意大利蜜蜂同日齡不同職能工蜂上顎腺的轉錄組學分析

高 艷 楊振慧 李秋方 朱雅楠 梁立強 蘇松坤* 聶紅毅,2*

(1.福建農林大學 動物科學學院(蜂學學院), 福州 350002；2.福建農林大學 基因組與生物技術研究中心, 福州 350002；3.江西省養(yǎng)蜂研究所, 南昌 330052)

工蜂上顎腺呈一對大型囊狀，分布于頭部內表面兩側[1]，主要合成和分泌脂肪酸以及蜂群報警激素相關的2-庚酮等信息素，其分泌的脂肪酸主要用于幼蟲食物營養(yǎng)[2]。研究表明，上顎腺的組成和分泌量受蜜蜂級型和日齡等影響[3]。工蜂上顎腺能分泌蜂王漿成分中的ω-羥基酸及其相應的二酸[4]，是蜂王漿中的主要脂質成分[3]，其中，脂肪酸中的主要成分10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2(E)-decenoic acid, 10-HDA)是蜂王漿所特有的成分，也是蜂王漿質量評價的重要參考標準[5]。

蜂王漿的分泌由哺育蜂哺育行為介導，因此，人們可以利用哺育蜂分泌蜂王漿飼喂幼蟲的行為用于大量生產供人類食用的蜂王漿。蜂王漿由哺育工蜂的咽下腺和上顎腺共同分泌。為闡明上顎腺合成和分泌蜂王漿分子機制，前人已對不同發(fā)育日齡的上顎腺開展了大量的研究。黃少康等[6]利用HPLC測定0～30日齡意大利蜜蜂工蜂頭部中10-HDA的含量，研究發(fā)現(xiàn)工蜂上顎腺中10-HDA含量隨日齡增加呈逐漸上升的趨勢，在10～20日齡間保持平衡，30日齡含量達到最高；轉錄組學分析不同級型意大利蜜蜂(蜂王、工蜂)上顎腺分泌物合成途徑，發(fā)現(xiàn)細胞色素P450(CYP450)家族基因參與脂肪酸β-氧化和ω-氧化，其中CYP6AS8是工蜂中CYP450家族基因中表達量最高的基因，這一發(fā)現(xiàn)有助于闡明脂肪酸衍生的信息素生物合成的分子基礎[7]；Huo等[3]對不同發(fā)育日齡(剛出房工蜂、哺育蜂和采集蜂)的普通意大利蜜蜂和優(yōu)良產漿意大利蜜蜂上顎腺進行蛋白組學分析，結果顯示在哺育蜂階段，特異性蛋白和高豐富的蛋白主要富集在物質轉運和脂質合成相關的通路，推測哺育蜂上顎腺優(yōu)先啟動脂質合成中的高分泌活性以作為提供幼蟲營養(yǎng)方面的來源，進而激活脂質合成維持所需的脂肪酸來源并最大限度地降低脂質降解以增加10-HDA合成，從而有助于提高蜂王漿的產量。前人已從轉錄組學和蛋白質組學等方面對不同日齡上顎腺展開研究，然而，上顎腺中蜂王漿合成和分泌的分子機制尚不明確。

為排除日齡因素對上顎腺蜂王漿合成和分泌分子機制的影響，本研究基于蜂群中工蜂勞動分工的可塑性[8-9]，通過人工組建蜂群，收集3日齡工蜂(3 d)、10日齡哺育蜂(10 dN)、10日齡采集蜂(10 dF)、21日齡哺育蜂(21 dN)和21日齡采集蜂(21 dF)，檢測不同職能工蜂上顎腺中10-HDA含量，并采用RNA-seq技術全面篩選哺育蜂上顎腺中與蜂王漿合成分泌相關的差異基因(Differentially expressed genes, DEGs)，為闡明上顎腺合成分泌蜂王漿分子機制提供大量有價值的信息，也為膜翅目昆蟲中上顎腺功能的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗蜂種

本研究所用的“蜂強1號”意大利蜜蜂蜂種來自福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)蜂場(隸屬亞熱帶季風氣候，119°30′ E, 26°08′ N，海拔600～1 000 m)，樣品于2017年10—11月采自福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)教學蜂場。

1.2 主要儀器及試劑

熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、高效液相色譜儀(LC-20A，日本株式會社島津制作所)、色譜柱(4.6 mm×250 mm不銹鋼柱，填充物不定形硅膠C18鍵合相，10 μm)、SPD-M20A二極管陣列檢測器(日本株式會社島津制作所)、體視顯微鏡1臺、冷光源儀器1臺；DEPC水(上海生工生物公司)、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)、甲醇(色譜純，德國MECK基團有限公司)、無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)、10-HDA標準品(純度99.3%，上海安譜實驗科技股份有限公司)、對硝基苯甲酯(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 標記蜜蜂及收集樣品

試驗所用蜂群為正常健康的5群強群，每群蜂中至少含有2～3張即將出房的封蓋子脾。在組建新的蜂群之前，去除封蓋子脾上的蜜蜂，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度34.5 ℃，相對濕度60%)中，每隔 24 h 用不同顏色的記號筆在剛出房的蜜蜂胸部或腹部做好標記，連續(xù)標記5 d，每天標記剛出房工蜂數(shù)目為3 000～5 000頭。標記后投入由1只蜂王、蜜粉脾各1張和1張幼蟲脾組建的人工蜂群，其中幼蟲脾置于中間位置，同時在邊脾外側插入隔板，紗蓋上方蓋上覆布，便于保溫。每隔5 d，從原有蜂群中抽出小幼蟲脾，替換組建蜂群中的封蓋脾，以保證有充足的幼蟲。

標記的工蜂發(fā)育到第3天時，直接收取工蜂作為3日齡工蜂(3 d)；標記的工蜂發(fā)育至第10天和21天時，收集頭部伸到有幼蟲巢房且持續(xù)時間超過10 s的工蜂分別作為10日齡哺育蜂(10 dN)和21日齡哺育蜂(21 dN)；在巢門口收集后足花粉筐中載有花粉的外勤蜂，將其分別作為10日齡采集蜂(10 dF)和21日齡采集蜂(21 dF)。按照這個要求，收集3 d、10 dN、10 dF、21 dN和21 dF共5組樣本。

1.4 上顎腺的解剖

剪下工蜂頭部并去除其觸角，撥開口器后將手術用鑷子穿過口器后翻轉至反面朝上，放在自制蠟盤中，在體視顯微鏡下用手術刀將工蜂頭部的幾丁質外殼去除，沿著工蜂口器兩邊的上顎挑出上顎腺。

1.5 HPLC檢測上顎腺中10-HDA的含量

取上述解剖后的5組樣品，每組5對上顎腺，每組設置3個生物重復；上顎腺組織置于1.5 mL離心管中，加入50 μL甲醇充分研磨后，移至新的離心管中，加入100 μL內標溶液(對羥基苯甲酸甲酯溶液)，定容至1 mL并搖勻，即得各組樣本的上顎腺待測樣品溶液。取10 μL 10-HDA標準溶液梯度溶液，注入色譜儀，測得10-HDA峰面積，每個樣平行3次，基于峰面積的平均值與進樣量進行線性擬合，得到10-HDA線性回歸方程。根據(jù)內標法計算上顎腺中待測樣品溶液中的10-HDA含量。

試劑(10-HDA標準溶液、內標溶液和水相溶液)配制、色譜條件參考文獻[10-11]的操作。

1.6 上顎腺中蜂王漿合成和分泌相關DEGs的表達水平分析

1.6.1試驗組樣品cDNA文庫構建及Illumina測序

3 d的3個生物學重復分別為3 d_1、3 d_2和3 d_3; 10 dN的3個生物學重復分別為10 dN_1、10 dN_2和10 dN_3; 10 dF的3個生物學重復分別為10 dF_1、10 dF_2和10 dF_3; 21 dN的3個生物學重復分別為21 dN_1、21 dN_2和21 dN_3; 21 dF 的3個生物學重復分別為21 dF_1、21 dF_2和21 dF_3。委托北京諾禾致源生物有限公司開展總RNA質量控制、cDNA文庫構建和Illumina測序。本研究15個RNA-seq測序的數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA (https:∥submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/SUB8031156/overview)，SRA數(shù)據(jù)編號為SUB8031156。RNA-seq測序數(shù)據(jù)分析采用西方蜜蜂參考基因組(Amel_4.5)，其鏈接為：https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002195.4/。

1.6.2哺育蜂上顎腺中蜂王漿合成和分泌相關DEGs的篩選及表達水平分析

根據(jù)FPKM(Fragemnts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值法計算每個基因在5組樣本中的表達量。利用DESeq2軟件分析差異基因，將校正后的P<0.05作為篩選差異基因的標準，其中l(wèi)og2Fold change>0和log2Fold change<0分別作為篩選上調和下調DEGs的標準[12]。

篩選與上顎腺中蜂王漿合成分泌密切相關的DEGs的標準如下：DEGs在10 dN上顎腺中的表達量顯著高于3 d和21 dN；DEGs在10 dN上顎腺中的表達量顯著高于10 dF；DEGs在21 dN上顎腺中的表達量顯著高于21 dF；DEGs在10 dN與 21 dN 上顎腺中的表達量無顯著差異。將10 dN與3 d之間產生的DEGs記為10 dN vs 3 d組，10 dN與21 dF之間產生的DEGs記為10 dN vs 21 dF組，10 dN與10 dF之間產生的DEGs記為10 dN vs 10 dF組，21 dN與21 dF之間產生的DEGs記為21 dN vs 21 dF組，10 dN與21 dN產生的DEGs為10 dN vs 21 dN組。通過韋恩圖分析：10 dN vs 3 d與10 dN vs 21 dF、10 dN vs 10 dF、21 dN vs 21 dF 交集產生共有DEGs(共有DEGs包括調控蜂王漿合成分泌相關，也包括日齡發(fā)育等相關)；為減少日齡發(fā)育的影響，從上述4組交集共有DEGs中去除10 dN vs 21 dN與其交集產生的DEGs，即為哺育蜂上顎腺中與蜂王漿合成分泌密切相關的DEGs。

通過clusterProfiler R軟件包和基因本體(GO)條目將關鍵差異表達基因DEGs映射到GO數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST軟件將篩選得到的DEGs與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，P<0.05表示顯著性富集。利用諾禾Novogene售后工具平臺(https:∥magic.novogene.com/public/customer/main#/tool_rna/add_tool)對DEGs進行KEGG pathway富集分析。

1.6.3DEGs的實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)驗證

利用Primer Premier 6為隨機選取的6個DEGs設計特異性引物(表1)，其中以actin(NM_001185146.1)作為內參基因。反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司，日本)5 μL，正/反向引物(2 μmol/L) 2 μL，模板(500 ng/μL) 2 μL，ddH2O補充至10 μL。PCR擴增程序分為3步：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)；最后一步為溶解曲線分析：65 ℃開始，每5 s上升0.5 ℃，直至上升到95 ℃。在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)完成反應程序后，采用2-ΔΔCt法[13]計算上顎腺DEGs的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析(One-way ANOVA)不同職能工蜂上顎腺10-HDA含量的差異顯著性以及qPCR中ACFS2、Mrjp1、Mrjp2、Mrjp3、Mrjp4和Mrjp7基因在不同樣本中表達量的差異顯著性(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)，結果用平均值±標準誤表示。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結果與分析

2.1 工蜂上顎腺中10-HDA的含量測定

HPLC測定3 d、10 dN、10 dF、21 dN和21 dF上顎腺中10-HDA含量。發(fā)現(xiàn)3 d上顎腺的 10-HDA 含量最低(0.002 5±0.000 85 mg)，10 dN上顎腺中10-HDA的含量為0.019 2±0.007 78 mg，21 dF上顎腺的10-HDA含量最高(0.041 5±0.005 97 mg)；隨著日齡增加，上顎腺中10-HDA的含量隨之增加，其中21 dN和21 dF上顎腺中10-HDA的含量均顯著高于3 d(P<0.05)，21 dF上顎腺中10-HDA的含量顯著高于10 dN(P<0.05)；在相同日齡(10日齡和21日齡)的哺育蜂和采集蜂中，本研究發(fā)現(xiàn)采集蜂上顎腺中10-HDA含量均高于同日齡哺育蜂，但差異不顯著(圖1)。

2.2 不同職能工蜂上顎腺測序文庫的質控

過濾低質量reads后，每個文庫產生約4 049～8 775萬個clean reads，與西方蜜蜂基因組匹配率為76.49%～90.63%。RNA-seq測序有效讀段數(shù)為35 871 395～67 116 890，樣本的單一匹配率均在72%以上，Q30值也均在87.8%以上(表2)，說明RNA-seq數(shù)據(jù)質量較好，測序數(shù)據(jù)可靠性高。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，*P<0.05Data in the figure are mean±SE, *P<0.05圖1 不同職能工蜂上顎腺10-HDA含量Fig.1 Contents of 10-HDA in the MGs of worker bees at different developmental ages

表2 上顎腺15個文庫RNA-seq數(shù)據(jù)總覽Table 2 Overview of RNA-seq data from 15 libraries in MGs

2.3 相同日齡哺育蜂和采集蜂上顎腺中Mrjps的表達譜

上顎腺是蜂王漿合成和分泌的重要外分泌腺體，因此，通過RNA-seq研究了相同日齡哺育蜂和采集蜂Mrjps的表達模式(圖2)。Mrjps均表現(xiàn)出相似的表達模式，即這些基因在10 dN上顎腺中的表達量遠高于3 d、10 dF和21 dF，并且21 dN上顎腺中表達量也高于同齡采集蜂，暗示它們可能在蜂王漿蛋白的合成中起關鍵作用。在這些基因中，Mrjp1表達量最高，該基因在3 d、10 dN、10 dF、21 dN 和21 dF上顎腺中的FPKM值分別為201.59、40 997.05、387.54、63 157.08和399.08；Mrjp8和Mrjp9表現(xiàn)出相對較低的表達水平(FPKM<43.33)。

圖2 Mrjps在5組工蜂上顎腺中的轉錄組數(shù)據(jù)表達譜Fig.2 Expression profiles of Mrjps in the MGs from five samples of worker bees

2.4 篩選上顎腺中蜂王漿合成分泌相關的DEGs

由圖3可看出，10 dN vs 3 d有381個DEGs；10 dN vs 21 dF有568個DEGs；10 dN vs 10 dF有374個DEGs；21 dN vs 21 dF有664個DEGs，將這4組進行交集得到67個共有DEGs，這67個DEGs可能與調控蜂王漿合成和分泌及日齡發(fā)育等相關。

圖3 上顎腺中篩選蜂王漿合成分泌相關DEGs韋恩圖Fig.3 Venn diagram of DEGs related to synthesis and secretion of royal jelly in MGs

為減少日齡因素的影響，去除10 dN vs 21 dN與67個DEGs交集產生的2個DEGs，最后得到嚴格篩選條件下與蜂王漿合成與分泌密切相關的65個DEGs(圖3)。在這些基因中，只有46個DEGs在10日齡哺育蜂上顎腺中的表達量顯著高于3 d、10 dF 和21 dF上顎腺中表達量，同時這些基因在21日齡哺育蜂上顎腺中的表達量也顯著高于21 dF中的表達量，符合篩選上顎腺中蜂王漿合成和分泌相關DEGs的標準；相反，11個DEGs在哺育蜂上顎腺中則均呈顯著下調表達(表3)。

表3 5組樣本中上顎腺65個DEGs的差異性分析Table 3 Analysis of significance of 65 DEGs in MGs among 5 groups of honeybee samples

2.5 哺育蜂上顎腺中上調DEGs的GO分析

46個上調DEGs的GO富集表明，在生物學進程中，上調DEGs富集在蛋白質均聚、蛋白質寡聚、大分子復合物組裝、大分子復合物亞基組織、細胞組分組裝、跨膜運輸、細胞組分生物發(fā)生、氧化還原過程、蛋白質復合物組裝和蛋白質復合物生物發(fā)生等；在分子功能上，上調DEGs富集在染色體部分、染色體、胞外區(qū)、非膜界細胞器、胞內非膜界細胞器、胞內細胞器部分、細胞器部分、細胞核、大分子復合體和胞內膜界細胞器等；在細胞組分方面，上調DEGs富集在與血紅素結合、四吡咯結合、DNA結合、連接酶活性、形成碳氮鍵、氣味結合、酸性磷酸酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性和磷氧裂解酶活性、氧化還原酶活性(圖4(a))。在上調DEGs中沒有顯著的GO富集，但是這些DEGs中一些基因參與了蛋白磷酸化過程。

2.6 上調DEGs的KEGG分析

上調DEGs共富集32條KEGG，其中包括纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸代謝、脂肪酸延伸、脂肪酸代謝、β-丙氨酸代謝、脂肪酸降解、碳代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙酸新陳代謝、甘油酯新陳代謝、過氧物酶體、視黃醇新陳代謝、抗壞血酸和藻酸鹽代謝、其他多糖降解、藥物代謝-細胞色素P450、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化、丁酸代謝、細胞色素P450對異生源代謝、藥物代謝-其他酶、果糖和甘露糖代謝、鞘脂代謝。而纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解、脂肪酸延伸、脂肪酸代謝、β-丙氨酸代謝、脂肪酸降解、碳代謝均呈顯著性富集，這些通路與蛋白質代謝、脂肪酸代謝有關，暗示上顎腺中相關基因可能參與了蛋白質和脂肪酸的生物合成(圖4(b))。

2.7 Real-time PCR驗證RNA-seq數(shù)據(jù)可靠性

為進一步驗證RNA-seq結果，隨機選擇6個DEGs(ACFS2、Mrjp1、Mrjp2、Mrjp3、Mrjp4和Mrjp7)，并使用qPCR進行了驗證。結果表明，qPCR檢測的6個DEGs的表達模式與轉錄組數(shù)據(jù)中DEGs的表達模式一致(圖5)，表明上顎腺RNA-seq的數(shù)據(jù)是可靠的。

3 討 論

本文比較了不同職能工蜂上顎腺中10-HDA的含量，同時使用RNA-seq對相同日齡哺育蜂和采集蜂的上顎腺進行了系統(tǒng)分析。

(a)上調DEGs的GO富集分類；(b)上調DEGs的KEGG富集通路。(a)、(b)只列出了GO和KEGG富集功能上排名前30和20位的通路(a) GO enrichment classification of up-regulated DEGs; (b) KEGG enrichment pathway of up-regulated DEGs. a and b only list the top 30 and 20 pathways in GO and KEGG enrichment function, respectively.圖4 上調DEGs的GO和KEGG功能富集分析Fig.4 GO and KEGG functional enrichment analysis of up-regulated DEGs

從左到右依次為ACFS2、Mrjp1、Mrjp2、Mrjp3、Mrjp4和Mrjp7 6個基因在樣本10 dN、10 dF、21 dN和21 dF中的表達量，其中黑色柱狀圖表示RNA-seq數(shù)據(jù)中基因的FPKM值，灰色表示qPCR數(shù)據(jù)中基因的相對表達量，縱坐標均為相應取過以2為底的對數(shù)數(shù)值。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。Note：The expression levels of ACFS2, Mrjp1, Mrjp2, Mrjp3, Mrjp4 and Mrjp7 six genes in the samples 10 dN, 10 dF, 21 dN, 21 dF were shown from left to right; The black bar graph represents the FPKM value of the gene in the RNA-seq data, and the gray bar represents the relative expression of genes in the qPCR data; The ordinates are the corresponding logarithmic values with a base of 2. Data in the figure are mean±SE, *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.圖5 上顎腺中轉錄組數(shù)據(jù)的qPCR驗證Fig.5 qPCR validation of transcriptome data in MGs

3.1 上顎腺中10-HDA的分泌規(guī)律以及Mrjps表達趨勢分析

在3日齡、10日齡和21日齡工蜂的發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)工蜂上顎腺中10-HDA含量總體呈逐漸上升的趨勢，至21日齡達最高，但同日齡條件下，采集蜂上顎腺中10-HDA的含量高于哺育蜂。黃少康等[6]利用HPLC對0～30日齡意蜂工蜂頭部的10-HDA進行測定，結果發(fā)現(xiàn)工蜂上顎腺中10-HDA含量隨日齡總體呈逐漸上升的趨勢，在10～20日齡間保持平衡，30日齡含量達到最高，這與本研究結果基本一致，推測可能是由于哺育蜂的哺育行為致使腺體分泌物中部分10-HDA進入蜂王漿中。

在本研究中，上顎腺中的Mrjp1-9表現(xiàn)出一種日齡依賴性的表達譜，從第3天到第10天(哺育蜂階段)轉錄豐度增加，隨后第21天(采集蜂階段)轉錄豐度下降；與此同時，10/21日齡的哺育蜂上顎腺的Mrjps表達量高于相應的采集蜂。Mrjp1-4和Mrjp7在哺育蜂上顎腺中大量表達(FPKM>2 000)，可能也是構成蜂王漿蛋白的主要成分。其中，5個基因(Mrjp1、Mrjp2、Mrjp3、Mrjp4和Mrjp7)符合上顎腺中與蜂王漿合成和分泌相關基因的篩選標準。與10/21 dF相比，這些基因在哺育蜂上顎腺中的表達量明顯上調。

3.2 上顎腺中脂肪酸的生物合成分泌相關的上調DEGs

一般認為蜂王漿中的脂質成分主要由上顎腺分泌[4]。上顎腺的主要功能是分泌脂肪酸和一些信息素。脂肪酸生物合成主要包括最佳前體-硬脂酸的合成、脂肪酸羥基化、脂肪酸鏈的縮短和末端羥基化修飾[2,7,14]。

硬脂酸可以從食物中攝入后，直接進入上顎腺，也可以短鏈脂肪酸為原料，在上顎腺中從頭合成[40,44]。硬脂酸經過ω-羥基化得到ω-羥化硬脂酸，ω-羥化硬脂酸經過一系列β-氧化和功能化修飾得到主要分泌物10-HDA[14]。

脂肪酸合成酶是工蜂上顎腺的一種特異性蛋白，也是催化內源性脂肪酸合成的關鍵酶。工蜂上顎腺以短鏈脂肪酸為原料，從頭合成一種長鏈軟脂酸的過程需要脂肪酸合成酶的催化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)編碼脂肪酸合成酶的基因LOC412815在哺育蜂和采集蜂階段的表達量均較高，但該基因在采集蜂階段的表達量稍微高于哺育蜂階段；前人研究結果發(fā)現(xiàn)上顎腺中脂肪酸合成酶的表達會影響10-HDA含量的變化[16]，本研究發(fā)現(xiàn)10-HDA在采集蜂上顎腺中的表達量高于哺育蜂，這一結果也說明了LOC412815在采集蜂階段的表達量高于哺育蜂。

通過KEGG途徑分析，發(fā)現(xiàn)3個上調DEGsLOC411662(2-烯?；o酶A還原酶)、LOC408291(3-酮?；?CoA硫解酶)、LOC409150(烯酰輔酶A水合酶)明顯富集在脂肪酸延伸通路上，暗示這3個基因可能參與了硬脂酸的生物合成過程。

研究表明，CYP6家族成員中的CYP6AS8和CYP6AS11參與了昆蟲脂肪酸羥基化[7]。本研究發(fā)現(xiàn)CYP6AQ1在篩選的DEGs中呈上調表達，暗示該基因可能在上顎腺分泌物的生物合成中發(fā)揮重要作用，并可能參與了上顎腺中脂肪酸信息素前體的羥基化。

羥基化后，通過β-氧化對脂肪酸碳鏈進行縮短過程。本文的研究結果表明，5個上調DEGs，乙酰輔酶A合成酶(ACSF2)、乙酰輔酶A脫氫酶(LOC408567)、烯酰輔酶A水合酶(LOC409150)、羥烷基輔酶A脫氫酶(LOC725274)、酮脂酰輔酶A硫解酶(LOC408291)均是參與脂肪酸β-氧化過程的關鍵酶。脂肪酸β-氧化過程中，一種關鍵酶—脂酰CoA脫氫酶在其中起到了催化氧化的作用，本研究在富集的脂肪酸降解通路中發(fā)現(xiàn)了LOC725274編碼的3-羥烷基?；?CoA脫氫酶Ⅱ型這一基因，此外這一氧化過程也需要通過一種電子傳遞中間體而完成。電子轉移黃素蛋白β(Electron transfer flavoprotein subunit beta, ETF-β)，是與脂肪代謝相關的酶類，作為脂酰CoA脫氫酶的電子受體，通過ETF脫氫酶將電子轉移給主要的呼吸鏈，參與脂肪酸β氧化過程[17]，在轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)LOC410308基因編碼的ETF-β在哺育蜂階段的表達量要高于同日齡的采集蜂階段。

此外，3-酮脂酰CoA硫解酶(LOC408291)催化脂肪酸β-氧化循環(huán)中的硫解反應，與脂質的合成、降解以及能量的產生有關[18-19]。在篩選得到的DEGs中發(fā)現(xiàn)，相對于采集蜂階段，LOC408291在哺育蜂階段呈高量表達。

本文比較了KEGG通路中脂質代謝的相關基因，包括脂質降解通路中編碼相關酶的基因(烯酰輔酶A水合酶LOC409150、乙酰輔酶A脫氫酶LOC408567、3-酮脂酰輔酶A硫解酶LOC408291)的表達水平在DEGs中均呈上調。載脂蛋白是昆蟲體內重要的脂質轉運蛋白，值得注意的是，上調DEGs中編碼載脂蛋白-III的基因A4呈大量表達，這與Wu等[7]的研究結果基本一致。GO功能富集發(fā)現(xiàn)，在生物過程中，A4與脂質轉運和脂質定位相關，在分子功能中與脂質結合相關，推測載脂蛋白可能在上顎腺的脂肪酸運輸方面發(fā)揮作用。

脂肪酸的合成均經過羥基化、β-氧化和功能集團修飾，羥基化和β-氧化是合成脂肪酸及其衍生物的重要通路。本研究發(fā)現(xiàn)在上調DEGs中參與羥基化(CYP6AQ1)和β-氧化(ACSF2、LOC408567、LOC409150、LOC725274和LOC408291)的關鍵基因，推測這些基因在工蜂上顎腺合成10-HDA等相關脂肪酸衍生物方面發(fā)揮重要作用。

3.3 其他重要的DEGs

在昆蟲中，氣味結合蛋白(Odorant binding proteins, OBPs)和化學感覺蛋白(Chemosensory proteins, CSPs)在運載疏水性氣味分子和信息素穿過淋巴液的信號傳導中發(fā)揮重要作用[20-21]。有研究表明，一些OBPs在上顎腺中高量表達，暗示其可能參與了信號化學物質的溶解和釋放[22]。OBP14在蜂群成員(蜂王、工蜂和雄蜂)的上顎腺中含量豐富，相對于幼蜂和老年蜂，其在內勤蜂中含量最高，OBP14與單萜類結構有較好的親和性[22]；OBP21在老年蜂上顎腺中含量豐富，并與法尼素結合，法尼素是一種吸引蜂群的信息素[22]。此外，在上調DEGs中，也檢測到Obp14、Obp17和Obp21，其中Obp21的表達最為豐富。對于社會昆蟲而言，蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)對于嗅覺線索的檢測和辨別至關重要，這是蜂群社會中成員間主要的協(xié)調合作方式，對于蜂群的交流至關重要[23]。CSP3已顯示與哺育所產生的大型脂肪酸和酯衍生物特異性結合[21]，從而影響了哺育蜂的行為[24]。雖然OBPs和CSPs可以與多種配體結合，但它們更傾向于傳遞不同氣味的蜜蜂信息素，且具有較高的結合力[23]。

脂肪酸代謝通路中的相關DEGs以及一些氣味結合分子的相關基因在上顎腺中均呈上調表達，推測可能哺育蜂需要提供蜂群食物中所需的關鍵性脂肪酸物質(10-HDA)和蜂群成員間交流的脂肪酸信息素，因此，相對于采集蜂，同日齡哺育蜂分泌脂肪酸的能力更強。

4 結 論

基于蜂群內社會性勞動分工的可塑性，本研究通過組建人工蜂群的方法獲得相同日齡哺育蜂和采集蜂(10日齡和21日齡)，測定了不同職能工蜂上顎腺中10-HDA含量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)10-HDA含量總體隨日齡逐漸上升至21日齡達最高，但同日齡條件下，采集蜂上顎腺中10-HDA的含量高于哺育蜂。運用轉錄組學對相同日齡哺育蜂和采集蜂的上顎腺進行系統(tǒng)分析，篩選得到46個與上顎腺中蜂王漿合成和分泌相關的差異基因，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集于蛋白質代謝、脂肪酸代謝和能量代謝等方面。本研究是在排除日齡因素的影響下，對上顎腺中基因表達變化模式進行全面分析，為研究上顎腺中蜂王漿合成和分泌的分子機制提供大量有價值的信息，也為膜翅目昆蟲中上顎腺的功能研究提供一個新的視角。