實時熒光定量PCR篩選雞基因表達(dá)最佳內(nèi)參基因

李毅毅 張彥華 吳俊鋒 張晨曦 康相濤 李文婷

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，鄭州 450000)

實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)由于其眾多的優(yōu)點，在基因表達(dá)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，已成為量化基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、揭示基因表達(dá)模式的有效方法[1]。但是qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性受到內(nèi)參基因表達(dá)量的影響，最終使目的基因表達(dá)量與真實值之間存在誤差[2]。鄭嫩珠等[3]研究內(nèi)參基因?qū)YR、MITF和ASIP基因在白絨烏骨雞各組織表達(dá)水平的影響時發(fā)現(xiàn)選用不同內(nèi)參基因會得到不同的試驗結(jié)果。張蓉等[4]在篩選蛋雞不同組織中穩(wěn)定性表達(dá)的內(nèi)參基因時發(fā)現(xiàn)，常用的GAPDH基因在不同組織間不是穩(wěn)定表達(dá)的，而RPS2和β-actin基因穩(wěn)定表達(dá)。袁振杰等[5]研究表明在性發(fā)育不同階段的濟寧百日雞下丘腦中，表達(dá)最為穩(wěn)定的是GAPDH基因，而在卵巢中表達(dá)最為穩(wěn)定的是β-actin基因。這些研究都表明不同組織、不同發(fā)育時期、不同品種等試驗條件下內(nèi)參基因的表達(dá)量并非總是恒定的，而合適的內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)不受品種、組織、發(fā)育階段等影響，維持其穩(wěn)定的表達(dá)水平。

本課題組在前期研究SETDB2、SLIT2、和TAPT1基因在不同品種雞的組織表達(dá)差異分析時，以GAPDH為內(nèi)參基因通過ΔΔCt法計算3個目的基因相對表達(dá)量時，3個基因均表現(xiàn)出胸肌、腿肌表達(dá)量較低的現(xiàn)象；進一步分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因GAPDH在胸肌、腿肌中的表達(dá)量顯著高于其他組織，最終由于內(nèi)參基因表達(dá)量不穩(wěn)定而影響試驗結(jié)果。因此，為篩選不同試驗條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究選取在雞中常用的5個內(nèi)參基因：B2M、28S、GAPDH、β-actin和HSP70基因，以地方品種固始雞和商業(yè)品種羅斯308肉雞為例進行不同品種間比較，以地方品種固始雞為例進行不同組織和不同發(fā)育時期間比較。基于不同分析方法篩選出相對穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，旨為研究雞目的基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測的準(zhǔn)確性提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物購自河南三高農(nóng)牧股份有限公司。隨機選取固始雞6周齡5只，14、22和30周齡各3只，及6周齡羅斯308肉雞3只。所有動物操作程序均得到河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物護理和使用委員會(IACUC)的批準(zhǔn)，采集6周齡固始雞的胸肌、腿肌、肝臟、脾臟、十二指腸、空腸、回腸、肌胃和腺胃9種組織樣品，14、22和30周齡固始雞及6周齡羅斯308肉雞的胸肌組織樣品，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

采用天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，放置于-80 ℃冰箱保存。利用NanoDrop超微量分光光度計檢測提取的RNA樣品純度以及濃度，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行質(zhì)量檢測。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)試劑盒進行cDNA的合成，操作步驟按照試劑盒使用說明進行。使用RNase-Free Water統(tǒng)一稀釋至400 ng/μL，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中公布的雞基因序列，利用Primer 6.0軟件設(shè)計28S、B2M、GAPDH、β-actin和HSP70基因的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 候選內(nèi)參基因引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes

1.4 qRT-PCR檢測

利用qRT-PCR檢測5 個基因在不同組織中的表達(dá)，qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL：2×TaqPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA模板(質(zhì)量濃度為：400 ng/μL)。qRT-PCR 3步法反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；延伸溫度95 ℃ 1 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s，1個循環(huán)；37 ℃ 30 s。

1.5 引物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用不同組織的cDNA樣品制作混池，混池原液質(zhì)量濃度為1 000 ng/ul，然后倍比稀釋，設(shè)計(50、51、52、53和54)5個濃度梯度，單位為ng/ul，每個質(zhì)量濃度梯度3個重復(fù)，進行實時熒光定量PCR擴增，制作引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測其回歸方程的擬合度R2，以此確定待測基因引物是否可用于定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用比較Ct值法檢測各基因的表達(dá)水平，并保證每個樣品的Ct誤差≤0.5。在Excel中將5個內(nèi)參基因中最小Ct值定義為對照組1，其他樣品以其為基準(zhǔn)應(yīng)用2-ΔCt計算相對表達(dá)量，然后分別利用Vandesompele等[6]編寫的geNorm程序和Andersen等[7]編寫的NormFinder程序進行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析，數(shù)據(jù)處理及分析程序使用方法參考吳建陽等[8]。另外，本研究還運用SPSS 22.0對Ct值、ΔCt和2-ΔΔCt進行統(tǒng)計性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)檢

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，結(jié)果可見28S和18S條帶清晰(圖1)。核酸濃度儀檢測其OD260/OD280值均在1.9～2.1，OD260/OD230值均>1.90。說明RNA完整性良好，純度較高。

M: DL2 000;1～2：胸肌;3～4：肝臟;5～6：脾臟; 7～8：十二指腸M: DL2 000 Marker; 1-2： chest muscle; 3-4： liver; 5-6： spleen; 7-8： duodenum圖1 部分組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢Fig.1 Detection of partial tissue total RNA by agarose gel electrophoresis

2.2 候選基因引物的擴增效率

如表2所示，28S、B2M、GAPDH、β-actin和HSP705個候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的擬合度R2均在0.99左右，表明各內(nèi)參基因Ct值和起始模板濃度對數(shù)值均呈良好的線性關(guān)系，擴增效率高，因此可判定各引物可用于qRT-PCR擴增且定量結(jié)果可靠。

表2 5個候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、回歸方程擬合度R2和擴增效率Table 2 Regression equation, fitting degree R2 and amplification efficiency offive internal candidate reference gene standard curve

2.3 qRT-PCR數(shù)據(jù)分析

2.3.1Ct值比較候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

基因的表達(dá)水平可通過Ct值的大小反映，Ct值越低說明基因的表達(dá)豐度越高。5個候選基因的Ct值比較表明，在不同組織，不同時期，不同品種比較下各個樣品的Ct值均有不同的變化。理論上，內(nèi)參基因的Ct值是恒定不變的，因此用Ct值波動范圍大小作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價的參考依據(jù)，即ΔCt=MaxCt-MinCt，ΔCt越大則說明基因越不穩(wěn)定，越小則說明基因越穩(wěn)定。如圖2所示，在雞不同組織，不同時期，不同品種間，28S的Ct值波動最小，表達(dá)豐度最高且較穩(wěn)定，而其他候選基因在不同試驗分組下的樣品中的表達(dá)水平均有很大差異。因此，有必要對基因表達(dá)的穩(wěn)定性進行分析，確定不同試驗分組下合適的內(nèi)參基因及數(shù)目，以便在雞不同組織、不同時期、不同品種中進行準(zhǔn)確的基因表達(dá)譜分析。

圖2 5個候選內(nèi)參基因在不同分組中的Ct值Fig.2 Comparison of Ct values of five candidate reference genes in different groups

2.3.2geNorm軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

應(yīng)用geNorm進行內(nèi)參穩(wěn)定性檢測，將qRT-PCR得到的Ct值轉(zhuǎn)換為2-ΔCt相對表達(dá)量的值輸入分析軟件中，通過候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M的大小來比較不同候選基因的穩(wěn)定性，M值越小說明該基因的穩(wěn)定性越好。由圖3(a)可以看出雞不同組織間5個內(nèi)參基因的M值在1.258 0～2.398 6，M值最小的基因是28S和HSP70，M值最大的基因是GAPDH，因此在不同組織間最適內(nèi)參基因是28S和HSP70。圖3(b)結(jié)果顯示，β-actin和GAPDH的M值最小，28S的M值最大，故在雞不同時期間最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是β-actin和GAPDH，而最不穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是28S。由圖3(c)可知，在雞不同品種間5個候選基因的M值分別是：HSP70>β-actin>B2M>28S和GAPDH，表明在雞不同品種間最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是28S和GAPDH。

通常單一內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M行矯正，不足以解決樣品處理過程中的所有細(xì)微變化。因此，利用geNorm來評估候選內(nèi)參基因的最適數(shù)目?？赏ㄟ^geNorm計算結(jié)果中的配對變異V值，利用Vn/Vn+1 值的大小來確定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目。如果Vn/Vn+1<0.15,則n為所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目。由圖3(d)可知，在3個不同試驗分組下，Vn/Vn+1值在0.138～0.655，其中只有雞不同品種間內(nèi)參基因的V2/3<0.15，為0.138，表明雞不同品種間只需要GAPDH和28S2個內(nèi)參基因就能為基因表達(dá)分析矯正。

(a)不同組織；(b)不同時期；(c)不同品種；(d)geNorm分析候選基因的配對差異值。(a) Different tissues; (b) Different periods; (c) Different breeds; (d) Candidate internal candidate reference gene pairing difference value by geNorm software.圖3 geNorm軟件分析5個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性Fig.3 Stability analysis of five internal candidate reference genes by geNorm software

2.3.3NormFinder軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

利用NormFinder計算5個候選基因表達(dá)穩(wěn)定性值(Stability value，SV)，進而利用SV值對基因進行穩(wěn)定性排序。SV值越小，基因越穩(wěn)定。由表3結(jié)果可知，在雞不同組織間篩選最適內(nèi)參基因時，候選基因的SV值依次為：GAPDH(1.421)>β-actin(1.180)>B2M(1.110)>HSP70(0.760)>28S(0.582)，即最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為28S。在篩選雞不同時期間最適內(nèi)參基因時，GAPDH的穩(wěn)定性最低(SV=0.315)，因此是不同時期間所有樣本中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在比較雞不同品種間候選基因的穩(wěn)定性值時發(fā)現(xiàn)，GAPDH是SV值最低的候選基因，HSP70是SV值最高的候選基因，表明在檢測不同品種間組織樣本中GAPDH的穩(wěn)定性最好，為最適內(nèi)參基因。

2.3.4SPSS統(tǒng)計軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

用Ct值波動范圍大小來作為內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價的參考依據(jù)。每個候選基因中ΔCt=MaxCt-MinCt，ΔΔCt=各樣本ΔCt-ΔCt平均值，再計算各組合中2-ΔΔCt的標(biāo)準(zhǔn)差，最終得到平均SD2-ΔΔCt值標(biāo)準(zhǔn)差，以Mean SD2-ΔΔCt值最低來選擇最適內(nèi)參基因。如表4所示，在雞不同組織間候選基因平均標(biāo)準(zhǔn)差排序28S(0.414 52)

表3 NormFinder軟件分析5個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Table 3 Stability analysis of five internal candidate reference genes by NormFinder software

表4 5個候選內(nèi)參基因及其組合的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 Expression stability of 5 candidate reference genes and their combinations

3 討 論

內(nèi)參基因在嚴(yán)格意義上能夠在不同品種、不同組織及不同發(fā)育時期恒定表達(dá)，不受環(huán)境因素的影響。但是，研究表明，目前還沒有能夠適用于各種細(xì)胞類型、不同組織內(nèi)的內(nèi)參基因[9]。馮焱等[10]在研究脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激對肉雞組織內(nèi)參基因穩(wěn)定性的影響中發(fā)現(xiàn)在不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因不盡相同，18SrRNA、β-actin和GAPDH適用于肝臟中目的基因表達(dá)量的校正；B2M和GAPDH適用于心臟中目的基因表達(dá)量的校正；18SrRNA和β-actin適于回腸中目的基因表達(dá)量的校正。王彥平等[11]使用qRT-PCR在篩選大蒲蓮豬不同發(fā)育階段組織中適宜內(nèi)參基因時也發(fā)現(xiàn)不同體組織中最適宜內(nèi)參基因組合和數(shù)量不同。本研究針對不同候選內(nèi)參基因的系統(tǒng)驗證表明，同一內(nèi)參基因在所有樣品類型中的表達(dá)水平也是不同的，在不同試驗分組下的研究結(jié)果存在差異。因此本研究對雞不同組織、不同發(fā)育時期、不同品種中最佳內(nèi)參基因進行篩選，以期為地方雞和商品肉雞中基因表達(dá)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

目前，針對雞生長發(fā)育基因表達(dá)的研究中，多以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參基因[12-17]。王佳潔等[18]研究不同飼養(yǎng)模式對羅斯308肉雞腿肌中PHGDH基因表達(dá)的影響時以GAPDH為內(nèi)參基因；莫先艇等[19]研究不同生長階段對烏蒙鳳雞不同組織中QDPR基因的表達(dá)影響時以GAPDH為內(nèi)參基因；李豐耘等[20]研究不同品種鹽津烏骨雞和大圍山微型雞中胸肌、腿肌、肝臟等不同組織中對MyoG和IGF-1基因的表達(dá)差異時以β-actin為內(nèi)參基因；屠云潔等[21]研究靈山香雞不同發(fā)育階段中不同組織對CPT1B基因表達(dá)的影響時以β-actin為內(nèi)參基因。綜上可知，在對雞進行生長發(fā)育基因表達(dá)的研究中，使用的內(nèi)參基因并不是唯一的，有必要對內(nèi)參基因在不同組織，不同發(fā)育時期，不同品種中的表達(dá)穩(wěn)定性進行系統(tǒng)分析，從而規(guī)范內(nèi)參基因在不同試驗條件下的使用，進而得出更真實可靠的試驗結(jié)果。而本研究發(fā)現(xiàn)，通過4種算法(Ct值分析法、geNorm、NormFinder、SPSS)對候選內(nèi)參基因(28S、B2M、HSP70、GAPDH和β-actin)在胸肌、腿肌、肝臟、脾臟、十二指腸、空腸、回腸、肌胃和腺胃9個雞不同組織中的穩(wěn)定性分析結(jié)果表明28S在不同組織中的表達(dá)水平最穩(wěn)定。對候選內(nèi)參基因在不同發(fā)育時期中(6、14、22和30 W)的穩(wěn)定性綜合分析結(jié)果表明GAPDH更適合作為研究目的基因在不同發(fā)育時期中的內(nèi)參基因。在以地方品種固始雞和商業(yè)品種羅斯308肉雞為例的不同品種的候選內(nèi)參基因研究中分析結(jié)果表明GAPDH在不同品種中表達(dá)水平最穩(wěn)定，其次是28S?，F(xiàn)有研究表明，利用單一內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M行矯正，不足以解決樣品處理過程中的所有細(xì)微變化，尤其是對不同組織或品種之間進行比較時[22]。因此強烈建議使用2個或多個內(nèi)參基因。使用geNorm進行的配對差異分析時，當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時，n為最佳內(nèi)參基因數(shù)目。本研究在篩選雞不同品種間穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因時，V2/3為0.138，表明2個參考基因足以矯正qRT-PCR分析中的數(shù)據(jù)。因此，在雞不同品種間建議同時使用GAPDH和28S為內(nèi)參基因。本研究的結(jié)果為不同試驗條件下內(nèi)參基因適用的規(guī)范化提供了參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究運用Ct值分析法、獨立評價軟件geNorm，NormFinder和SPSS 4種分析方法得出以地方雞固始雞為例的不同組織，不同時期間最適內(nèi)參基因分別為28S和GAPDH；以地方品種固始雞和商業(yè)品種羅斯308肉雞為例的不同品種間最適內(nèi)參基因為GAPDH和28S基因，為規(guī)范雞相關(guān)基因定量表達(dá)分析中內(nèi)參基因的使用提供參考依據(jù)。