PTEN基因突變、mRNA表達與卵巢癌病理生物學特征的相關(guān)性探討

劉爽

【摘要】 目的：探討第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（PTEN）基因突變、mRNA表達與卵巢癌病理生物學特征的相關(guān)性。方法：選擇2018年1月-2020年2月本院62例卵巢癌患者作為觀察組，另選擇同期于本院治療的48例卵巢良性腫瘤患者作為對照組。對照組術(shù)中取病灶組織，觀察組術(shù)中取卵巢癌組織與癌旁組織。采用PCR-SSCP完成觀察組基因突變檢測;采用實時熒光PCR法測定不同組織中PTEN mRNA水平;分析PTEN mRNA水平與卵巢癌病理生物學特征的相關(guān)性。結(jié)果：卵巢癌組織PTEN基因突變分析結(jié)果顯示，外顯子5第5位密碼子T突變?yōu)镃，經(jīng)Blast P比較發(fā)現(xiàn)氨基酸由絲氨酸（S）變?yōu)楸奖彼幔‵）。觀察組中卵巢癌組織PTEN mRNA水平低于癌旁組織和對照組中漿液性囊腺瘤與黏液性囊腺瘤組織（P<0.05）。不同年齡、組織學類型及組織分級的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;不同F(xiàn)IGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PTEN mRNA水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：PTEN基因突變參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，且PTEN mRNA在癌組織呈低表達，與卵巢癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 PTEN基因 mRNA表達 卵巢癌 生物學特征

Correlation between PTEN Gene Mutation， mRNA Expression and Pathological and Biological Characteristics of Ovarian Cancer/LIU Shuang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： -140

[Abstract] Objective： To investigate the correlation between the mutation and mRNA expression of the phosphatase and tensin homolog gene （PTEN） gene deletion on chromosome 10 and the pathobiological characteristics of ovarian cancer. Method： From January 2018 to February 2020， 62 patients with ovarian cancer in our hospital were selected as the observation group， another 48 patients with benign ovarian tumors treated during the same period in our hospital were selected as the control group. The focal tissue was taken from the control group， and the ovarian cancer tissue and paracancer tissue were taken from the observation group. PCR-SSCP was used to detect gene mutation in the observation group. PTEN mRNA levels in different tissues were determined by real-time fluorescence PCR. The correlation between PTEN mRNA level and the pathologic characteristics of ovarian cancer was analyzed. Result： Analysis of PTEN mutations in ovarian cancer tissue showed that， codon T at position 5 of exon 5 mutation to C， the amino acid changed from serine （S） to phenylalanine （F） by comparison with Blast P. The PTEN mRNA level in the observation group was lower than those in the paracancer tissues and serous cystadenoma and myxoid cystadenoma tissues in the control group （P<0.05）. There was no significant difference in PTEN mRNA level among different age， histological type and tissue grade of ovarian cancer patients （P>0.05）. PTEN mRNA levels were statistically significant in ovarian cancer patients with different FIGO stages and with or without lymph node metastasis （P<0.05）. PTEN mRNA level was negatively correlated with FIGO stage and lymph node metastasis （P<0.05）. Conclusion： PTEN gene mutation is involved in the occurrence and development of ovarian cancer， and PTEN mRNA expression is low in cancer tissues， which is correlated with ovarian cancer FIGO stage and lymph node metastasis.

[Key words] PTEN gene mRNA expression Ovarian cancer Biological characteristics

First-author’s address： Xinmin Municipal People’s Hospital， Xinmin 110300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.033

卵巢癌是病灶位于卵巢的惡性腫瘤，其發(fā)病與遺傳、激素因素水平存在緊密的聯(lián)系[1]。既往研究表明：卵巢癌能發(fā)生在任何年齡段人群中，其組織學類型多樣，主要為上皮來源，發(fā)病早期臨床癥狀不易發(fā)現(xiàn)，導致臨床診療難度較大[2]。手術(shù)治療是卵巢癌患者常用的治療方法，但是患者治療后復發(fā)率較高，其預后與腫瘤病理類型、分期、治療方案等有關(guān)[3];而化療患者治療耐藥性日益嚴重，臨床上找到相關(guān)耐藥因子，預測化療耐藥、調(diào)整治療方案對改善患者預后具有重要意義[4]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（PTEN）屬于是一種抑癌基因，亦是卵巢癌患者耐藥的基因之一，具有雙向特異性磷酸酶活性[5-6]。既往研究表明：PTEN基因既有蛋白酪氨酸磷酸活性，亦可通過多種途徑激活磷酸酶活性，從而誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性中發(fā)揮了重要作用[7]。但是，PTEN基因與卵巢癌生物學特征的關(guān)系研究較少[8-9]。本研究以卵巢癌患者和卵巢良性腫瘤患者為對象，探討PTEN基因突變、mRNA表達與卵巢癌病理生物學特征的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月-2020年2月本院62例卵巢癌患者作為觀察組，另選擇本院同期治療的48例卵巢良性腫瘤患者作為對照組。納入標準：（1）符合卵巢癌和卵巢良性腫瘤診斷標準，均經(jīng)病理組織檢查確診;（2）具有完整的基線資料且患者術(shù)前未進行放化療、生物免疫治療;（3）均擬行手術(shù)治療，術(shù)中獲得完整的病灶組織/癌旁組織。排除標準：（1）精神異常、免疫系統(tǒng)疾病或代謝性疾病者;（2）凝血功能異常、其他部位惡性腫瘤后伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者。本研究均獲得醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）病灶組織的采集。兩組均擬行手術(shù)治療，對照組術(shù)中取病灶組織，觀察組術(shù)中取癌組織與癌旁組織（距癌組織≥3 cm）;石蠟包埋后，制備5 μm厚度的切片，備用[10]。（2）儀器與設(shè)備。cDNA第一鏈合成預混試劑盒（購自北京天根公司）、Talent熒光定量檢測試劑盒（購自北京天根公司）、熒光定量PCR儀（購自美國Bio-rad公司）。（3）PCR-SSCP和DNA測序，采用PCR技術(shù)對觀察組卵巢癌組織DNA樣品中完成PTEN基因外顯子5擴增（正向引物：5’-TCCAATAGAAAAATGGTG-3’;反向引物：5’-TGCCCCGATGTAATAAAT-3’）[11-12]。取最終獲得的PCR擴增產(chǎn)物3 μL，加入變性劑并根據(jù)1︰5充分混合均勻，98 ℃下10 min水浴變性，并迅速冰浴5 min。上述操作完畢后完成聚丙烯酰胺凝膠電凝，銀染顯帶，并將DNA異常擴增產(chǎn)物送上海聯(lián)合基因測序。（4）PTEN mRNA水平檢測。①總RNA的提取。向不同方法處理后的細胞中加入200 μL氯仿，15 s振蕩后進行15 min離心，速度4 500 r/min。離心完畢后去除上清，加入預冷乙醇1 mL，常溫下干燥7 min;在A260吸光值下完成總RNA測定[13-14]。

②采用實時熒光PCR法測定不同組織中PTEN mRNA水平，PCR參數(shù)：30 ℃下10 min;42 ℃下30 min;99 ℃ 5 min;5 ℃ 5 min，連續(xù)進行35個循環(huán)，72 ℃ 10 min延長，放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin為內(nèi)對照，引物設(shè)計見表1[15]。比較不同組織的PTEN mRNA水平。（5）相關(guān)性分析。比較不同病理特征的卵巢癌組織的PTEN mRNA表達水平，取存在差異的特征因素，分析其與PTEN mRNA表達水平的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;相關(guān)性分析采用Spearman與Pearson相關(guān)性分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組年齡40～69歲，平均（48.89±4.61）歲;病程0.4～1.6年，平均（1.13±0.61）年;腫瘤直徑1～7 cm，平均（3.23±0.59）cm;FIGO分級：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期25例;組織學類型：漿液性腺癌35例，黏液性腺癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌11例;組織分化類型：高分化32例，中分化20例，低分化10例;盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：是23例，否39例。對照組年齡37～69歲，平均（49.11±4.67）歲;病程0.4～1.9年，平均（1.11±0.58）年;病灶部位：左側(cè)31例，右側(cè)17例;組織學類型：漿液性囊腺瘤26例，黏液性囊腺瘤22例。

2.2 卵巢癌組織PTEN基因突變分析 觀察組62例卵巢癌組織經(jīng)PCR-SSCP檢測，出現(xiàn)遺產(chǎn)條帶的38例PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化測序后進行分析與比較，結(jié)果表明：外顯子5第5位密碼子T突變?yōu)镃，經(jīng)Blast P比較發(fā)現(xiàn)氨基酸由絲氨酸（S）變?yōu)楸奖彼幔‵）。

2.3 兩組PTEN mRNA水平比較 對照組中漿液性囊腺瘤與黏液性囊腺瘤PTEN mRNA水平分別為（0.67±0.11）、（0.68±0.12），比較差異無統(tǒng)計意義（t=0.426，P>0.05）。觀察組中癌組織PTEN mRNA水平為（0.32±0.08）低于癌旁組織（0.87±0.15），差異有統(tǒng)計學意義（t=25.475，P<0.05）;觀察組癌組織PTEN mRNA水平低于對照組中漿液性囊腺瘤與黏液性囊腺瘤組織，差異均有統(tǒng)計學意義（t=16.689、15.782，P<0.05）。

2.4 觀察組不同病理特征的卵巢癌組織PTEN mRNA水平比較 不同年齡、組織學類型及組織分級卵巢癌組織PTEN mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;不同F(xiàn)IGO分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織PTEN mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.5 PTEN基因表達水平與卵巢癌病理生物學特征相關(guān)性分析 PTEN mRNA表達水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負相關(guān)（P<0.05），見表3。

3 討論

卵巢癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤，由于患者發(fā)病早期癥狀缺乏典型性，導致臨床診療難度較大[16]。手術(shù)、化療是卵巢癌患者中常用的治療方法，雖然能改善患者癥狀，延長患者壽命，但是手術(shù)治療具有一定的風險性、創(chuàng)傷性，而化療耐藥性較高，導致患者生存率較低，影響女性健康生活[17]。既往研究表明：化療耐藥是卵巢癌患者治療預后差的重要原因，由于患者治療過程中腫瘤細胞為了躲避藥物對其攻擊、抵制其發(fā)揮作用，而產(chǎn)生耐藥性[18]。PTEN基因是臨床發(fā)現(xiàn)的首個具有抑癌作用的見，含有磷酸酶活性，且該基因主要定位于10q23.3染色體上，能表達絲氨酸、蘇氨酸與磷酸絡(luò)氨酸殘基，從而能降低FAK酶活性，在腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[19]。本研究中，卵巢癌患者經(jīng)PCR-SSCP檢測，結(jié)果表明外顯子5第5位密碼子T突變?yōu)镃，經(jīng)Blast P比較發(fā)現(xiàn)氨基酸由絲氨酸（S）變?yōu)楸奖彼幔‵），提示PTEN基因突變在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

PTEN基因突變與卵巢癌等腫瘤的發(fā)生具有緊密的聯(lián)系，該基因外顯子5突變能引起相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)、功能異常[20]。本研究中，觀察組中卵巢癌組織PTEN mRNA水平低于癌旁組織和對照組中漿液性囊腺瘤與黏液性囊腺瘤組織（P<0.05）;不同年齡、組織學類型及組織分級的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;不同F(xiàn)IGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示PTEN基因表達水平與卵巢癌患者病理存在緊密的聯(lián)系。PTEN基因突變在卵巢癌患者中能引起轉(zhuǎn)錄、修飾等遺傳化發(fā)生變化，能引起基因表達水平下調(diào)。文獻[21]研究表明，PTEN基因即耐藥基因，阻滯細胞周期，在細胞遷移過程中發(fā)揮作用。同時，PTEN能參與腫瘤的形成，其表達水平下降或缺失時，則會增強化療藥物的敏感性，其表達水平能反映腫瘤的惡心程度。為了進一步分析PTEN基因表達水平與卵巢癌生物病理的關(guān)系，本研究中對其進行相關(guān)性分析結(jié)果表明：PTEN mRNA水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈負相關(guān)（P<0.05）。因此，卵巢癌患者治療過程中應(yīng)用加強PTEN基因表達水平測定，評估患者預后，指導患者術(shù)后治療，鞏固手術(shù)效果，促進患者恢復。

綜上所述，PTEN基因突變能參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，且在卵巢癌組織中PTEN mRNA呈低表達，與卵巢癌病理生物學特征存在相關(guān)性。

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（收稿日期：2020-12-28） （本文編輯：田婧）