子癇前期孕婦血漿外泌體中LncRNA MALAT1和miR-206的表達(dá)水平及臨床意義

葉 青 翟桂榮 吳 允 楊慧麗

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種在妊娠期發(fā)生的以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣鞯难苄约膊。l(fā)病率約4%～8%，可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和宮內(nèi)窒息，是威脅孕婦和新生兒健康和生命安全的主要原因之一。因此，PE的早期診斷對(duì)降低孕婦與新生兒病死率、提高母嬰健康有重要意義。研究表明，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力不足、炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮功能障礙是PE發(fā)生的主要機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(Long non-coding RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，LncRNA MALAT1)在PE患者胎盤(pán)中表達(dá)下調(diào)，可能在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用。急性冠脈綜合癥患者血漿微小RNA-206(microRNA-206，miR-206)表達(dá)水平上調(diào)，與血管內(nèi)皮功能障礙引起的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。外泌體是一種具有磷脂雙分子層的胞外囊泡，包含多種生物活性分子，在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物進(jìn)程調(diào)控等方面意義重大。LncRNA MALAT1與miR-206在腫瘤血管生成和炎癥反應(yīng)調(diào)控中被證實(shí)存在靶向關(guān)系，但其在PE患者外泌體中表達(dá)水平及作用機(jī)制鮮有研究，另血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)已被證實(shí)與PE進(jìn)展密切相關(guān)。本研究擬通過(guò)檢測(cè)PE患者血漿外泌體中LncRNA MALAT1、miR-206表達(dá)水平，探究LncRNAMALAT1、miR-206對(duì)PE的診斷價(jià)值，以期為探討PE發(fā)生相關(guān)機(jī)制及臨床評(píng)估PE進(jìn)展提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年12月在鄭州市婦幼保健院住院分娩的PE孕婦42例為研究對(duì)象(PE組)，另選取同期在本院分娩的健康孕婦42例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PE患者符合《婦產(chǎn)科學(xué)》中關(guān)于PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②單胎妊娠者；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病、腎病、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；②孕期有特殊用藥史者；③合并精神疾病者。根據(jù)入組PE患者病情嚴(yán)重程度分為輕度組22例，重度組20例。收集所有研究對(duì)象入院時(shí)年齡、孕周、孕前身體質(zhì)量指數(shù)(body mass inedx，BMI)、孕次、產(chǎn)次及收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、血肌酐(Serum creatinine，Scr)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine transaminase，ALT)水平等一般資料。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 血漿樣本采集及外泌體提取 分別收集PE患者入院時(shí)及健康孕婦體檢時(shí)清晨空腹外周血5 mL置于EDTA采血管中，離心分離血漿。使用外泌體提取試劑盒(貨號(hào)：76064，德國(guó)Qiagen公司)提取血漿外泌體。參照試劑盒說(shuō)明，將所得血漿中加入100 μL提取劑于4℃環(huán)境下過(guò)夜，過(guò)夜后再離心、棄上清，重復(fù)2次，最后使用100 μL的磷酸鹽緩沖液重懸，得到外泌體。

1.2.2 血漿外泌體形態(tài)鑒定 使用透射電子顯微鏡(型號(hào)：HT7800，日本日立公司)觀察血漿外泌體形態(tài)。取20 μL外泌體重懸液于銅網(wǎng)上靜置5～10 min，濾紙吸干外圍液體后滴加4%磷鎢酸溶液染色10 min，染色完成后于燈下烤干，復(fù)染1次后使用透射電子顯微鏡觀察、拍照。透射電鏡下橢圓形/圓形的雙層膜囊狀結(jié)構(gòu)為外泌體。

1.2.3 血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF mRNA表達(dá)水平。Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：205311，德國(guó)Qiagen公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR反應(yīng)。使用qRT-PCR試劑盒(批號(hào)：RR041A，日本TaKaRa公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，20 μL反應(yīng)體系如下：10 μL SYBRPrimix Ex Taq，0.4 μL ROX，2 μL cDNA，2 μL上游引物，2 μL下游引物，3.6 μL DEPC水。反應(yīng)程序如下：95℃、8 min，1個(gè)循環(huán)；95℃、15 s，62℃、38 s，73℃、15 s，40個(gè)循環(huán)，一個(gè)樣品設(shè)置三次重復(fù)。采用2法計(jì)算血漿外泌體LncRNA MALAT1(以GAPDH為內(nèi)參)、miR-206(以U6為內(nèi)參)、VEGF mRNA(以GAPDH為內(nèi)參)表達(dá)水平，試驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組年齡、取樣孕周、孕前BMI、孕次、產(chǎn)次比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。對(duì)照組、輕度組、重度組收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、Scr、ALT依次升高，新生兒體質(zhì)量依次降低，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；重度組孕婦分娩孕周明顯短于輕度組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組一般資料比較

2.2 血漿外泌體透射電鏡形態(tài)鑒定 透射電鏡下血漿外泌體呈圓或橢圓形，具有雙層磷脂包圍的囊泡樣結(jié)構(gòu)，單個(gè)分布，直徑約100 nm。見(jiàn)圖1。

圖1 血漿外泌體透射電鏡圖(67 000倍)

2.3 3組血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF表達(dá)水平比較 重度組和輕度組孕婦血漿外泌體LncRNA MALAT1、VEGF表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，miR-206表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；重度組LncRNA MALAT1、VEGF明顯低于輕度組，miR-206明顯高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF表達(dá)水平比較

2.4 LncRNA MALAT1、miR-206和VEGF的相關(guān)性 LncRNA MALAT1與miR-206呈負(fù)相關(guān)(

r

=-0.570，

P

<0.05)，與VEGF呈正相關(guān)(

r

=0.374，

P

<0.05)，miR-206與VEGF呈負(fù)相關(guān)(

r

=-0.501，

P

<0.05)。見(jiàn)圖2～4。

圖2 LncRNA MALAT1與miR-206的相關(guān)性

圖3 LncRNA MALAT1與VEGF的相關(guān)性

圖4 miR-206與VEGF的相關(guān)性

2.5 PE發(fā)生的影響因素分析 以本研究資料為樣本，以年齡、孕周、孕前BMI、孕次、產(chǎn)次、收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、Scr、ALT、LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF為自變量，以PE是否發(fā)生為因變量建立logistic回歸模型，選擇逐步向前法，行LR檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，高舒張壓、24 h蛋白尿、miR-206水平及低LncRNA MALAT1、VEGF水平是PE發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

P

<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 單因素分析結(jié)果

表5 多因素logistic回歸分析結(jié)果

2.6 LncRNA MALAT1、miR-206對(duì)PE發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值 以受試者血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206檢測(cè)值及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)概率值為檢驗(yàn)變量，以PE是否發(fā)生為因變量進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，LncRNA MALAT1預(yù)測(cè)PE發(fā)生的曲線下面積為0.726(95%CI：0.613～0.840)，當(dāng)截?cái)嘀禐?.84時(shí)，其敏感度為73.81%、特異度為71.43%。miR-206預(yù)測(cè)PE發(fā)生的曲線下面積為0.748(95%CI：0.639～0.858)，當(dāng)截?cái)嘀等?.85時(shí)，其敏感度為70.67%、特異度為83.33%。此二者聯(lián)合預(yù)測(cè)PE發(fā)生的曲線下面積為0.872(95%CI：0.781～0.935)，敏感度為92.86%、特異度為80.95%。見(jiàn)圖5。

圖5 LncRNA MALAT1、miR-206單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)PE發(fā)生的ROC曲線

3 討論

PE患者胎盤(pán)易出現(xiàn)缺氧缺血，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，可增加多種母嬰并發(fā)癥及母嬰死亡發(fā)生率，探究PE進(jìn)展中相關(guān)因子的變化對(duì)評(píng)估PE發(fā)生，及時(shí)控制患者病情有重要意義。研究報(bào)道，胎盤(pán)形成時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮肌層的侵襲能力不足易造成子宮螺旋動(dòng)脈重塑障礙及胎盤(pán)淺著床，進(jìn)而導(dǎo)致孕晚期時(shí)胎盤(pán)灌注低、炎癥反應(yīng)增加和血管內(nèi)皮功能形成障礙，最終導(dǎo)致PE發(fā)生。

外泌體是一種由紅細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞分泌的囊泡，分布于生物體細(xì)胞、體液和胎盤(pán)中，可參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，與胎盤(pán)功能紊亂有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，血漿外泌體LncRNA MALAT1表達(dá)水平由高到低依次為對(duì)照組、輕度組、重度組，與Li等研究LncRNA MALAT1在早發(fā)性子癇患者胎盤(pán)組織中呈低表達(dá)結(jié)果相似，提示血漿外泌體LncRNA MALAT1低表達(dá)可能參與PE發(fā)生、發(fā)展。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1水平降低時(shí)，可通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化引起滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移能力減弱和血管生成減少，導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)損傷加重。本研究發(fā)現(xiàn)，PE孕婦血漿外泌體中LncRNA MALAT1與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示血漿外泌體中LncRNA MALAT1水平的下調(diào)可能是通過(guò)調(diào)控VEGF表達(dá)進(jìn)而抑制血管生成，促進(jìn)PE進(jìn)展。但本研究納入樣本量較少，為驗(yàn)證血漿外泌體LncRNA MALAT1與VEGF表達(dá)水平在PE中的作用，有待增加樣本量進(jìn)行深入研究。

微小RNA多存在于外泌體中，其水平變化參與調(diào)控多種生物學(xué)進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，PE患者胎盤(pán)組織和滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-206表達(dá)水平上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，重度組血漿外泌體miR-206表達(dá)水平最高，其次為輕度組，對(duì)照組最低，與Akehurst等研究結(jié)果一致，提示miR-206高表達(dá)可能預(yù)示PE發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可促進(jìn)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力和血管生成；而過(guò)表達(dá)miR-206可減少外泌體產(chǎn)生，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制血管生長(zhǎng)。本研究中，血漿外泌體中miR-206與VEGF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示血漿外泌體中miR-206與VEGF間可能存在調(diào)控作用，此結(jié)果與Li等研究血漿miR-206水平上調(diào)可通過(guò)下調(diào)VEGF表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩結(jié)果類似。提示血漿外泌體miR-206表達(dá)可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)VEGF水平影響胎盤(pán)血管生成，進(jìn)而參與PE進(jìn)展，此結(jié)果尚需增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)，血管瘤組織中LncRNA MALAT1、VEGF均呈高表達(dá)，而miR-206呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)LncRNA MALAT1可靶向抑制miR-206表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)VEGF水平，促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及血管生成。本研究多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，高miR-206水平及低LncRNA MALAT1水平是影響PE發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)PE發(fā)生的價(jià)值高于兩者單獨(dú)預(yù)測(cè)，提示臨床應(yīng)關(guān)注血漿外泌體LncRNA MALAT1及miR-206表達(dá)的變化，以期能更準(zhǔn)確的評(píng)估PE發(fā)生及進(jìn)展。

綜上所述，PE患者血漿外泌體中LncRNA MALAT1呈低表達(dá)、miR-206呈高表達(dá)，兩者均是PE發(fā)生的危險(xiǎn)因素，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PE的診斷價(jià)值高于兩者單獨(dú)檢測(cè)。但由于LncRNA MALAT1與miR-206作用機(jī)制復(fù)雜，本研究?jī)H從VEGF入手推測(cè)，相關(guān)作用機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證。