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    柱前衍生-高效液相色譜測(cè)定手足口病患者血清中多胺水平

    2021-03-22 00:30:52張偉健曾今誠(chéng)黃明元廣東醫(yī)科大學(xué)東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室東莞市生物活性分子開發(fā)與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東東莞53808
    關(guān)鍵詞:精胺精密度口病

    張偉健,謝 琪,,曾今誠(chéng),黃明元*(廣東醫(yī)科大學(xué) .東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,.東莞市生物活性分子開發(fā)與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東東莞 53808)

    多胺是一類含氮的低分子量有機(jī)化合物,具有生物活性,一般包括亞精胺(SPD)和精胺(SPM),它們具有促進(jìn)細(xì)胞分化、增生、生長(zhǎng),在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性等方面起著重要的作用[1]。體內(nèi) SPD和SPM水平與惡性腫瘤、心血管疾病、腦血管疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-4]。目前多胺檢測(cè)在紅斑狼瘡[5]、惡性腫瘤患者中均有報(bào)道[6],主要采用高相液相色譜法(HPLC)[7]。手足口病(HFMD)是一類由腸道病毒感染引起的一種發(fā)生于5歲以下兒童中的常見疾病[8]。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生-HPLC測(cè)定手足口患兒和健康體檢者血清多胺的濃度,旨為臨床診斷和疾病預(yù)防提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 儀器與試劑

    LC-20A高效液相色譜儀、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、RF-20A xs熒光檢測(cè)器(Shimadzu),5417R冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf),氮吹儀REXC100,電動(dòng)旋渦混旋震蕩器 Vortex-Genie2,Milli-Q超純水儀(Millipore),電熱恒溫水溫箱(精宏公司);亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品、精胺標(biāo)準(zhǔn)品和丹磺酰氯均購(gòu)于sigma公司;乙腈為色譜純,氨水、高氯酸、NaOH、NaHCO3等均為分析純。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    準(zhǔn)確稱取亞精胺和精胺標(biāo)準(zhǔn)品100 mg,用超純水定容至10 mL,放置-20℃冰箱保存;用超純水分別稀釋以上標(biāo)準(zhǔn)品為1 g/L,混合以上單標(biāo),再用冷5%高氯酸稀釋成終溶度分別為 20、10、4、2、1、0.5、0.1、0.02 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于 4℃冰箱保存。

    1.3 樣本收集與前處理

    根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部于2018年發(fā)布的《手足口病治療指南》和糞便手足口病病毒檢測(cè)陽(yáng)性診斷結(jié)果,收集手足口病患兒(20例)和同期健康體檢者(20例)的血清。

    樣本前處理:取250 μL血清,然后12000 r/min,4℃,離心5 min,取200 μL血清,加入冷300 μL 5%HCLO4 沉淀蛋白,渦旋,12000 r/min,4℃,離心10 min,轉(zhuǎn)移上清400 μL,放置 4℃待衍生[9]。

    1.4 衍生化處理

    400 μL的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品加入200 μL 2 mol/L NaOH和400 μL飽和NaHCO3,然后加上400 μL丹磺酰氯(5 g/L,乙腈做溶劑),在 60℃水浴加熱避光反應(yīng)45 min,反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL的氨水終止反應(yīng)并除去多余的丹磺酰氯。

    1.5 衍生物的萃取

    加800 μL三氯甲烷萃取,3000 r/min,10 min,吸取下層有機(jī)相700 μL,以氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)?00 μL乙腈復(fù)溶,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾上樣檢測(cè)。

    1.6 色譜條件

    色譜柱:C18柱 (4.6 mm×250 mm,5μm),流動(dòng)相:A項(xiàng)為超純水,B項(xiàng)為乙腈,梯度洗脫,梯度洗脫程序見表1;檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm;流速:1 mL/min,進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:40℃。

    2 結(jié)果

    2.1 亞精胺和精胺色譜圖。

    亞精胺和精胺色譜圖見圖1。亞精胺和精胺保留時(shí)間分別為14.9、18.8 min,分離效果較好。

    圖1 衍生后亞精胺(1)和精胺(2)的 HPLC色譜圖

    表1 梯度洗脫程序

    2.2 衍生條件優(yōu)化

    按“ 1.4衍生化處理”項(xiàng)下方法,考察衍生 pH 分別為9、10、11時(shí)多胺的峰面積,結(jié)果見圖 2A;考察衍生劑用量分別為100、200、400、800 μL時(shí)多胺的峰面積,結(jié)果見圖 2B;考察衍生劑溫度分別為30、40、50、60、70℃時(shí)多胺的峰面積,結(jié)果見圖 2C;考察反應(yīng)時(shí)間分別為 10、20、30、40、45、50 min時(shí)多胺的峰面積,結(jié)果見圖 2D。最終確定衍生體系 pH約為 10,衍生劑量為200 μL,反應(yīng)溫度為60℃,反應(yīng)時(shí)間為45 min。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

    將冷 5%高氯酸稀釋成終質(zhì)量溶度分別為 20、10、4、2、1、0.5、0.1、0.02 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于 4℃冰箱保存,經(jīng)衍生化進(jìn)樣測(cè)定。以亞精胺和精胺濃度與峰面積采用外標(biāo)法進(jìn)行回歸得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,線性方程亞精胺為y=827755x+38250和精胺為y=957264x+34436,相關(guān)系數(shù)均>0.997,亞精胺最低檢測(cè)限(LOD)為0.02 mg/L,精胺的最低檢測(cè)限(LOD)為 0.01 mg/L。

    2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

    分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度 0.1、1、10 mg/L作為低中高質(zhì)量濃度,于上述色譜條件,1 d內(nèi)重復(fù)檢測(cè)5次,計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果見表2,SPD日內(nèi)精密度(RSD%)為0.18~2.38,日間精密度(RSD%)為0.11~3.14,SPM日內(nèi)精密度(RSD%)為0.54~0.85,日間精密度(RSD%)為 0.1~1.28。

    2.5 穩(wěn)定性

    分別配制低、中、高(0.1、1、10 mg/L)3種質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別置于-20℃3個(gè)月、室溫(25℃)24 h、凍融 3次循環(huán)以及衍生反應(yīng)后24 h來(lái)考察SPD和SPM的長(zhǎng)期、短期穩(wěn)定性,結(jié)果(表 3)表明 SPD和SPM在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定可測(cè);衍生后 SPD和SPM并不太穩(wěn)定,提示不能重復(fù)檢測(cè)。

    2.6 回收率

    圖2 不同衍生條件下亞精胺和精胺的峰面積

    表2 亞精胺和精胺的精密度(n=5)

    表3 亞精胺和精胺的穩(wěn)定性(n=3)

    配置已知含量(0.5、4、10 mg/L)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用標(biāo)準(zhǔn)添加法,測(cè)定回收率。經(jīng)衍生化處理進(jìn)樣測(cè)定,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,根據(jù)測(cè)定質(zhì)量濃度與實(shí)際加入質(zhì)量濃度計(jì)算回收率。結(jié)果見表4,SPD回收率在87.98%~99.10%,SPM回收率在96.84%~105.15%。

    表4 亞精胺和精胺的回收率(n=4)

    2.7 HFMD患兒和健康對(duì)照者血清中 SPD 和SPM 含量的檢測(cè)

    在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下,經(jīng)上述處理,測(cè)定20例手足口病患兒及20例健康對(duì)照者血清中多胺的水平,SPD和SPM含量見表5。

    表5 HFMD患兒和健康對(duì)照者血清亞精胺和精胺含量(±s, n=20,mg/L)

    表5 HFMD患兒和健康對(duì)照者血清亞精胺和精胺含量(±s, n=20,mg/L)

    與健康對(duì)照者相比:aP<0.01

    3 討論

    衍生劑質(zhì)量濃度在5 g/L時(shí)得到最優(yōu)結(jié)果,對(duì)衍生劑用量進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)衍生劑量在200 μL時(shí)衍生化產(chǎn)物與其他更大劑量相差不大,考慮到成本,確定衍生劑用量為200 μL[10]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)衍生劑的用量、衍生反應(yīng)的溫度和時(shí)間以及衍生體系的 pH值對(duì)丹磺酰氯衍生反應(yīng)影響很大[11],pH值過(guò)低會(huì)影響衍生反應(yīng)不完全,過(guò)高則會(huì)干擾,對(duì) pH進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果表示在10.0左右衍生反應(yīng)最合適;衍生化溫度及衍生時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)有較大的影響,衍生溫度過(guò)高衍生物易分解,衍生溫度過(guò)低時(shí)衍生反應(yīng)不完全[5],經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),60℃衍生反應(yīng)45 min吸收信號(hào)最強(qiáng)。

    應(yīng)用HPLC檢測(cè)腫瘤患者生物樣本中的多胺已有多篇研究報(bào)道。一項(xiàng)研究報(bào)道了局灶性腦缺血患者血液中的亞精胺水平升高[12];此外,亞精胺與第48小時(shí)的臨床結(jié)果和第4~6天的梗死體積有關(guān)。有趣的是,外源性多胺或多胺抑制劑可以影響一系列的生理活動(dòng)。例如,亞精胺或精胺預(yù)處理顯著抑制缺血/再灌注(I/R)細(xì)胞的凋亡,抑制caspase-3和caspase-9的表達(dá),抑制細(xì)胞色素c 的釋放,上調(diào)Bcl-2的表達(dá),降低[Ca2+][13]。在一個(gè)高血壓誘發(fā)的充血性心力衰竭模型中,亞精胺的攝入降低了血壓,提高了肌氨酸磷酸化水平,防止了心臟肥厚,表明延遲了心力衰竭的進(jìn)展[14]。在本研究中,我們研究了亞精胺和精胺在 EV71感染的手足口病中的作用,表 5結(jié)果顯示手足口患者與健康對(duì)照中的亞精胺和精胺水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示亞精胺和精胺在手足口病,特別是 EV71感染的手足口病中高表達(dá),表明生物多胺與手足口病的進(jìn)展有關(guān)。本研究在已有的研究基礎(chǔ)上,優(yōu)化衍生實(shí)驗(yàn)條件,最終建立了衍生體系pH約為 10,衍生劑量為200 μL,反應(yīng)溫度為 60℃,反應(yīng)時(shí)間為45 min的高效液相色譜法以檢測(cè)手足口患者血清中亞精胺和精胺含量。本方法準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,可用于臨床監(jiān)測(cè)手足口病患者體內(nèi)亞精胺和精胺水平,有待提高的地方為應(yīng)該增加臨床樣本量和疾病臨床分期,更深層次挖掘多胺與手足口病之間的聯(lián)系,為臨床診斷和疾病預(yù)防提供參考。

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