亞甲藍(lán)介導(dǎo)光動力抗菌化學(xué)治療改善糖尿病下肢潰瘍感染的初步臨床研究

王久香，程慶豐，朱深銀，陳歡歡，杜志鵬，唐紫薇

糖尿病下肢潰瘍（diabetic lower extremity ulcer）是糖尿病患者一種常見的并發(fā)癥，指下肢神經(jīng)病變和不同程度的血管病變導(dǎo)致的下肢出現(xiàn)創(chuàng)面破潰、感染和/或深層組織破壞［1］。細(xì)菌感染是導(dǎo)致糖尿病下肢潰瘍遷延不愈甚至截肢的最主要原因［2］。大多數(shù)糖尿病下肢潰瘍感染為多種微生物引起的混合感染，包括需氧革蘭陽性球菌、革蘭陰性桿菌、真菌和厭氧菌［3］。目前糖尿病下肢潰瘍感染通常在糖尿病基礎(chǔ)治療上實施系統(tǒng)性抗感染治療，然而多數(shù)糖尿病下肢潰瘍患者存在下肢動脈粥樣硬化病變及灌注不足，全身用抗菌藥物難以在下肢潰瘍局部達(dá)到有效的治療濃度，致使全身用抗菌藥物果有限，且易出現(xiàn)多藥耐藥菌［4］。若感染未得到有效控制，潰瘍創(chuàng)面可能會形成細(xì)菌生物膜，減少抗生素的滲透，進(jìn)一步降低抗菌藥物療效，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合遲緩［5］。因此，亟須開發(fā)一種具備新作用方式的抗菌治療方法，以改善糖尿病下肢潰瘍感染的治療結(jié)局。

光動力抗菌化學(xué)治療（photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT）為一種光輻照誘導(dǎo)局部微生物滅活的化學(xué)治療方法［6］。PACT殺菌作用機(jī)制與傳統(tǒng)的抗菌藥作用不同，主要是通過特定波長的光照射，光敏劑吸收該波長的光能而處于激發(fā)狀態(tài)，將能量傳遞給局部組織分子氧，作用后產(chǎn)生大量活性氧（單線態(tài)氧、超氧陰離子和氧自由基），作用于細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及核酸等靶點(diǎn)，可殺滅抗生素敏感菌及耐藥細(xì)菌，且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥?；钚匝醮嬖跁r間極短，局限在局部組織，利于局部治療，不損傷周圍組織［7］。有研究報道大部分光敏劑介導(dǎo)的PACT能對革蘭陽性菌產(chǎn)生殺菌作用；而對于革蘭陰性菌，只有陽離子光敏劑介導(dǎo)的PACT才能起到較好殺菌作用［8］。因此，陽離子光敏劑是廣譜PACT所必需的。亞甲藍(lán)（methylene blue，MB）作為陽離子光敏劑，很容易與革蘭陰性菌脂多糖的負(fù)電荷結(jié)合，而革蘭陽性菌胞質(zhì)膜外只有莢膜物質(zhì)和肽聚糖，因此，MB能輕易滲透通過革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，可作為廣譜殺菌光敏劑。ASPIROZ等［9］報道用1% MB介導(dǎo)紅光照射能起到快速、廣譜的殺菌效果，且無不良反應(yīng)。然而目前通過光敏劑MB介導(dǎo)PACT作為一種輔助全身治療方法改善糖尿病下肢潰瘍感染的隨機(jī)對照臨床研究罕見報道。因此，本研究采用隨機(jī)對照研究初步探究MB介導(dǎo)PACT對糖尿病下肢潰瘍感染的療效及安全性，以探索一種糖尿病下肢潰瘍感染患者的新的、適宜性輔助治療方法，為改善糖尿病下肢潰瘍感染患者治療結(jié)局提供依據(jù)和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2020年2月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的糖尿病下肢潰瘍感染患者為研究對象。糖尿病下肢潰瘍感染的診斷依據(jù)為糖尿病患者下肢出現(xiàn)潰瘍創(chuàng)面炎癥表現(xiàn)［10］。糖尿病下肢潰瘍嚴(yán)重程度根據(jù)Wagner分級系統(tǒng)進(jìn)行分級［11］。糖尿病下肢潰瘍創(chuàng)面按照國際糖尿病足工作組（IWGDF）和美國感染病學(xué)會（IDSA）的分級方法進(jìn)行分級［3］（PEDIS分級）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80歲；（2）糖尿病病史在3個月以上；（3）治療前1周內(nèi)測定的潰瘍創(chuàng)面標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)總細(xì)菌量＞104集落形成單位（CFU/ml），單個潰瘍的最大直徑＜10 cm、面積＜100 cm2；（4）下肢潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級2級或糖尿病足Wagner分級2級；（5）自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）出現(xiàn)嚴(yán)重膿毒癥；（2）需要立即進(jìn)行下肢血運(yùn)重建，踝肱指數(shù)＜0.5；（3）孕婦或哺乳期女性；（4）對MB及其溶劑過敏；（5）有其他嚴(yán)重疾病如心臟病和肝腎功能不全等。退出標(biāo)準(zhǔn)：（1）在治療過程中發(fā)生全身嚴(yán)重感染；（2）需要行下肢截肢；（3）出現(xiàn)其他嚴(yán)重的影響受試者健康和生命的疾病；（4）受試者撤除知情同意書。本研究所有受試者簽署知情同意書，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（科研倫理批件2020-239）。

1.2 分組及治療 根據(jù)計算機(jī)產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表將研究對象分為試驗組和對照組，各15例。所有患者根據(jù)相關(guān)診療指南進(jìn)行常規(guī)的降糖、抗菌、調(diào)脂、改善血液循環(huán)等標(biāo)準(zhǔn)治療。試驗組治療方法：潰瘍創(chuàng)面外涂1%MB溶液，避光孵育30 min，光子治療儀照射20 min〔普門公司，Carnation-11，波長（640±10）nm，總光能48 J/cm2〕，1次/d，連續(xù)治療7 d。對照組治療方法：在潰瘍創(chuàng)面外涂0.9%氯化鈉溶液，光照處理同試驗組。

1.3 潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級及面積測量 患者分別于治療前、治療7 d后進(jìn)行PEDIS分級；用數(shù)據(jù)照相機(jī)進(jìn)行潰瘍創(chuàng)面拍照，用Image J 軟件3.0（National Institutes of Health）計算創(chuàng)面面積［12］。潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級與面積計算由設(shè)盲的非光動力治療的研究者實施。

1.4 潰瘍創(chuàng)面標(biāo)本細(xì)菌負(fù)荷檢測 將患者潰瘍創(chuàng)面先用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，后將一根用0.9%氯化鈉溶液浸濕的無菌拭子在潰瘍創(chuàng)面表面擦拭，然后放入裝有1 ml 0.9%氯化鈉溶液的無菌試管中，倍數(shù)稀釋后，將0.1 ml稀釋后不同濃度的接種液均勻接種到血瓊脂板上，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng) 24 h，根據(jù)平板上的菌落數(shù)計算潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷（CFU/ml）［13］。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 人口學(xué)特征和臨床特征 收集患者的人口學(xué)特征和臨床特征，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、糖尿病病程、糖化血紅蛋白（HbA1c）、糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生情況、糖尿病血管病變發(fā)生情況、糖尿病腎病發(fā)生情況、糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生情況、潰瘍部位、潰瘍面積、潰瘍病程、潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌類型、抗菌藥物使用強(qiáng)度。

1.5.2 療效指標(biāo) 主要終點(diǎn)指標(biāo)：潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷（CFU/ml），分別于治療前及治療后即刻、治療4 d后、治療7 d后檢測并記錄。

次要終點(diǎn)指標(biāo)：全身抗菌藥物使用強(qiáng)度〔累計用藥頻度（DDDs）〕、潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級、潰瘍面積（cm2）、血常規(guī)及C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP），于治療前和治療7 d后測定并記錄。

1.5.3 治療安全性觀察 每天記錄治療過程中兩組患者潰瘍光照區(qū)域是否有紅斑、水腫、水泡等不良反應(yīng)及MB相關(guān)的全身過敏反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用K-S檢驗樣本的正態(tài)性，計量資料中符合正態(tài)分布者以（±s）表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；符合偏態(tài)分布者以M（P25，P75）表示，兩組比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者人口學(xué)特征和臨床特征及全身抗菌藥物使用強(qiáng)度比較 兩組患者年齡、性別、BMI、糖尿病病程、HbA1c、糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生率、糖尿病血管病變發(fā)生率、糖尿病腎病發(fā)生率、糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生率、潰瘍部位、潰瘍面積、潰瘍病程、潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌類型、抗菌藥物使用強(qiáng)度（累計DDDs）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 兩組患者人口學(xué)特征和臨床特征比較Table 1 Demographics and clinical characteristics in two groups

2.2 MB介導(dǎo)PACT對患者潰瘍創(chuàng)面炎癥及面積的影響 試驗組患者在治療1周后潰瘍創(chuàng)面周圍炎癥紅腫消退，潰瘍創(chuàng)面膿性分泌物減少，潰瘍床由黃期轉(zhuǎn)為紅期，而對照組潰瘍創(chuàng)面炎癥沒有明顯變化（見圖1）。

圖1 MB介導(dǎo)PACT對糖尿病下肢潰瘍感染患者的治療情況Figure 1 Effect of methylene blue-mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy on diabetic lower extremity ulcer infection

治療前兩組患者潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級均為2級，治療7 d后試驗組潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級由2級轉(zhuǎn)為1級9例（9/15），而對照組潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級無變化。兩組患者治療前、治療7 d后潰瘍面積（組間、組內(nèi)）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 兩組患者治療前及治療7 d后潰瘍面積比較〔M（P25，P75），cm2〕Table 2 Wound area before and after 7-day treatment in two groups

2.3 MB介導(dǎo)PACT對患者血常規(guī)及CRP的影響 兩組患者治療前、治療7 d后白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者治療前、治療7 d后CRP比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；試驗組患者治療7 d后CRP低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 兩組患者治療前及治療7 d后血常規(guī)及CRP比較Table 3 Routine blood test results and serum CRP before and after 7-day treatment in two groups

2.4 MB介導(dǎo)PACT對患者潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷的影響兩組患者治療前和治療后即刻潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；試驗組患者治療4、7 d后潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；試驗組患者治療后即刻和治療4、7 d后潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組患者治療4、7 d后潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

表4 兩組患者不同治療時間潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷比較（±s，CFU/ml）Table 4 Bacterial counts in the ulcer before and immediately，4 and 7 days after treatment in two groups

表4 兩組患者不同治療時間潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷比較（±s，CFU/ml）Table 4 Bacterial counts in the ulcer before and immediately，4 and 7 days after treatment in two groups

注：兩組數(shù)據(jù)為經(jīng)lg轉(zhuǎn)化后數(shù)據(jù)；與治療前比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 治療前 治療后即刻 治療4 d后 治療7 d后對照組 15 6.5±1.3 6.2±1.3 5.1±1.4a 3.7±1.6a試驗組 15 7.4±1.4 5.5±1.0a 3.1±1.0a 1.8±0.3a t值 -1.768 1.618 4.550 4.550 P值 0.088 0.117 ＜0.001 ＜0.001

2.5 MB介導(dǎo)PACT的不良反應(yīng)發(fā)生情況 試驗組和對照組患者在治療過程中均未出現(xiàn)任何與光照和MB相關(guān)的輻照區(qū)域紅斑、腫脹、疼痛、瘙癢等不良反應(yīng)。

3 討論

促進(jìn)創(chuàng)面愈合是治療糖尿病下肢潰瘍感染亟須解決的問題，相關(guān)指南推薦糖尿病下肢潰瘍感染治療的原則是內(nèi)科治療結(jié)合外科治療，其中內(nèi)科治療包括通過加強(qiáng)患者教育、個體化調(diào)整胰島素或降糖藥的用量嚴(yán)格控制血糖，改善血液循環(huán)，全身抗感染治療；外科治療包括清創(chuàng)、引流、減壓等［14］。然而，糖尿病下肢潰瘍感染因潰瘍創(chuàng)面血流灌注不足、細(xì)菌耐藥及生物膜形成給臨床在糖尿病標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上進(jìn)行全身抗菌治療帶來了不少挑戰(zhàn)，亟須探索一種新的局部輔助滅菌治療方法以減輕創(chuàng)面感染，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究利用已在臨床使用的光敏劑MB介導(dǎo)PACT聯(lián)合糖尿病下肢潰瘍常規(guī)治療，觀察其對潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷、炎癥的影響，結(jié)果顯示MB介導(dǎo)PACT可以改善糖尿病下肢潰瘍感染，且具有良好的安全性。

PACT殺菌機(jī)制不同于抗菌藥，主要通過光敏劑吸收光能產(chǎn)生大量活性氧（單線態(tài)氧、超氧陰離子和氧自由基）而滅活細(xì)菌，抗菌譜廣，能夠殺滅耐藥菌，且不會產(chǎn)生細(xì)菌耐藥。MB是臨床常用生物染色劑和示蹤劑，最大吸收波長為664 nm，可被光子治療儀發(fā)射波長所激發(fā)，介導(dǎo)PACT。本研究結(jié)果顯示，與治療前相比，試驗組治療后即刻潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷明顯減少，表明MB介導(dǎo)PACT具有較強(qiáng)的快速殺菌效果。MORLEY等［15］報道光敏劑PPA904介導(dǎo)光動力治療組治療后即刻細(xì)菌負(fù)荷明顯減少（P＜0.05），而對照組治療前后細(xì)菌負(fù)荷沒有明顯差異。本研究進(jìn)一步觀察MB介導(dǎo)PACT治療4、7 d后潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷情況，結(jié)果顯示試驗組患者潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷均明顯低于對照組。MONAMI等［16］報道光敏劑RLP068介導(dǎo)光動力治療2周后，50%患者的細(xì)菌負(fù)荷＜103CFU/ml，表明RLP068介導(dǎo)PDT在治療2周后具有較好的殺菌效果。但是，本研究中試驗組與對照組治療7 d后潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷明顯降低〔（1.8±0.3）和（3.7±1.6）〕CFU/ml。光敏劑介導(dǎo)抗菌持續(xù)效應(yīng)不同的原因可能與使用的光敏劑特性及輻照方案不同有關(guān)。兩組患者在治療過程中常規(guī)全身使用抗菌藥物進(jìn)行治療，但兩組間抗菌藥物使用強(qiáng)度無差異；表明MB介導(dǎo)PACT治療能明顯降低糖尿病下肢潰瘍感染患者潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷。

潰瘍感染創(chuàng)面的炎癥及全身炎癥相關(guān)指標(biāo)主要由潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷所決定。本研究中MB介導(dǎo)PACT治療7 d后潰瘍創(chuàng)面PEDIS分級降低（9/15），分泌物減少，潰瘍床由黃期轉(zhuǎn)為紅期，顯示MB介導(dǎo)PACT治療通過直接殺滅細(xì)菌、降低創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷、減輕潰瘍創(chuàng)面炎癥、促進(jìn)創(chuàng)面新生肉芽組織生長而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。血常規(guī)及CRP為臨床常用的反映全身炎癥的指標(biāo)［17］，本研究結(jié)果顯示試驗組治療7 d后CRP明顯降低，但對白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)沒有影響，可能與本研究納入的受試者潰瘍感染較輕，而CRP對炎癥較血常規(guī)更敏感有關(guān)。本研究兩組患者治療后潰瘍面積沒有明顯的差異，可能原因是治療時間較短（只觀察了7 d）而潰瘍愈合需要一定時間；加之樣本量較少，未能進(jìn)一步評估更長時間MB介導(dǎo)PACT對糖尿病下肢潰瘍愈合的改善效果。

以上結(jié)果顯示MB介導(dǎo)PACT具有較好的殺菌、減輕炎癥、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，但本研究尚未對其機(jī)制進(jìn)行研究，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，其機(jī)制可能與以下幾個方面有關(guān)：首先，MB介導(dǎo)PACT減少創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷，不僅可減輕感染還可清除創(chuàng)面愈合的障礙，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合［18］；其次，PACT可能通過免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)生長因子的生成而促進(jìn)創(chuàng)面愈合［19-20］。但目前尚無基礎(chǔ)研究充分闡明相關(guān)機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，糖尿病下肢潰瘍感染患者在常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上進(jìn)行MB介導(dǎo)PACT可有效殺滅潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌、降低潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌負(fù)荷、減輕潰瘍局部炎性反應(yīng)、促進(jìn)肉芽組織生長，進(jìn)而改善糖尿病下肢潰瘍創(chuàng)面感染，且有良好的安全性，可為糖尿病下肢潰瘍感染提供新的輔助治療依據(jù)，有望成為糖尿病下肢潰瘍感染治療的一種有前景的方法。但還需要進(jìn)一步大樣本臨床試驗來驗證其臨床療效及深入研究其作用機(jī)制。

本文鏈接：

光動力治療（PDT）指通過特定波長的光照射，光敏劑吸收該波長的光能而處于激發(fā)狀態(tài)，將能量傳遞給局部組織分子氧，作用后產(chǎn)生大量活性氧（單線態(tài)氧、超氧陰離子和氧自由基），進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程。PDT的三要素是光敏劑、特定波長的光、組織分子氧。PDT已廣泛應(yīng)用于癌癥（包括皮膚癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸癌）和非癌性疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、銀屑病、尋常性痤瘡等。光動力抗菌化學(xué)治療（PACT）是一種光輻照誘導(dǎo)局部微生物滅活的化學(xué)治療方法，也是一種不依賴于局部血供的非特異性抗菌療法，不易產(chǎn)生耐藥菌，不損傷周圍組織，因此，PACT被認(rèn)為是一種有前景的治療慢性感染的方法。目前PACT廣泛用于尖銳濕疣、口腔牙菌斑生物膜、痤瘡丙酸桿菌、燒傷感染等。

本研究局限性：

（1）樣本量較?。唬?）觀察時間有限，未觀察到亞甲藍(lán)（MB）介導(dǎo)PACT對潰瘍創(chuàng)面的長期影響；（3）未對MB-PACT減輕潰瘍創(chuàng)面炎癥，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制進(jìn)行研究。

作者貢獻(xiàn)：王久香、朱深銀負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計、論文的撰寫和修訂；王久香、程慶豐負(fù)責(zé)研究的實施與可行性分析、結(jié)果分析與解釋，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；王久香、杜志鵬進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；王久香、陳歡歡進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；王久香、唐紫薇負(fù)責(zé)統(tǒng)計學(xué)處理；王久香負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。