉實驗設(shè)計的研究人員在透射顯微鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)及視野中完整的自噬體。

同時稱取三組大鼠海馬區(qū)腦組織（100±5）mg，采用免疫印跡法（Western-bloting）檢測海馬區(qū)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達情況，具體操作如下：（1）將稱取的海馬區(qū)腦組織分別先置于編有序號的Eppendorf微量離心管（EP）管內(nèi)并加入強效RIPA裂解液1 ml、蛋白酶抑制劑20 μl、蛋白磷酸酶抑制劑10 μl，再置于冰上并進行超聲裂解；（2）裂解充分后置于IEC低溫冷凍離心機并在4 ℃條件下以12 000 r/min（離心半徑84 mm）的速率離心5 min，取上清液；（3）采用bradford法進行蛋白定量，即將蛋白加入5×上樣緩沖液并斡旋混勻、100 ℃水浴加熱3 min使蛋白變性，之后置于-80 ℃冰箱保存或直接進行實驗操作；（4）采用聚丙烯酰胺凝膠將蛋白樣品進行電泳分離并轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；（5）采用5% Albumin Bovine V封閉液封閉1 h，加入采用5% Albumin Bovine V配置的一抗、β-actin抗體（1∶5 000）、Beclin1抗體（1∶2 000）、LC3A/LC3B抗體（1∶2 000）、p-NF-κB抗體（1∶1 000）、NF-κB抗體（1∶2 000），之后置于搖床并在4 ℃條件下孵育過夜，采用含有0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）漂洗5次（5 min/次）并加入二抗、山羊抗兔辣根過氧化物酶免疫球蛋白IgG-HRP（1∶10 000）、山羊抗鼠 IgG-HRP（1∶10 000），再置于搖床并在室溫條件下孵育1.5 h，最后采用PBST漂洗5次（5 min/次）；（6）采用ECL超敏發(fā)光液、Bio-Pro凝膠成像儀進行顯色成像，并采用Bio-Rad Image LabTM XRS+凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，計算各組大鼠目的蛋白p-NF-κB、Beclin1、LC3相對表達量，即p-NF-κB灰度值與NF-κB灰度值比值、Beclin1灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值、LC3灰度值與LC3B灰度值比值。上述操作每組重復(fù)4次（每只大鼠操作1次）取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 建模24 h后假手術(shù)組、模型組、通絡(luò)清腦組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分分別為0、（2.3±0.8）、（1.6±0.5）分；三組大鼠建模24 h后神經(jīng)功能學(xué)評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.34，P=0.010），提示腦缺血-再灌注損傷模型制備成功。模型組、通絡(luò)清腦組大鼠建模24 h后神經(jīng)功能學(xué)評分高于假手術(shù)組（q值分別為0.30、0.50，P值分別為0.001、0.001），而通絡(luò)清腦組大鼠建模24 h后神經(jīng)功能學(xué)評分低于模型組（q=0.50，P=0.020），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 腦梗死體積 建模24 h后假手術(shù)組大鼠腦組織呈均勻玫瑰紅色，未見蒼白缺血區(qū)；模型組大鼠腦組織可見蒼白缺血區(qū)，通絡(luò)清腦組大鼠腦組織蒼白缺血區(qū)明顯減少（見圖1）。建模24 h后假手術(shù)組、模型組、通絡(luò)清腦組大鼠腦梗死體積占比分別為0、（25.17±6.12）%、（15.62±4.83）%。三組大鼠建模24 h后腦梗死體積占比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.26，P＜0.05）；模型組、通絡(luò)清腦組大鼠建模24 h后腦梗死體積占比高于假手術(shù)組（q值分別為0.26、0.35，P值分別為0.001、0.001），而通絡(luò)清腦組大鼠建模24 h后腦梗死體積占比低于模型組（q=0.40，P=0.040），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 三組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果Figure 1 TTC staining results of cerebral tissues among the three groups of rats

2.3 海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況 再灌注24 h后假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列緊密、數(shù)量豐富、形態(tài)正常，胞質(zhì)淡染，胞核大而圓，未見明顯壞死；模型組大鼠海馬區(qū)缺血區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞嚴重，大量神經(jīng)元丟失，胞質(zhì)嗜伊紅濃染，胞核固縮；與模型組相比，通絡(luò)清腦組大鼠海馬區(qū)缺血區(qū)神經(jīng)元壞死范圍縮小，神經(jīng)元增多，細胞結(jié)構(gòu)相對完整，胞核固縮減少，神經(jīng)元損傷明顯緩解（見圖2～3）。

圖2 三組大鼠再灌注24 h后海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況（HE染色，×100）Figure 2 Neuron injury in hippocampus among the three groups of rats 24 hours after reperfusion

圖3 三組大鼠再灌注24 h后海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況（HE染色，×200）Figure 3 Neuron injury in hippocampus among the three groups of rats 24 hours after reperfusion

2.4 海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)自噬體形成情況 再灌注24 h后假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均偶見自噬體，胞質(zhì)內(nèi)有少量空泡；模型組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均可見雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡且胞質(zhì)稀疏；通絡(luò)清腦組海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)自噬體數(shù)量均減少，胞質(zhì)內(nèi)有少量空泡且胞質(zhì)稀疏（見圖4～5）。

圖4 三組大鼠再灌注24 h后海馬區(qū)自噬體形成情況Figure 4 Autophagy bodies in hippocampus（indicated by the arrowhead）among the three groups of rats 24 hours after reperfusion

圖5 三組大鼠再灌注24 h后皮質(zhì)區(qū)自噬體形成情況（箭頭所指處）Figure 5 Autophagy bodies in cortex（indicated by the arrowhead）among the three groups of rats 24 hours after reperfusion

2.5 海馬區(qū)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達情況 再灌注24 h后三組大鼠海馬區(qū)p-NF-κB、Beclin1、LC3相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；再灌注24 h后模型組、通絡(luò)清腦組大鼠海馬區(qū)p-NF-κB（q值分別為29.29、9.01）、LC3相對表達量（q值分別為29.56、11.89）及模型組Beclin1相對表達量（q=12.38）高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而通絡(luò)清腦組與假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)Beclin1相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=2.85，P＞0.05）；再灌注24 h后通絡(luò)清腦組大鼠海馬區(qū)p-NF-κB（q=20.28）、Beclin1（q=9.53）、LC3（q=17.67）相對表達量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表1、圖6）。

圖6 三組大鼠海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白電泳圖Figure 6 Electrophoretogram for autophagy related proteins in hippocampus among three groups of rats

表1 三組大鼠再灌注24 h后海馬區(qū)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of expressions of neuronic autophagy-related proteins in hippocampus among three groups of rats 24 hours after reperfusion

表1 三組大鼠再灌注24 h后海馬區(qū)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of expressions of neuronic autophagy-related proteins in hippocampus among three groups of rats 24 hours after reperfusion

注：p-NF-κB=磷酸化核因子-κB，LC3=自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) p-NF-κB Beclin1 LC3假手術(shù)組 4 0.088±0.031 0.083±0.013 0.143±0.038模型組 4 1.070±0.106a 0.170±0.018a 0.690±0.042a通絡(luò)清腦組 4 0.390±0.036ab 0.103±0.010b 0.363±0.030ab F值 224.99 42.02 221.29 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認為，缺血性腦卒中屬“中風(fēng)”范疇，主要由“痰瘀”而引發(fā)［7］：“痰”“淤”相互轉(zhuǎn)化、消長，津液凝滯則生濁痰，濁痰久積入脈則生淤血，痰淤內(nèi)阻脈絡(luò)而生郁熱，津血過熱則濁，濁而凝滯又生痰；痰閉神竅、脈絡(luò)阻塞、氣血上沖于腦而引發(fā)“中風(fēng)”。因此，“中風(fēng)”的治療應(yīng)以活血化瘀為主，以通暢血脈、消散瘀滯；輔以清熱利濕之藥，以清泄體內(nèi)郁熱、通調(diào)水道，祛除濕熱痰邪。三七具有活血化瘀、養(yǎng)血定痛功效，黃芩具有清熱燥濕、涼血解毒功效，梔子具有清熱利濕、瀉火除煩功效，三者配伍可用于消除“中風(fēng)”患者痰、淤、郁熱等；通絡(luò)清腦注射粉針主要有效成分三七總皂苷、黃芩苷、梔子苷即分別來自三七、黃芩、梔子?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，通絡(luò)清腦注射粉針具有改善血液循環(huán)、抑制血栓形成、減輕神經(jīng)元損傷等作用，其中三七總皂苷不僅可改善血瘀大鼠血液流變學(xué)指標［8］、減輕Ca2+超載［9］，還可修復(fù)阿爾茨海默病大鼠受損神經(jīng)元［10］；黃芩苷可抑制腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)元凋亡，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)所致?lián)p傷［11］，清除自由基［12］；梔子苷可抑制血小板聚集［13］。

及時恢復(fù)缺血腦組織血液供應(yīng)是目前臨床治療缺血性腦卒中的主要方法，但缺血半暗帶血流供應(yīng)恢復(fù)反而會使缺血腦組織神經(jīng)元損傷加重、凋亡增多，造成腦缺血-再灌注損傷。腦缺血-再灌注損傷是缺血性腦卒中患者重要的病理生理過程，也是影響缺血性腦卒中患者預(yù)后的不可忽略的問題之一［14］。本研究結(jié)果顯示，建模24 h后假手術(shù)組大鼠腦組織未見蒼白缺血區(qū)且再灌注24 h后海馬區(qū)神經(jīng)元未見明顯壞死，而建模24 h后模型組大鼠腦組織可見蒼白缺血區(qū)且再灌注24 h后海馬區(qū)缺血區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞嚴重、大量神經(jīng)元丟失，但建模24 h后通絡(luò)清腦組大鼠腦組織蒼白缺血區(qū)明顯減少且再灌注24 h后海馬區(qū)缺血區(qū)神經(jīng)元壞死范圍明顯縮小、神經(jīng)元損傷明顯緩解；同時，模型組、通絡(luò)清腦組大鼠建模24 h后神經(jīng)功能學(xué)評分、腦梗死體積占比均高于假手術(shù)組，而通絡(luò)清腦組大鼠建模24 h后神經(jīng)功能學(xué)評分、腦梗死體積占比均低于模型組，提示通絡(luò)清腦注射粉針可有效改善腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能，減輕腦梗死程度、神經(jīng)元損傷，減少自噬體形成及神經(jīng)元凋亡，具有一定腦保護作用。

細胞自噬指自噬溶酶體對胞內(nèi)異物、受損或衰老的細胞器進行吞噬、降解的過程，對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。正常情況下細胞自噬處于較低水平，在缺血缺氧、營養(yǎng)缺乏及氧化應(yīng)激等情況下細胞自噬水平明顯升高以清除自由基、受損細胞器及未折疊蛋白，但細胞自噬的過度激活會啟動神經(jīng)元凋亡，即由半胱天冬酶介導(dǎo)的程序性細胞死亡［15］。近年研究表明，細胞自噬參與了腦缺血的病理生理過程［16］。本研究結(jié)果顯示，再灌注24 h后假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均偶見自噬體，而模型組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均可見雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，但通絡(luò)清腦組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)自噬體數(shù)量均較模型組減少，提示正常大鼠腦組織存在細胞自噬，腦缺血-再灌注損傷會激活大鼠神經(jīng)元自噬并促使其神經(jīng)元凋亡，而通絡(luò)清腦注射粉針可抑制腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)元自噬的過度激活，減少神經(jīng)元凋亡。

自噬相關(guān)蛋白是在自噬相關(guān)基因（ATG）調(diào)控下轉(zhuǎn)錄、合成的一組參與自噬體形成至降解全過程的蛋白質(zhì)，其主要作用是調(diào)控細胞自噬過程。ATG最早于酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，目前為止已在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)11種ATG同源基因，其中ATG6被命名為Beclin1，而ATG8被命名為LC3［17］。Beclin1是首個被發(fā)現(xiàn)的參與哺乳動物細胞自噬的關(guān)鍵因子，后發(fā)現(xiàn)其也參與了自噬體膜的形成、對細胞自噬具有正向調(diào)控作用；有研究表明，腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)元內(nèi)Beclin1表達量明顯上調(diào)并可激活細胞自噬，誘導(dǎo)細胞凋亡［18］。LC3主要以LC3A和LC3B兩種形式存在，正常情況下細胞內(nèi)LC3以胞質(zhì)不溶性LC3A的形式存在，細胞自噬時LC3A與磷脂酰乙醇胺結(jié)合成為LC3B并參與自噬體膜形成，且LC3B含量與自噬體數(shù)量呈正比，因此，LC3B含量可在一定程度上反映細胞自噬程度［19］。既往研究表明，腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)元自噬增強，缺血區(qū)腦組織LC3B表達明顯上調(diào)，并會于缺血再灌注24 h時達到峰值［20-21］?，F(xiàn)階段，Beclin1、LC3B被認為是細胞自噬的特異性標志物［22］，且其表達量可反映細胞自噬水平。NF-κB是一類能通過與細胞內(nèi)特異性核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄、表達的蛋白質(zhì)，缺血、缺氧刺激均會促使游離NF-κB進入胞核并參與調(diào)控細胞自噬，進而使Beclin1、LC3表達上調(diào)并誘導(dǎo)細胞自噬［23］。

有研究表明，缺血預(yù)處理及腦缺血早期誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬有利于消除積累在神經(jīng)元內(nèi)的受損蛋白，提高神經(jīng)元存活率，有利于減輕腦缺血-再灌注損傷［24］，但細胞自噬是把“雙刃劍”，其對腦缺血-再灌注損傷的影響還會受造模時間、缺血階段、觀察部位、給藥劑量等的影響；另有研究表明，抑制腦缺血后的過度神經(jīng)元自噬是具有保護作用的，而清熱類藥物可通過抑制神經(jīng)元自噬而發(fā)揮腦保護作用，犀角地黃湯、葛根可通過下調(diào)Beclin1、LC3的表達而抑制神經(jīng)元自噬、減輕腦缺血再灌注所致神經(jīng)元損傷［25-26］。本研究結(jié)果顯示，模型組、通絡(luò)清腦組大鼠海馬區(qū)p-NF-κB、LC3相對表達量及模型組Beclin1相對表達量高于假手術(shù)組，通絡(luò)清腦組大鼠海馬區(qū)p-NF-κB、Beclin1、LC3相對表達量低于模型組，提示腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)元自噬水平升高，而通絡(luò)清腦注射粉針可有效抑制腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)元的過度自噬，緩解腦缺血-再灌注損傷，這可能是通絡(luò)清腦注射粉針發(fā)揮腦保護作用的重要機制。

綜上所述，通絡(luò)清腦注射粉針可有效改善腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能，減輕腦梗死程度、神經(jīng)元損傷，減少自噬體形成及神經(jīng)元凋亡，抑制神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白p-NF-κB、Beclin1、LC3的表達，其發(fā)揮腦保護作用的機制可能與抑制神經(jīng)元過度自噬有關(guān)，但本研究未設(shè)置陽性對照組（自噬抑制劑組），今后的實驗中可增設(shè)陽性對照組以進一步闡明通絡(luò)清腦注射粉針腦保護作用與抑制神經(jīng)元過度自噬的相關(guān)性。

作者貢獻：陳琰琰進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，文獻資料收集與整理，撰寫論文；張業(yè)昊、徐立、姚明江、王光蕊提供實驗技術(shù)支持；宋文婷負責(zé)實驗的可行性分析、文章質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。