紅冠桉種子外植體組培體系的建立

劉欣，黃振，陳炙，李佳蔓，郭洪英

紅冠桉種子外植體組培體系的建立

劉欣，黃振，陳炙，李佳蔓，郭洪英

(四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081)

紅冠桉是重要的觀賞性桉樹，種苗供應(yīng)不足是限制其發(fā)展的瓶頸所在。本研究以紅冠桉種子為外植體，研究萌發(fā)、增殖、生根技術(shù)，結(jié)果表明：紅冠桉種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為改良MS+0.5 mg·L6-BA+0.2 mg·LIBA+30 g·L蔗糖+6 g·L瓊脂，種子萌發(fā)率達(dá)68.86%；最佳的增殖培養(yǎng)基為1/2改良MS+0.3 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+30 g·L蔗糖+6 g·L瓊脂，接種后，首先暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度3 000 lx的LED燈下，每日光照10 h，增殖系數(shù)4 ~ 6；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2改良MS+0.2 mg·LNAA+0.1 mg·LIBA+15 g·L蔗糖+6 g·L瓊脂，生根率77.5%。

紅冠桉；種子；增殖；生根

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬()、杯果木屬()和傘房屬()樹種的統(tǒng)稱，共有808個(gè)種和137個(gè)亞種或變種，其中觀賞價(jià)值較高的樹種有100多種。與其他觀賞植物相比，觀賞桉樹具有易管理、抗病抗蟲能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于庭院及公園栽培、街道綠化等，紅冠桉()是其中有代表性的紅花類型紅冠桉為桃金娘科桉屬中等喬木，樹干灰白色，高8 ~ 10 m，自然分布在澳大利亞西部和北部，喜溫濕環(huán)境，是開花桉樹中很漂亮的品種之一，原產(chǎn)地花期集中在每年9月到次年3月，大型頭狀花序顯著高出葉面，花序直徑可達(dá)7 cm，盛花期蔚為壯觀。紅冠桉已在廣東、福建和海南等地引種。其苗木主要來源于實(shí)生苗，種子完全依賴進(jìn)口嚴(yán)重制約了紅冠桉的應(yīng)用。

2019年，課題組從澳大利亞引種了一批紅冠桉種子，播種發(fā)現(xiàn)萌發(fā)率不足50%，顯微觀察發(fā)現(xiàn)部分未萌發(fā)種子形態(tài)正常、種子結(jié)構(gòu)完整，表明種子內(nèi)可能存在某些抑制種胚萌發(fā)的物質(zhì)。本研究擬通過組織培養(yǎng)的方法，打破種子休眠，提高種子萌發(fā)率，建立紅冠桉組培再生技術(shù)體系，以期獲得盡可能多的紅冠桉無性系，為下一步紅冠桉在四川的引種馴化奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為2019年從澳大利亞引進(jìn)的紅冠桉種子。取外觀飽滿、無病蟲害的種子，先用流水沖刷30 s去掉雜質(zhì)和漂浮物，瀝干水分后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)備用。依次用75%酒精浸泡30 s、0.1%氯化汞浸泡3 min，無菌水洗4 ~ 5次后備用。

1.2 萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

以改良MS為基本培養(yǎng)基，將消毒后的種子接入初代培養(yǎng)基(表1)，每瓶接種1粒，7 d后去掉污染瓶。25 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)，每個(gè)處理隨機(jī)挑選30瓶，3次重復(fù)，10瓶·重復(fù)。

1.3 增殖培養(yǎng)基篩選

萌發(fā)的苗長至2 ~ 3 cm時(shí)，剪去子葉和根，剪成帶有1 ~ 2個(gè)腋芽的莖段，接種到增殖培養(yǎng)基(表2)，每瓶接種2個(gè)。培養(yǎng)條件：溫度27℃，光照3 000 lx。30 d后觀察記錄莖段的生長狀態(tài)。

1.4 生境對(duì)增殖效率的影響

以1.3獲得最佳增殖培養(yǎng)基為CK，以光照時(shí)間和燈源為因素(表3)，比較不同培養(yǎng)環(huán)境對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響。每處理隨機(jī)選擇30個(gè)芽苗，分別統(tǒng)計(jì)每株芽苗上新生的腋芽對(duì)數(shù)量，每個(gè)處理的平均每株腋芽對(duì)數(shù)量即為平均增殖系數(shù)。

1.5 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

選取長2 ~ 3 cm，節(jié)間均勻，葉片完全展開的帶頂?shù)难拷臃N到生根培養(yǎng)基(表4)，每瓶接種10株，每個(gè)處理40瓶，4次重復(fù)，10瓶·重復(fù)。培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照4 000 lx。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率及芽苗生長狀態(tài)。將紅冠桉生根苗放置在4 000 ~ 5 000 lx的光照，25℃溫度下培養(yǎng)7 ~ 10 d后，將其移至大棚進(jìn)行煉苗。在大棚逐漸增強(qiáng)光照，使苗木更好地適應(yīng)外部環(huán)境。當(dāng)生根苗基部長出3 ~ 5條根，根長2 ~ 3 cm時(shí)，可出瓶移栽。移栽基質(zhì)為椰糠、珍珠巖、細(xì)泥炭(V：V：V=1：1：2)。

1.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基pH為5.8 ~ 6.2，瓊脂6 g·L；誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基蔗糖濃度為30 g·L，生根培養(yǎng)基蔗糖濃度為15 g·L。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

種子平均萌發(fā)率和平均增殖系數(shù)在DPS16.05中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，百分?jǐn)?shù)反正弦平方根轉(zhuǎn)換后用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

由表1可知，CK中的發(fā)芽率與自然播種的發(fā)芽率類似，均低于50%。添加了激素后，紅冠桉種子在含有激素的培養(yǎng)基中的發(fā)芽率均顯著高于CK，但處理間差異顯著。其中處理3中的種子平均萌發(fā)率顯著高于其他處理，而在增加了6-BA濃度后(處理1)，種子萌發(fā)率反而下降，具體表現(xiàn)有部分種子膨大，長出的子葉畸形有褶皺，表明高濃度的6-BA對(duì)種子形態(tài)造成了影響。而把IBA更換為NAA后(處理2、4、5)，各處理的部分種子出現(xiàn)了愈傷化跡象，少數(shù)種子誘導(dǎo)出愈傷組織后死亡，因此，在種子萌發(fā)階段，培養(yǎng)基中不宜出現(xiàn)NAA。

當(dāng)培養(yǎng)基中含有GA時(shí)(處理6、7)，與CK相比，能顯著提高種子萌發(fā)率，但效果沒有是生長素和分裂素組合的效果好。

綜上所述，優(yōu)選處理3為紅冠桉種子萌發(fā)最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 增殖培養(yǎng)基篩選

繼代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，幼苗莖段在處理3中繼續(xù)培養(yǎng)1 ~ 2代后極易出現(xiàn)玻璃化，節(jié)間縮短及黃化的問題，增殖倍數(shù)不足1.5倍，因此，當(dāng)幼苗萌發(fā)后，則需要更換增殖培養(yǎng)基。

由圖1可知，處理A、G中增殖苗不能正常生長，腋芽位壓縮，莖段無法正常伸長，并且伴有輕微玻璃化；處理B、H中增殖苗出現(xiàn)明顯玻璃化，腋芽位壓縮，莖段無法正常伸長；處理C、I增殖苗葉片出現(xiàn)明顯黃化，葉和芽的生長受到明顯抑制，苗子生長緩慢；處理D、J增殖苗腋芽正常生長，葉片正常展開，葉呈長矛型；處理E、K增殖苗葉、芽、莖均受到抑制，葉黃化，根的生長得到促進(jìn)作用，有的開始出現(xiàn)根的分化；處理F、L增殖苗的芽受到嚴(yán)重抑制，弱小的增殖苗出現(xiàn)明顯的枯死現(xiàn)象。因此，從增殖效果來看，處理J是紅冠桉莖段最佳增殖培養(yǎng)基。

表2結(jié)果表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NAA濃度相同的情況下，6-BA在0.3 mg·L時(shí)達(dá)到最佳濃度；6-BA達(dá)到0.5 mg·L時(shí)，組培苗出現(xiàn)玻璃化，可能是高濃度的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)乙烯的合成和積累，但6-BA濃度降低至0.1 mg·L時(shí)，莖段生長緩慢；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和6-BA濃度相同的情況下，低濃度NAA(0.1 mg·L)中的莖段生長情況均好于高濃度NAA(0.2 mg·L)中的莖段，高濃度NAA中的莖段腋芽位受抑制；在NAA和6-BA均相同時(shí)，1/2改良MS培養(yǎng)基均好于MS改良培養(yǎng)基，具體表現(xiàn)為：葉子展開程度更大，莖段生長更快，芽生長更好。

綜上可知，紅冠桉莖段最佳增殖培養(yǎng)基為1/2改良MS+0.3 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA。增殖倍數(shù)為4 ~ 6。

表1 紅冠桉種子萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

注：相同字母表示>0.05。

圖1 紅冠桉增殖培養(yǎng)基篩選

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)繼代增殖的影響

常規(guī)生根管理的紅冠桉平均增殖系數(shù)為3.67，改用相同光照強(qiáng)度的LED燈后，處理1中的新生腋芽萌發(fā)率提高了，但12 h的光照時(shí)間后，頂芽和部分新生腋芽焦枯或者容易發(fā)黃，推測(cè)原因是LED能量高于日光燈，12 h的光照對(duì)紅冠桉組培苗有灼傷作用。當(dāng)LED等光照時(shí)間降低至10 h時(shí)，顯著提高了增殖系數(shù)。處理3在莖段接種后，增加了7 d的暗培養(yǎng)，導(dǎo)致莖段在這段時(shí)間出現(xiàn)了徒長，有利于拉長節(jié)間距離，在轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)后，芽苗1 d后完成了轉(zhuǎn)綠，且增殖系數(shù)最高，同時(shí)，芽苗高了后，也大大降低了生根材料接種的難度，從而顯著提高了生產(chǎn)效率。因此，在紅冠桉的組織培養(yǎng)生產(chǎn)過程中，需要根據(jù)增殖苗的生長狀態(tài)，進(jìn)行一定時(shí)間的避光處理，來提高生產(chǎn)效率。

表2 紅冠桉增殖培養(yǎng)基篩選

表3 紅冠桉增殖培養(yǎng)環(huán)境篩選

圖2 紅冠桉增殖苗與生根苗特性

注：A為增殖處理3；B為生根處理2。

2.4 生根培養(yǎng)基篩選

芽苗接入生根培養(yǎng)基10 d后基部開始出現(xiàn)根點(diǎn)，20 d后基本生根完成，根長2 ~ 3 cm，以處理2的生根率最高(表4)，提高NAA濃度，芽苗基部容易產(chǎn)生愈傷組織，提高IBA濃度，反而抑制了根的生長。移栽苗長勢(shì)見圖3。

表4 紅冠桉組培苗生根培養(yǎng)基篩選

圖3 紅冠桉組培苗移栽

3 結(jié)論與討論

桉樹的組織培養(yǎng)，常使用經(jīng)過子代測(cè)定或者選優(yōu)的優(yōu)樹萌芽材料做為外植體，以期保留優(yōu)樹的遺傳增益，而種子常因?yàn)檫z傳分化導(dǎo)致其表現(xiàn)與母本有差異，因此，種子外植體一般不用于以用材為目的的桉樹組培，而觀賞桉樹則需要獲得盡可能多的變異植株，為開發(fā)觀賞型桉樹新品種創(chuàng)造條件。

組織培養(yǎng)的關(guān)鍵是獲得合適的外植體。種子作為穩(wěn)定的幼嫩材料，常作為外植體，用于制備無菌苗和胚性愈傷組織。本研究在原有種子萌發(fā)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，把種子作為外植體放入含有激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得了比常規(guī)GA打破休眠更好的萌發(fā)效果。

芽苗增殖中發(fā)現(xiàn)，在溫度27℃、光照3 000 lx LED環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到0.5 mg·L時(shí)，均容易出現(xiàn)玻璃化；當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.2 mg·L時(shí)，會(huì)出現(xiàn)玻璃化，腋芽位壓縮及黃化甚至枯死，因此，生長調(diào)節(jié)劑濃度超過范圍則影響組培苗的生長，研究表明，高濃度的6-BA會(huì)誘導(dǎo)乙烯合成，最終導(dǎo)致玻璃化。這與高麗瓊等和楊艷等研究的增殖苗的6-BA和NAA最佳使用濃度有所不同，可能是因?yàn)檫x擇的外植體材料不同，本研究選擇的是種子，紅冠桉種子作為外植體材料進(jìn)行組織培養(yǎng)在同等的6-BA和NAA濃度下能夠達(dá)到更好的增殖效果和增殖倍數(shù)，從而導(dǎo)致本研究中的增殖苗在增殖過程中，外源激素濃度不能過高使用，6-BA和NAA濃度過高反而抑制了增殖苗的生長。本研究在較低濃度外源激素下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得了較高的增殖倍數(shù)，增殖倍數(shù)達(dá)到4 ~ 6倍。并將其中生長的增殖苗轉(zhuǎn)移到了生根培養(yǎng)基中生根，發(fā)現(xiàn)在較低激素濃度時(shí)，NAA為0.2 mg·L、IBA為0.05 mg·L，就能達(dá)到較高的生根率，生根率最高達(dá)78.7%，這與高麗瓊等和楊艷等紅冠桉生根的結(jié)果有差異。

本研究以引種的紅冠桉種子為材料，建立了紅冠桉植株再生技術(shù)體系，誘導(dǎo)獲得了一批無性系組培苗，下一步課題組將擴(kuò)大無性系群體，為建立紅冠桉無性系測(cè)定林奠定材料基礎(chǔ)。

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Establishment of Tissue Culture Systems forSeed

LIU Xin, HUANG Zhen, CHEN Zhi, LI Jiaman, GUO Hongying

()

is an important ornamental species of, but a shortage of seed is a bottleneck that restricts the species’ domestication and development. In this study,seeds were used as explants to study germination, shoot proliferation and rooting in tissue culture. The experimental results showed that the best media for the germination of seeds was modified MS + 0.5 mg·L6-BA + 0.2 mg·LIBA + 30 g·Lsucrose + 6 g·Lagar, and this provided a seed germination rate of 68.9%. The best media for shoot multiplication was 1/2 modified MS + 0.3 mg·L6-BA + 0.1 mg·LNAA + 30 g·Lsucrose + 6 g·Lagar. After inoculation, culturing in the dark for 7 days and then transferring to a place with 3 000 lx LED light for 10 hours a day provided a proliferation coefficient of 4 ~ 6. The best media for rooting proved to be 1/2 modified MS + 0.2 mg·LNAA + 0.1 mg·LIBA + 15 g·Lsucrose + 6 g·Lagar, which provided a rooting rate of 77.5%.

; seed; proliferation; rooting

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2021.01.009

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2020ZHYZ0008)；四川省省財(cái)政專項(xiàng)項(xiàng)目(2020CZZX18)

劉欣(1997— )，女，本科，研究實(shí)習(xí)員，主要從事組織培養(yǎng)研究，E-mail:2889792053@qq.com

陳炙(1977— )，男，本科，高級(jí)工程師，主要從事林木遺傳育種研究