血漿SEPT9甲基化檢測對結(jié)直腸癌診斷價值的臨床研究

吳秀方，南瓊，張曉紅，耿婷，陳紫紅

結(jié)直腸癌（CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率，自20世紀(jì)90年代初以來，其在年輕人中的發(fā)病率幾乎增加了1倍［1］。CRC早期的臨床表現(xiàn)不典型，多數(shù)患者就診時已錯過了最佳手術(shù)時機(jī)，且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為10%左右［2］，因此盡早發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸的癌前病變和早期癌變并積極進(jìn)行干預(yù)對降低CRC的病死率十分重要。

在先前的研究中已報道了幾種基于DNA甲基化的CRC生物標(biāo)志物，其中SEPT9甲基化（mSEPT9）被認(rèn)為是檢測CRC有前途的標(biāo)志物之一［3］。SEPT9位于染色體17q25.3處，可編碼在細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用的SEPT9蛋白，而該蛋白能夠防止細(xì)胞過快分裂或以不受控制的方式增殖，具有抑癌作用，當(dāng)SEPT9啟動子區(qū)域甲基化時，可阻止SEPT9蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致CRC的發(fā)生發(fā)展［4］。在CRC發(fā)生和發(fā)展過程中，mSEPT9 DNA從壞死性和凋亡性癌細(xì)胞釋放到外周血中，因此，可以通過檢測外周血SEPT9特定啟動子區(qū)域的DNA甲基化程度來確定CRC發(fā)生風(fēng)險。本研究檢測了患者血漿mSEPT9與血清癌胚抗原（CEA），對二者在早期癌和進(jìn)展期癌患者中的陽性率進(jìn)行對比分析，并探討了二者聯(lián)合檢測對CRC的診斷價值，以期尋找出一種能早期發(fā)現(xiàn)CRC的無創(chuàng)、簡便、有效的檢測方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年12月—2018年12月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科、胃腸外科及腫瘤科就診的患者272例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）于結(jié)腸鏡檢查前及術(shù)前采集血標(biāo)本；（2）經(jīng)結(jié)腸鏡或術(shù)后病理檢查確診；（3）病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期或哺乳期婦女；（2）合并其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤病史者；（3）有放療、化療治療史者；（4）有凝血功能障礙或血小板異常者；（5）檢測中的無效樣本。

1.2 樣本量估算 已知陽性檢出率公式用于樣本量估計：N=Z2×〔P（1-P）〕/E2。Z是一個統(tǒng)計參數(shù)（對于95%CI，Z=1.96），E代表誤差（在本研究中選擇0.1），P代表假定的陽性檢出率。本研究P代表SEPT9基因甲基化試劑盒對CRC的已知靈敏度，從先前的一項(xiàng)初步研究中獲得。如果已知靈敏度等于0.75，則至少需要72個CRC病例。本研究中納入CRC患者126例（早期癌72例、進(jìn)展期癌54例）。

1.3 分組標(biāo)準(zhǔn) 以結(jié)腸鏡檢查及術(shù)后病理檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對照組：結(jié)腸鏡檢查提示結(jié)直腸黏膜正常；腺瘤組：結(jié)腸鏡下息肉切除術(shù)后病理檢查結(jié)果提示管狀腺瘤、管狀-絨毛狀腺瘤；早期癌組：指癌變組織局限于黏膜層及黏膜下層，病理類型包括高級別上皮內(nèi)瘤變、黏膜內(nèi)癌、黏膜下癌；進(jìn)展期癌組：病變侵及固有肌層及以下或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.4 分組 對照組82例，其中男47例、女35例，平均年齡（57.7±9.2）歲；腺瘤組64例，其中男37例、女27例，平均年齡（56.8±12.4）歲；早期癌組72例，其中男41例、女31例，平均年齡（56.1±12.3）歲；進(jìn)展期癌組54例，其中男31例、女23例，平均年齡（58.1±12.6）歲。

1.5 血漿mSEPT9檢測和血清CEA檢測 采用SEPT9基因甲基化試劑盒（北京博爾誠科技有限公司）檢測血漿mSEPT9，按照試劑盒說明書進(jìn)行血漿DNA提取、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理和PCR反應(yīng)。試劑盒中提供了陽性和陰性對照，每一次檢測需要同時檢測陰、陽性對照。血清CEA檢測由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科采用電化學(xué)發(fā)光法完成，參考值為5 ng/ml，血清CEA高于參考值為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。呈正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測診斷CRC的四格表，并分析其對CRC的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征CRC患者血漿mSEPT9陽性率不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大直徑CRC患者mSEPT9陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；早期癌患者血漿mSEPT9陽性率低于進(jìn)展期癌患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿mSEPT9陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，見表1）。

表1 不同臨床特征CRC患者血漿mSEPT9陽性率比較〔n（%），n=126〕Table 1 The relationship between mSEPT9 positive rate and different clinical characteristics of CRC patients

2.2 對照組、腺瘤組、早期癌組、進(jìn)展期癌組患者血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測的陽性率比較 對照組、腺瘤組、早期癌組和進(jìn)展期癌組患者血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測的陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。早期癌組和進(jìn)展期癌組血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測的陽性率均高于對照組和腺癌組（P＜0.05）；進(jìn)展期癌組血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測的陽性率高于早期癌組（P＜0.05）；對照組和腺瘤組各指標(biāo)檢測陽性率間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 對照組、腺瘤組、早期癌組、進(jìn)展期癌組患者血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測結(jié)果分析〔n（%）〕Table 2 Results analysis of plasma mSEPT9，serum CEA and both in control group，adenoma group，early stage cancer group and progressing stage cancer group

2.3 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測結(jié)果分析 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測與金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果見表3。血漿mSEPT9及血清CEA聯(lián)合檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測值高于單一指標(biāo)檢測，血漿mSEPT9聯(lián)合血清CEA檢測與金標(biāo)準(zhǔn)診斷一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.514（見表4）。

表3 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測對CRC的診斷結(jié)果（例）Table 3 Results analysis of plasma mSEPT9，serum CEA and the combination of the two compared to the gold standard

表4 血漿mSEPT9、血清CEA及二者聯(lián)合檢測對CRC的診斷價值Table 4 Diagnostic value of mSEPT9，serum CEA and their combined test for CRC

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)血漿mSEPT9的陽性率與CRC患者的年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤最大直徑無關(guān)，與既往研究結(jié)果相似［5-6］。臨床上男性CRC的發(fā)病率高于女性，但本研究結(jié)果顯示mSEPT9檢測的陽性率在男性和女性之間沒有差異，表明兩性共享相似的SEPT9基因甲基化譜，而且CRC的發(fā)病機(jī)制也可能相似，男女患者均可以使用血漿mSEPT9診斷CRC。在CRC的發(fā)病部位中，結(jié)腸癌多于直腸癌［7］，但本研究顯示血漿mSEPT9陽性率在結(jié)腸和直腸之間沒有明顯差異，表明這兩個部位的腫瘤具有相似的發(fā)病機(jī)制，這一優(yōu)勢對于從結(jié)腸和直腸中檢出病變至關(guān)重要，因?yàn)榧偃缒c道準(zhǔn)備不充分或患者不耐受，結(jié)腸鏡檢查可能會漏診一部分回腸末端和升結(jié)腸的癌癥，而糞便沿結(jié)腸運(yùn)動時血紅蛋白降解，導(dǎo)致右側(cè)結(jié)腸糞便免疫化學(xué)測試（FIT）的檢出率低于左側(cè)結(jié)腸［8］，因此，結(jié)腸鏡和FIT在檢測右半結(jié)腸癌方面均顯示出不足，但采用血漿mSEPT9檢測則可在不同結(jié)直腸部位有效檢出CRC，這有助于其在CRC篩查中的應(yīng)用。目前仍需要多中心、大樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證血漿mSEPT9水平與腫瘤最大直徑的關(guān)系。

本研究顯示，對照組和腺瘤組患者血漿mSEPT9陽性率無明顯差異，提示該檢測不能有效鑒別出腺瘤患者。CHURCH等［9］進(jìn)行的前瞻性研究顯示，血漿mSEPT9對晚期腺瘤的靈敏度僅為11.2%?？紤]腺瘤檢出率較低是標(biāo)志物向血液中釋放存在差異所致。本研究顯示，早期癌組患者血漿mSEPT9陽性率高于對照組，但其陽性率僅為33.3%，臨床意義較小，這限制了其對早期CRC和癌前病變（腺瘤）的鑒別能力。

本研究顯示，血漿mSEPT9患者的陽性率與腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。XIE等［10］的研究也顯示，血漿mSEPT9檢測對Ⅲ期和Ⅳ期患者的診斷靈敏度高于0期和I期患者，對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的診斷靈敏度高達(dá)85.71%。因此，與早期CRC患者相比，晚期CRC患者更容易檢測出血漿mSEPT9。分析早期CRC患者的血漿mSEPT9陽性率低的原因可能是早期CRC病灶通常較小，侵入性較小，將異常血漿mSEPT9 DNA釋放到血液中的機(jī)會較小。

血漿mSEPT9在CRC檢測中的診斷靈敏度在已發(fā)表的文獻(xiàn)中有所不同，對歐美人群的靈敏度為58%～95.6%，對亞洲人群的靈敏度為69%～88%［11-13］。本研究血漿mSEPT9檢測診斷CRC的靈敏度為57.14%，特異度為86.99%，靈敏度低于文獻(xiàn)報道，其可能由于以下幾個原因?qū)е拢菏紫?，血漿mSEPT9檢測的陽性率與惡性程度呈正相關(guān)，晚期CRC患者血漿mSEPT9檢測陽性率高于早期CRC患者［14］，本研究納入了較多的早期癌患者（72/126），因此靈敏度較其他文獻(xiàn)報道偏低；其次，與目前大部分研究采用的Epi proColon2.0試劑盒不同，本研究采用的是國產(chǎn)簡化試劑盒，將PCR反應(yīng)次數(shù)從2～3次簡化成1次，降低了檢測成本，且可減少算法對研究結(jié)果的影響，而張春燕等［15］采用同樣的試劑盒并以Ct值≤41.00為閾值，靈敏度為62.5%，特異度可高達(dá)90.0%，考慮可能與受檢者存在地區(qū)差異有關(guān)；最后，LEE等［16］發(fā)現(xiàn)韓國人群中血漿mSEPT9診斷CRC的靈敏度非常低，僅為36.6%，因此靈敏度差異可能部分歸因于人口統(tǒng)計學(xué)特征（性別、種族和年齡）、生活方式（吸煙和飲酒）、合并癥或其他環(huán)境暴露因素引起的樣本異質(zhì)性。

本研究結(jié)果顯示，早期癌組患者血漿mSEPT9和血清CEA檢測的陽性率分別為33.3%和16.7%，二者聯(lián)合檢測的陽性率可提高至41.7%；進(jìn)展期癌組患者血漿mSEPT9和血清CEA檢測的陽性率分別為88.9%和55.6%，二者聯(lián)合檢測的陽性率可達(dá)到100.0%。余南榮等［17］研究顯示CRC患者血漿mSEPT9聯(lián)合血清CEA檢測的陽性率為82.9%，較單獨(dú)血清CEA檢測的陽性率明顯升高。因此，聯(lián)合診斷在早期癌中和進(jìn)展期癌中靈敏度均可進(jìn)一步提高，這在早期癌篩查中有重要臨床意義，并為將來的CRC篩查提供了一種新方法，但仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，血漿mSEPT9檢測單獨(dú)應(yīng)用于鑒別腺瘤和早期癌價值有限，在早期和進(jìn)展期CRC患者中，血漿mSEPT9檢測陽性率均高于血清CEA，二者聯(lián)合檢測的診斷價值可進(jìn)一步提高，這在早期CRC篩查中有重要臨床意義。

作者貢獻(xiàn)：吳秀方進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實(shí)施與可行性分析，統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果的分析與解釋，撰寫并修訂論文，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；吳秀方、張曉紅、耿婷、陳紫紅進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理；南瓊負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

本研究局限性：

血漿SEPT9甲基化（mSEPT9）檢測在進(jìn)展期結(jié)直腸癌（CRC）患者中的陽性率高達(dá)88.9%，明顯高于血清癌胚抗原（CEA） 55.6%的陽性率，但其是否可能作為CRC療效評估和術(shù)后監(jiān)測的指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究。本研究對象并非均是無癥狀的平均風(fēng)險人群。因此，在最終應(yīng)用該檢測的前瞻性篩查環(huán)境中，其性能評估可能會有很大差異。一些重要的參數(shù)（例如患者依從性或成本效益）無法在本研究中進(jìn)行評估。本研究選取的是2017—2018年的病例，研究結(jié)果可能存在局限性。