水稻籽粒厚度基因GT1的連鎖分析

李陛方

（蕉嶺縣長潭鎮(zhèn)農業(yè)農村服務中心，廣東 梅州 514185）

水稻是中國的第一大糧食作物，隨著我國人口的不斷增長，預計到2030年，我國糧食總量將要從2010年的5.8億噸增至7.4億噸方能滿足需要[1-2]，因此，提高水稻產量對我國的糧食安全具有重要的意義。

影響水稻產量最重要的因素之一是水稻的籽粒性狀，包括粒重、粒長、粒寬、粒厚和長寬比等，而且水稻籽粒性狀已成為水稻高產優(yōu)質分子設計育種的重要靶標性狀[3]。其中粒厚是水稻籽粒性狀的重要組成部分，是水稻重要的經濟性狀。熊振民和孔繁林通過對秈稻的9個雜交組合進行研究，發(fā)現水稻的籽粒性狀中粒厚與粒重的關系最為密切，粒厚是受多基因控制的粒形性狀[4]。水稻粒厚性狀的遺傳機制較為復雜，同時國內外學者對水稻粒厚性狀的遺傳研究報道也較為少見，因此有必要對水稻粒厚性狀進行適當的研究。

經多年觀察，水稻的粒厚性狀與巨胚性狀可能存在連鎖遺傳，本研究通過調查分析表現型為厚粒正常胚的水稻品種XHZ和表現型為薄粒巨胚的水稻品種JPHN兩親本雜交后代F2群體的田間表現，證明巨胚性狀與粒厚性狀的連鎖關系，然后利用巨胚基因GE附近的一些分子標記引物對兩個親本進行多態(tài)性標記篩選，嘗試對粒厚基因GT1作進一步的定位分析。通過定位粒厚基因，尋找控制粒厚的關鍵基因，為今后開展進一步的粒厚基因精細定位、克隆和功能分析，對闡明水稻籽粒性狀遺傳控制和產量形成的機理，具有重要的研究意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

兩個水稻品種：XHZ和JPHN為親本材料。XHZ是水稻品種新黃占，該品種的籽粒為厚粒，胚為正常胚；JPHN是水稻品種巨胚黑糯，該品種的籽粒為薄粒，胚為巨胚。

1.2 方法

1.2.1 提取親本DNA進行多態(tài)性標記篩選

預計巨胚性狀與粒厚性狀連鎖，在巨胚基因附近設計了9對分子標記物在兩親本間進行多態(tài)性標記篩選。9對分子標記的引物序列以及片段大小見表1。

表1 用于兩親本間多態(tài)性篩選的分子標記

1.2.2 提取DNA并進行PCR擴增

提取兩個親本材料XHZ和JPHN的DNA，然后，使用適當的引物分別對其進行PCR擴增。運行反應的程序為：95℃變性4 min，循環(huán)（95℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃適溫延伸 40 s），一共 40 個循環(huán)，72℃延伸10 min，最后 15℃保存[5]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，觀察電泳圖譜的成像結果，拍照分析并保存。

1.2.4 田間種植

利用這兩個品種XHZ和JPHN進行雜交得到其親本及F1代雜交種子。進行篩選工作剔除假雜種，播種F2代種子，后進行插秧工作，田間種植26行，以數字編號1～26，每行40株，以數字編號1～40，插秧時確保單本插秧。統(tǒng)一栽培管理，保持田間肥水一致，得到F2代群體約1 000株。水稻成熟時，在約1 000株系中每個株系隨機收獲3穗，自然晾干后進行考種工作。

1.2.5 巨胚的觀察與統(tǒng)計

在每個樣本中，隨機選取5粒完整無損的稻谷，剝去稻殼，露出完好的稻米籽粒，觀察胚的大小，記錄出現巨胚的樣本。

1.2.6 粒厚的測定

水稻籽粒厚度的測定標準參照《水稻種質資源描述規(guī)范和數據標準》[6]。實驗方法：隨機數取完整無損的10粒稻谷，將稻谷肩并肩側豎于膠帶上，使其不傾斜，不留縫，測出厚度，每份材料重復測量2次，取其平均值即為粒厚。

1.2.7 數據分析

利用Excel軟件計算水稻粒厚的均值，統(tǒng)計F2群體中厚粒正常胚、薄粒巨胚、厚粒正常胚和厚粒巨胚四種表現型的樣本數目，觀察其頻率分布并計算重組率，判斷粒厚與巨胚之間是否存在連鎖。

2 結果與分析

2.1 親本的表型分析

測量兩親本的粒厚，并觀察其胚型。兩親本的表型情況見表2。親本XHZ的粒厚性狀表現為厚粒，胚的性狀表現為正常胚；親本JPHN的粒厚性狀表現為薄粒，胚的性狀表現為巨胚。

表2 兩親本的表現型

2.2 巨胚與粒厚的連鎖分析

F2群體四種表現型的分離情況如表3所示。在F2群體中，厚粒正常胚和薄粒巨胚為親本型，薄粒正常胚和巨胚為重組型，根據重組率的計算公式：重組率（%）=（重組型個體數/測交子代的個體總數）×100%，可以計算出F2群體1～8、9～16、17～26及總群體1～26的重組率分別為25.60%、24.40%、28.50%和26.40%。因此，可以知道控制巨胚的基因與控制粒厚的基因存在連鎖關系。粒厚與巨胚兩個基因之間的重組率為26.40%，連鎖距離為26.40 cm。

表3 F2群體各表型的分離情況及重組率

2.3 親本間多態(tài)性標記篩選

因為水稻巨胚基因GE與粒厚基因GT1是連鎖的，在巨胚基因GE附近找到這9對分子標記引物：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18 和RM47，對兩個親本XHZ和JPHN進行多態(tài)性分子標記篩選，結果顯示并未能利用這9對分子標記引物篩選到兩者存在多態(tài)性，因此無法對粒厚基因進行進一步的定位分析。

3 結論

本研究對XHZ和JPHN兩個親本雜交后代F2群體四種表型，即厚粒正常胚、薄粒巨胚、薄粒正常胚和厚粒巨胚的分離情況進行統(tǒng)計分析后發(fā)現，水稻籽粒厚度基因與巨胚基因是連鎖的，根據重組率計算公式可以計算出兩個基因之間的重組率為26.40%，連鎖距離為26.40 cm。

本研究通過統(tǒng)計分析XHZ和JPHN雜交后代F2四種表型的分離情況，驗證了水稻巨胚基因與籽粒厚度基因的連鎖關系，然后利用了巨胚基因GE附近的9對分子 標 記 引 物 ：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18和RM47，試圖使用這些引物在兩個親本XHZ和JPHN之間進行多態(tài)性分子標記篩選，嘗試對水稻籽粒厚度基因作進一步的基因定位。然而在實際操作中，未能成功地利用這9對分子標記引物篩選出兩個親本的多態(tài)性，無法進行下一步的粒厚基因定位。因此，今后應使用更多的分子標記引物去進行它們的多態(tài)性分子標記篩選，完成水稻籽粒厚度基因的定位分析。對粒厚基因進行定位分析，可以幫助了解水稻產量性狀的分子調節(jié)機制，同時也可以在生產實踐中提高水稻產量提供更多的利用途徑。隨著更多的水稻籽粒性狀相關基因的定位、QTL克隆和相關功能研究，將會更加了解水稻籽粒性狀控制的分子機制，掌握水稻產量性狀復雜的遺傳機理，為水稻高產分子育種提供相應的理論依據，并在水稻分子育種的實踐中得到應用。