SETD2調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶H3K36me3的分子機(jī)制及其與腫瘤的關(guān)系

鄒 園，王思思，伍彩霞，揭 偉，申志華（廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 .病理學(xué)系；2.病理生理教研室，廣東湛江 524023）

表觀遺傳學(xué)是指非依賴 DNA序列改變所致的基因表達(dá)水平變化，由此引起生物學(xué)表型的改變。表觀遺傳學(xué)修飾類型主要包括 DNA甲基化、乙?；?、組蛋白修飾、組蛋白異構(gòu)體、基因組印記等。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中最重要的修飾機(jī)制之一，其主要發(fā)生在基因啟動子區(qū)域，通過甲基化修飾作用影響染色體結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。組蛋白甲基化在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用。SET domain containing 2(SETD2)作為人體組織中唯一的組蛋白第36位賴氨酸三甲基轉(zhuǎn)移酶(H3K36me3)的修飾酶，其基因突變在人類腫瘤組織中普遍存在，SETD2蛋白低表達(dá)與腫瘤臨床進(jìn)展關(guān)系密切。本文旨在從表觀遺傳學(xué)角度總結(jié) SETD2在腫瘤形成和發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，為腫瘤防治提供理論基礎(chǔ)。

1 SETD2基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征

SETD2別名亨廷頓蛋白相互作用蛋白1，最早由人造血干細(xì)胞分離。人類SETD2基因位于3 號染色體短臂(3p21.31)，長約192 kb，由 23個外顯子和22個內(nèi)含子組成，有 9個轉(zhuǎn)錄本(剪切變體)，各轉(zhuǎn)錄本基本生物學(xué)信息見表1。全長SETD2蛋白質(zhì)由2564個氨基酸組成，分子量為280 KDa。SETD2蛋白包含多個結(jié)構(gòu)域，包括(1)SET(Suvar3-9，Enhancer-of-zeste，Trithorax)域：由 AWS、SET和PS(post-SET)模體組成，該結(jié)構(gòu)域是執(zhí)行組蛋白 H3第36位賴氨酸單甲基化(H3K36me)轉(zhuǎn)移的催化結(jié)構(gòu)域[1]。(2)H4/H2A相互作用域：由一小段酸性殘基組成，其作用可能是穩(wěn)定核小體上的 SETD2或?qū)⒚附Y(jié)構(gòu)域定位在組蛋白H3第36位賴氨酸(H3K36)殘基上[1]。(3)WW 和CC域：兩者均為保守區(qū)域。WW結(jié)構(gòu)域是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)結(jié)合。在細(xì)胞核中，RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)的C末端結(jié)構(gòu)域(CTD)會通過與具有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。在某些蛋白質(zhì)中，CC結(jié)構(gòu)域能夠促進(jìn)同源二聚化。(4)自抑制結(jié)構(gòu)域(AID)：位于SET和WW域之間，作用是抑制 SETD2過度活躍，減少核小體和ATM基因上H3K36me的數(shù)量并影響SETD2與RNAPII的作用。(5 )Set2-Rpb1相互作用(SRI)域：通過RNAPII的絲氨酸2(Ser2)和絲氨酸5(Ser5)雙磷酸化CTD重復(fù)序列，與H3K36甲基化一起參與轉(zhuǎn)錄的延長[2]。

2 SETD2與組蛋白H3K36me3調(diào)控

組蛋白甲基化及其相關(guān)酶是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控因子。SETD2通過多種機(jī)制參與組蛋白修飾，組成了復(fù)雜的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來，以組蛋白共價(jià)修飾為主要標(biāo)志的表觀遺傳調(diào)控研究已成為生命科學(xué)前沿快速發(fā)展的熱點(diǎn)領(lǐng)域，其中賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶成為了調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或信號通路的新靶點(diǎn)。組蛋白賴氨酸特異性甲基化在DNA的各個方面都發(fā)揮著重要作用如轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、重組和DNA損傷修復(fù)。SETD2可能通過以下幾個方面實(shí)現(xiàn)對 H3K36me3的調(diào)節(jié)：(1 )RNAPII CTD中Ser2 和Ser5磷酸化。CTD磷酸化在 H3K36甲基化的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。RNAPII 的CTD激酶CTK1(CTD kinase 1)的缺失或CTD的部分缺失，導(dǎo)致H3K36甲基化的選擇性廢除，表明CTD磷酸化在 H3K36甲基化中的重要作用。其中，SRI結(jié)構(gòu)域與雙重修飾的CTD重復(fù)序列(Ser2 和Ser5磷酸化)的特異結(jié)合具有高親和力。同時，已經(jīng)含有磷酸化 Ser2 或 Ser5 的 CTD底物更容易被CTK1磷酸化。但研究發(fā)現(xiàn)雙磷酸化的Ser2和Ser5同時出現(xiàn)的頻率較低，這表明Ser2-CTD磷酸化可能是SETD2相互作用的主要標(biāo)記[1,3]。(2)組蛋白伴侶 Spt6。Spt6作為一種保守的轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白伴侶也調(diào)節(jié) SETD2介導(dǎo)的 H3K36me3過程。Spt6蛋白包含一個C 端保守的SH2結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域被招募到RNAPII的磷酸化CTD中，參與轉(zhuǎn)錄、mRNA處理和組蛋白修飾的各種因子的招募[4]。H3K36me3需要Spt6、RNAPII的 CTD、CTK1 和SETD2 的 SRI結(jié)構(gòu)域的完整性。而SETD2催化的組蛋白 H3 第36位賴氨酸二甲基化(H3K36me2)在很大程度上獨(dú)立于 CTK1依賴的 CTD磷酸化和SETD2的 SRI結(jié)構(gòu)域。CTK1和Spt6相互調(diào)節(jié)彼此的 SETD2蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。但是，Spt6維持 Ser2-CTD磷酸化水平的能力弱于 Spt6控制H3K36me的能力[1]。(3 )RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)因子1(Paf1)復(fù)合體。Paf1復(fù)合物與RNAPII結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄延長，在轉(zhuǎn)錄過程中協(xié)調(diào)多個組蛋白翻譯后修飾[1]。已知Paf1復(fù)合體含有Rtf1、Cdc73、Paf1、Ctr9 和Leo1亞基，Paf1復(fù)合體組分的缺失對組蛋白H 3 第4 位賴氨酸(H3K4)甲基化水平有不同的影響。Rtf1缺失消除了組蛋白 H3第4位賴氨酸單甲基化(H3K4me)并嚴(yán)重降低了組蛋白 H3 第79位賴氨酸單甲基化(H3K79me)，而 Leo1突變不影響 H3K4me 或 H3K79me[5]。研究表明，Paf1C亞單位 Rtf1的組蛋白修飾域(連接 Paf1和RNAPII的 Paf1復(fù)合物的一個成員)直接與泛素共軛酶Rad6相互作用并獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄刺激 H2Bub[6]。但是，亦有研究表明，Paf1復(fù)合物的缺失導(dǎo)致 Ser2-CTD磷酸化水平降低，Paf1的這種作用可能是間接的，且Paf1可能通過與Spt6作用而穩(wěn)定Spt6，表明Paf1復(fù)合物有助于穩(wěn)定和/或招募Spt6 和CTK1到染色質(zhì)[7]。一旦加入染色質(zhì)，CTK1可以磷酸化RNAPII-CTD而結(jié)合SETD2[1]。(4)組蛋白 H3K36去甲基化。由于組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化酶和去甲基化酶(如LSD1和JHDM1)動態(tài)相互調(diào)節(jié)，因此，組蛋白甲基化也受去甲基化的調(diào)節(jié)。在芽殖酵母中，有兩種主要的H3K36me去甲基酶，如具有 JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白Jhd1和Rph1。Jhd1作用于 H3K36me 和H3K36me2，而Rph1作用于 H3K36me2和H3K36me3。在高等真核生物中，賴氨酸去甲基酶 KDM2A可以去除H3K36的甲基化，其機(jī)制主要是 CpG島直接招募 H3K36特異性 KDM2A，從而產(chǎn)生 CpG島染色質(zhì)被耗竭。KDM2A利用鋅指CxxC(ZF-cxc)結(jié)構(gòu)域優(yōu)先識別非甲基化 CpG-DNA。當(dāng) CpG-DNA甲基化時，結(jié)合被阻斷，從而將KDM2A限制在非甲基化CpG島上而達(dá)到去除甲基化的目的。此外，有研究表明KDM2A與異染色質(zhì)蛋白(HP1)相互作用，將 KDM2A招募到組蛋白 H3第9位賴氨酸三甲基化(H3K9me3)修飾的核小體，介導(dǎo)染色質(zhì)沉默[8-9]。(5)非編碼RNA。在轉(zhuǎn)錄前水平，長非編碼RNA HOTAIR 通過減少 SETD2啟動子區(qū)域募集 CREB、P300和RNAPII從而抑制SETD2的表達(dá)和磷酸化[10]。有研究表明，miR-106b-5p的過度表達(dá)導(dǎo)致透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌(ccRCC)細(xì)胞中SETD2的 mRNA和蛋白水平下降[11]。迄今，有關(guān)涉及調(diào)節(jié) SETD2水平的其他 RNA因子還有待進(jìn)一步探索。

表1 人SETD2基因轉(zhuǎn)錄本的基本生物學(xué)信息

3 SETD2致癌機(jī)制

研究表明 SETD2基因在多種人類腫瘤中普遍存在突變現(xiàn)象，如急性淋巴細(xì)胞性白血病、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等，這可能是眾多腫瘤組織中 SETD2蛋白表達(dá)水平低下的原因之一。有關(guān) SETD2異常的致癌機(jī)制可能與如下幾個方面關(guān)系密切：(1)SETD2突變后下調(diào)H3K36me3表達(dá)水平，增加了體內(nèi)錯誤的轉(zhuǎn)錄起始過程，最終導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄異常。H3K36me3與轉(zhuǎn)錄起始的頻率相關(guān)，保證了轉(zhuǎn)錄的高保真度，從而抑制細(xì)胞內(nèi)隱藏的錯誤轉(zhuǎn)錄起始過程。此外，在缺乏H3K36me3的腫瘤中，mRNA處理缺陷(包括內(nèi)含子保留和異常剪接)影響了基因組中多達(dá)25%的基因表達(dá)。同時，可以觀察到錯配的外顯子附近的核小體占有率降低。同時，H3K36me3在 S期早期達(dá)到峰值，表明SETD2在 DNA復(fù)制過程中最活躍。另外，在腎癌中，SETD2基因缺陷導(dǎo)致 DNA甲基化缺失，導(dǎo)致核小體致密性異常降低，從而阻礙復(fù)制叉的進(jìn)展，并導(dǎo)致細(xì)胞在 S期 積聚[12]。故 RNA的豐度、穩(wěn)定性或剪接的改變可引起磷酸化蛋白質(zhì)組的改變，并破壞正常的細(xì)胞信號和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。(2)SETD2水平下降影響了 p53功能。眾所周知，p53是重要的腫瘤抑制基因。在多種SETD2突變的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)p53蛋白和mRNA水平的降低[13]。研究表明，SETD2與p53的轉(zhuǎn)激活域(TAD)相互作用，后者與泛素蛋白連接酶 HDM2結(jié)合，抑制腫瘤抑制因子的活性并促進(jìn)其降解來增加 P53的穩(wěn)定性[14]。(3)維持基因組穩(wěn)定和促進(jìn) DNA損傷修復(fù)。組蛋白修飾在DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。H3K36me3通過與MutSα的 PWWP結(jié)構(gòu)域的物理相互作用募集錯配識別蛋白 MutSα來復(fù)制染色質(zhì)，證明H3K36me3與MutSα一起參與保護(hù)，免受突變，其在外顯子和活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)域中比在內(nèi)含子和非轉(zhuǎn)錄區(qū)域中共富集得多。相應(yīng)地，消耗 H3K36me3或破壞H3K36me3 與MutSα相互作用提高了活躍轉(zhuǎn)錄基因中的自發(fā)突變頻率[15]。此外，SETD2功能缺陷腫瘤細(xì)胞通常會出現(xiàn)基因組微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，而基因組MSI與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[16]。

4 常見腫瘤中SETD2的表達(dá)及作用

4.1 泌尿系統(tǒng)腫瘤

腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是最常見的成人腎癌。突變、甲基化失活或 von Hippel-Lindau的異常表達(dá)是ccRCC發(fā)生的主要原因[12]。多項(xiàng)獨(dú)立研究對ccRCC臨床樣本進(jìn)行了蛋白編碼基因和外顯子測序，同樣發(fā)現(xiàn)了 SETD2的失活突變。腎癌中的 SETD2不僅在表觀遺傳功能障礙中發(fā)揮功能，同樣在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中起作用[17]。表觀遺傳學(xué)修飾方面，H3K36me3可與H4K16ac協(xié)同促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活，而 SEDT2缺失導(dǎo)致 H3K36me3的蛋白水平明顯下調(diào)[18]，影響基因的甲基化修飾。ccRCC也是一種高度“代謝重編程”疾病，能量、營養(yǎng)和氧感應(yīng)等方面均存在異常[19]。SETD2的缺失可下調(diào)肌酸、糖胺聚糖和碳水化合物的代謝過程，通過 PGC1α介導(dǎo)的代謝網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)氧化磷酸化和脂質(zhì)生成[18,20]。這種代謝異常為腎細(xì)胞癌的影像學(xué)和治療干預(yù)新靶點(diǎn)的開發(fā)提供了新的機(jī)會。

眾所周知，microRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其異常在腫瘤發(fā)生中的起重要作用。在ccRCC組織和細(xì)胞系中，內(nèi)源性 miR-23b-5p、miR-34b-3p和miR-106b-5p的高表達(dá)與SETD2低水平相關(guān)，其中miR-106b-5p可直接靶向結(jié)合SETD2 mRNA的3'UTR，提示 microRNA可能直接調(diào)控 SETD2的表達(dá)[21-22]。盡管人們已經(jīng)認(rèn)識到 SETD2在調(diào)節(jié)ccRCC細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，但迄今SETD2在ccRCC中的失活機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

4.2 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤

以染色體重排為特征的急性白血病需要額外的分子學(xué)異常刺激才能發(fā)展成完全的惡性腫瘤，然而其協(xié)同機(jī)制仍不清楚。SETD2在血液惡性腫瘤的發(fā)生和治療敏感性中起重要作用?；旌舷蛋籽?MLL)基因編碼一種DNA結(jié)合蛋白，介導(dǎo)H3K4的甲基化。MLL易位后編碼一種 MLL融合蛋白，失去了H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)活性，卻能有效地將造血細(xì)胞轉(zhuǎn)化為白血病干細(xì)胞。在MLL重排白血病和復(fù)發(fā)性急性白血病中常發(fā)生SETD2基因突變，SETD2突變的白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程、S 和G2/M檢查點(diǎn)調(diào)控相關(guān)的信號減弱，進(jìn)而影響DNA復(fù)制、有絲分裂和細(xì)胞死亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，SETD2基因敲除后導(dǎo)致伊馬替尼不敏感和白血病干細(xì)胞在慢性髓細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞系中富集[24]。最新的報(bào)道顯示在MLLAF9 AML小鼠模型中使用條件性SETD2基因敲除，純合性SETD2缺失導(dǎo)致MLL-AF9誘導(dǎo)的白血病發(fā)生明顯延遲，而雜合子 SETD2缺失則加速疾病發(fā)展和化療抵抗[25]?？傊?，目前對 SETD2在血液性惡性腫瘤中的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

4.3 呼吸系統(tǒng)腫瘤

肺腺癌中SETD2基因突變較常見。在肺癌中的H3K36me3丟失可破壞染色質(zhì)的多樣性，如基因剪接、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄伸長、DNA甲基化和基因組完整性的維護(hù)。SETD2在肺癌的治療中也起著關(guān)鍵作用。順鉑是治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)最常用的化療藥物之一。抑制SEDT2表達(dá)和SETD2突變可通過抑制 NSCLC細(xì)胞中 H3K36me3 和ERK的激活而產(chǎn)生順鉑耐藥性。故SETD2可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌基因的作用[26]。

報(bào)道顯示，與鼻咽部炎癥組織相比，鼻咽癌組織中SETD2 mRNA水平顯著下降[27]。本實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細(xì)胞中 SETD2基因敲除后影響了 20多條與腫瘤密切相關(guān)的經(jīng)典信號通路[28]。由此可知，SETD2在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。迄今，有關(guān) SEDT2在鼻咽癌中的研究還處在起步階段，今后仍需進(jìn)一步探討SETD2在鼻咽癌的作用及機(jī)制，為鼻咽癌的治療和預(yù)后判斷提供更多的參考信息。

4.4 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤

惡性原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是兒童癌癥相關(guān)死亡的主要原因。兒童神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)SETD2突變率約15%，而成人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中 SETD2突變率為8%[29]。SETD2的失功能突變在小兒及青年人的晚期神經(jīng)膠質(zhì)瘤中可以被發(fā)現(xiàn)，但早期神經(jīng)膠質(zhì)瘤中卻并未檢測到，這代表SETD2的失功能突變在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有晚期特異性。SETD2失活會導(dǎo)致膠質(zhì)瘤進(jìn)展，并向高臨床分期演進(jìn)。

4.5 骨腫瘤

對骨肉瘤易感犬的外顯子測序發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤腫瘤表現(xiàn)出高頻率體細(xì)胞拷貝數(shù)改變。Gardner等[30]研究發(fā)現(xiàn)21%的病例中發(fā)生了 SETD2突變，其突變類型包含了點(diǎn)突變、移碼插入或刪除等。在對 24名脊索瘤患者的分析中，SETD2突變主要是點(diǎn)突變或拷貝數(shù)丟失[31]。有關(guān)SETD2與骨肉瘤生物學(xué)功能的報(bào)道目前尚缺乏。

4.6 消化系統(tǒng)腫瘤

隨著 SETD2表達(dá)的增加，胃癌細(xì)胞 HGC-27和AGS的遷移、增殖和侵襲能力下降，即SETD2的低表達(dá)與胃癌不良預(yù)后正相關(guān)[32]。SETD2基因失活使小鼠腸上皮促進(jìn)腸干或祖細(xì)胞的自我更新和組織再生[33]。

4.7 其他系統(tǒng)腫瘤

根據(jù) TCGA和代謝數(shù)據(jù)庫，SETD2在乳腺癌各亞型中均有突變。在所有類型的乳腺癌中，SETD2的表達(dá)水平與患者的預(yù)后顯著正相關(guān)[17,34]。SETD2的表達(dá)與乳腺癌分級、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，表明SETD2可能在腫瘤抑制中起作用。由于其與p 53異常活性相關(guān)，因此可以作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物。

SETD2基因在多種人類腫瘤中都存在突變現(xiàn)象，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起著重要的作用，這為臨床防治提供了相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

5 問題與展望

SETD2基因在多種人類腫瘤中失活，并參與腫瘤的發(fā)生與臨床進(jìn)展?；?SETD2為靶點(diǎn)的表觀遺傳學(xué)研究目前正受到研究人員的重視。今后可在如下幾個方面深入研究：(1)明確 SETD2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)的突變現(xiàn)象及其規(guī)律，深入闡明常見腫瘤組織中 SETD2的突變熱點(diǎn)。分析常見腫瘤組織中SETD2突變與SETD2表達(dá)之間的關(guān)系。(2)充分闡明SETD2的病理生理作用?；诂F(xiàn)有的基因組編輯技術(shù)，有望獲得SETD2敲除或過表達(dá)動物模型，以這些動物模型為對象，分析SETD2表達(dá)異常與組織器官發(fā)育、分化及系統(tǒng)性疾病的關(guān)系。(3)SETD2可作為非組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，而非組蛋白的甲基化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。因此，有必要明確 SETD2對下游非組蛋白基因的甲基化修飾情況，從而有望發(fā)現(xiàn)新的致病機(jī)制。(4)深化基于SETD2靶點(diǎn)的藥物開發(fā)。2014年，Cancer Discovery雜志在“研究觀察”專欄中點(diǎn)評“SETD2是協(xié)同血液腫瘤發(fā)生和維持中的抑癌基因”的重要影響，因此SETD2作為一個新的分子治療靶點(diǎn)，已經(jīng)在急性白血病的診斷和治療等提供了新的機(jī)遇。其中，應(yīng)用高通量技術(shù)為 SETD2作用相關(guān)的藥物篩查提供了思路。

綜上，SETD2是一個有巨大潛力的腫瘤分子治療靶點(diǎn)，深入研究 SETD2在腫瘤形成和發(fā)展過程中的作用和機(jī)制，對于腫瘤的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。同時期待隨著表觀遺傳學(xué)的深入研究，對SETD2的表達(dá)調(diào)控通路作出新的解釋。