基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的羌活-益智仁藥對(duì)聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療腎病綜合征機(jī)制研究

顧浩 ，王娟，韓森，李立，趙寧，傅強(qiáng)，崔趙麗，丁治國(guó)，王光磊，姜淼

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700；2.濰坊市中醫(yī)院，山東 濰坊 262699；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院東區(qū)，北京 101100

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）以腎小球?yàn)V過(guò)膜損傷導(dǎo)致的大量蛋白尿（尿蛋白＞3.5 g/d）、低蛋白血癥（血漿白蛋白＜30 g/L）、高脂血癥及水腫等為主要癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療NS 多以糖皮質(zhì)激素為首選藥物，但長(zhǎng)期使用會(huì)引發(fā)真菌感染、器官衰竭等多種不良反應(yīng)，尤其是幼兒常產(chǎn)生激素依賴性，影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育。

國(guó)醫(yī)大師呂仁和教授治療NS 特別是小兒NS 收效頗佳。在控制NS 急性發(fā)作期臨床癥狀、降低尿蛋白、疾病穩(wěn)定期激素減量，以及降低激素不良反應(yīng)方面均有獨(dú)特療效與體會(huì)。呂老治療小兒NS 常用羌活與益智仁配伍作為君藥，隨證組方[1]。呂老認(rèn)為，羌活具有促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)生理功能改善的作用，對(duì)于控制NS 病情大有裨益，特別是在病情穩(wěn)定后，應(yīng)用羌活（10～20 g/劑）有利于順利減少激素用量；益智仁為溫補(bǔ)脾腎藥，有溫脾止瀉攝涎、暖腎縮尿固精之效，能夠降低糖皮質(zhì)激素所致不良反應(yīng)，促進(jìn)患兒智力發(fā)育，保護(hù)腎功能，在成人NS 治療中亦可應(yīng)用。二藥聯(lián)用，溫脾益腎、除濕解表，可加強(qiáng)糖皮質(zhì)激素治療作用并降低其不良反應(yīng)，隨證結(jié)合扶陽(yáng)、清里、潤(rùn)肺、溫中等法，臨床療效甚佳。

為深入探討羌活-益智仁藥對(duì)治療NS 的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)二藥的活性成分、治療靶點(diǎn)和作用通路進(jìn)行分析，構(gòu)建羌活-益智仁藥理網(wǎng)絡(luò)及NS 疾病網(wǎng)絡(luò)，并將二藥治療NS 作用通路與糖皮質(zhì)激素作用于NS 相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比對(duì)分析，探討其作為糖皮質(zhì)激素補(bǔ)充療法的藥理作用，以期為該藥對(duì)的進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)和臨床中西醫(yī)結(jié)合用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 羌活-益智仁藥對(duì)活性成分收集

在TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和TCMID（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）數(shù)據(jù)庫(kù)輸入關(guān)鍵詞“羌活”和“益智仁”，得到藥物成分信息，篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 的化學(xué)成分作為羌活-益智仁藥對(duì)活性成分。

1.2 羌活-益智仁藥對(duì)和糖皮質(zhì)激素靶點(diǎn)篩選

將篩選出的羌活-益智仁藥對(duì)活性成分輸入TCMSP 和Stitch 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://stitch.embl.de/），得到藥物活性成分作用靶點(diǎn)，篩選去除重復(fù)靶點(diǎn)后，逐一錄入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/），檢索人類的靶點(diǎn)蛋白名稱（official symbol）和Uniprot ID編號(hào)。

利用 GeneCards（http://www.genecards.org/）、NCBI-gene （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene ）、OMIM（http://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入關(guān)鍵詞“Glucocorticoid”，檢索得到糖皮質(zhì)激素治療靶點(diǎn)。

1.3 腎病綜合征相關(guān)靶點(diǎn)檢索

利用GeneCards、NCBI-gene、OMIM、Malacard（https://www.malacards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入關(guān)鍵詞“nephroticsyndrome”，檢索得到NS 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 腎病綜合征靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），輸入NS靶點(diǎn)，選取combined_score≥0.95的高可信度關(guān)系作為疾病網(wǎng)絡(luò)的邊，構(gòu)建NS疾病網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件（https://cytoscape.org/）進(jìn)行展示和分析。

1.5 腎病綜合征靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模塊分析

利用Cytoscape3.7.2 軟件中的MCODE Cluster 算法[2]，按默認(rèn)參數(shù)（NodeScoreCutoff：0.2；Haircut：true；Fluff：false；K-Core：2；Max.Depth fromSeed：100）對(duì)NS靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分，將復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分解為多個(gè)亞網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而分析核心靶點(diǎn)組合模塊。

1.6 KEGG 通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)羌活-益智仁靶點(diǎn)、糖皮質(zhì)激素靶點(diǎn)及NS靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。利用TBtools軟件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）對(duì)三者在靶點(diǎn)和通路層面的異同進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分

通過(guò)TCMSP 和TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選OB≥30%、DL≥0.18 的羌活-益智仁藥對(duì)活性成分共18 種，其中羌活15種、益智仁4種，谷甾醇（sitosterol）為兩藥共有成分，見表1。

2.2 藥物和疾病靶點(diǎn)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并整理，得到羌活活性成分作用靶點(diǎn)83個(gè)，益智仁活性成分作用靶點(diǎn)51個(gè)，糖皮質(zhì)激素治療靶點(diǎn)2695個(gè)，NS 相關(guān)靶點(diǎn)1229個(gè)。羌活-益智仁藥對(duì)與糖皮質(zhì)激素的共同靶點(diǎn)有68個(gè)，其中26個(gè)與NS相關(guān)。

2.3 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建NS疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有320個(gè)節(jié)點(diǎn)、1018條邊，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)直徑為9，網(wǎng)絡(luò)最短路徑占網(wǎng)絡(luò)所有路徑的65%，節(jié)點(diǎn)平均鄰居數(shù)為6.37，特征路徑長(zhǎng)度為3.647，網(wǎng)絡(luò)中心性為0.16，網(wǎng)絡(luò)聚集系數(shù)為0.414，表明該網(wǎng)絡(luò)具有小世界特性。節(jié)點(diǎn)度（degree）表示與網(wǎng)絡(luò)中某一節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)的其他節(jié)點(diǎn)的數(shù)量。該網(wǎng)絡(luò)的度分布符合冪次分布特征，回歸系數(shù)為0.835。排名前15位的NS疾病靶點(diǎn)見圖2。

圖1 NS疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 NS疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)（前15位）

2.4 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模塊分析

利用MCODE 網(wǎng)絡(luò)模塊劃分方法，對(duì)NS疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)降維分解，得到20個(gè)核心模塊，見圖3。6個(gè)模塊未發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)。有藥物干預(yù)靶點(diǎn)的模塊14個(gè)，其中糖皮質(zhì)激素特有的作用模塊11個(gè)，糖皮質(zhì)激素和羌活-益智仁藥對(duì)共同作用靶點(diǎn)的模塊3個(gè)，見表2。6個(gè)羌活-益智仁藥對(duì)的靶點(diǎn)分別為RELA、TNF、CASP8、IL10、CXCL8和APOE。

圖3 NS疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模塊劃分結(jié)果

2.5 羌活-益智仁藥對(duì)作用通路分析

KEGG富集得到羌活相關(guān)通路65條，益智仁相關(guān)通路26條，NS相關(guān)通路106條（P＜0.05）。羌活-益智仁藥對(duì)與NS直接相關(guān)通路33條，其中6條為羌活與益智仁的共同通路，見圖4。

2.6 羌活-益智仁藥對(duì)與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用通路分析

KEGG 富集得到羌活-益智仁藥對(duì)通路69條，糖皮質(zhì)激素通路166條（P＜0.05）。羌活-益智仁藥對(duì)與糖皮質(zhì)激素治療NS 作用通路網(wǎng)絡(luò)見圖5。其中與NS相關(guān)通路33條。羌活-益智仁藥對(duì)獨(dú)有作用通路7條，分別為逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、ABC運(yùn)輸車、脂肪的消化吸收、尼古丁成癮、阿爾茨海默病、GABA 能突觸、精氨酸和脯氨酸代謝通路，與NS不直接相關(guān)。

表2 NS疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模塊涉及羌活-益智仁藥對(duì)和糖皮質(zhì)激素靶點(diǎn)

圖4 羌活-益智仁藥對(duì)作用于NS相關(guān)通路分析

圖5 羌活-益智仁藥對(duì)與糖皮質(zhì)激素治療NS 作用通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

NS 屬中醫(yī)學(xué)“水腫”范疇，小兒NS 多屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛即肺、脾、腎三臟正氣虧損，以腎虛為主，臨床采用滋陰、補(bǔ)腎、利水治法[3]。羌活通經(jīng)活絡(luò)、行氣活血止痛，配伍益智仁補(bǔ)腎健脾，通中有補(bǔ)，符合NS 本虛標(biāo)實(shí)病機(jī)，祛邪扶正兼顧。呂老常以羌活-益智仁藥對(duì)作為復(fù)方君藥，聯(lián)合糖皮質(zhì)激素控制NS病情發(fā)展，療效顯著且不良反應(yīng)少，尤其用于病情反復(fù)、激素減量過(guò)程中復(fù)發(fā)、激素療效不佳的患兒每獲良效。呂老認(rèn)為，順應(yīng)人體自然規(guī)律，糖皮質(zhì)激素應(yīng)于每日8 點(diǎn)前腎上腺激素分泌水平最高時(shí)服用，激素沖擊治療效果穩(wěn)定后逐漸改為隔日服用。羌活可健脾補(bǔ)腎，消除尿蛋白，激活腎上腺皮質(zhì)功能，從而對(duì)明顯的庫(kù)興氏綜合征有積極效果。配伍補(bǔ)腎健脾的益智仁，可輔助糖皮質(zhì)激素的治療作用并降低其不良反應(yīng)。

本研究顯示，糖皮質(zhì)激素與羌活-益智仁藥對(duì)共同通路共62 條，其中作用于NS 的通路33 條，PI3K-Akt、弓形蟲病、乙肝、利什曼病、美國(guó)錐蟲病、結(jié)核、NF-κB、小細(xì)胞肺癌、TNF 和甲狀腺激素等通路在疾病治療過(guò)程中起主要作用。研究表明，REAL、TNF-α、CASP8、IL10、CXCL8 和APOE 等基因與小兒NS 的發(fā)病與復(fù)發(fā)[4-5]、足細(xì)胞損傷[6]、尿蛋白產(chǎn)生[7]、降低細(xì)胞凋亡[8]、炎癥反應(yīng)[9]、調(diào)節(jié)脂代謝[10]等有關(guān)，這些因素與NS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PI3K-Akt、HIF-1、雌激素、小細(xì)胞肺癌等相關(guān)通路被證實(shí)可以通過(guò)延緩腎臟纖維化[11-12]、促進(jìn)腎小球足細(xì)胞增殖[13-14]、緩解小細(xì)胞肺癌的C-Mip 過(guò)表達(dá)等途徑改善腎臟功能[15]。而且，抑制NF-κB/TNF-α 信號(hào)通路的表達(dá)[16]、調(diào)整甲狀腺激素水平[17]、改善阿米巴原蟲感染通路[18]、改善胰島素抵抗水平[19]均可改善慢性腎功能衰竭微炎癥狀態(tài)，減輕腎間質(zhì)纖維化，從而起到減輕腎損傷的作用。因此，羌活-益智仁藥對(duì)通過(guò)作用于相關(guān)靶點(diǎn)并調(diào)節(jié)相關(guān)通路，可以增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素的治療作用，與呂仁和教授臨床經(jīng)驗(yàn)相符。

糖皮質(zhì)激素抵抗不僅會(huì)降低外源性糖皮質(zhì)激素對(duì)疾病的治療效果，而且可使內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素?zé)o法發(fā)揮其應(yīng)有效用，從而對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，羌活-益智仁能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路，與西藥聯(lián)用可能減少糖皮質(zhì)激素抵抗作用[20]。此外，糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)脂質(zhì)成分進(jìn)入股骨頭并沉積在脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞中，導(dǎo)致股骨頭壞死，羌活-益智仁能夠調(diào)節(jié)脂肪的消化吸收通路，有助于防止脂質(zhì)成分沉積[21]。肝細(xì)胞色素P450-3A 酶可減少股骨頭壞死面積[22]，羌活-益智仁可直接作用于細(xì)胞色素P450通路，對(duì)降低糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死有重要意義。

通過(guò)NS 疾病網(wǎng)絡(luò)模塊化分析，發(fā)現(xiàn)羌活-益智仁作用于3 個(gè)重要的NS 疾病模塊，糖皮質(zhì)激素覆蓋了14 個(gè)模塊，兩者聯(lián)用，涉及疾病模塊總數(shù)的70%。模塊1 中，僅有1 個(gè)靶點(diǎn)SERPINF2 無(wú)藥物作用。該靶點(diǎn)主要與肝臟纖維化有關(guān)，能治療α-2-antiplasmin缺乏癥[23]，推測(cè)可作為NS 藥物潛在靶點(diǎn)。模塊4 中，僅1 個(gè)靶點(diǎn)HRAS 沒(méi)有藥物作用。HRAS 基因突變與Ras/MAPK 信號(hào)通路有關(guān)[24]，而Ras/MAPK 通路與NS 治療密切相關(guān)[25-26]，提示HRAS 可能是NS 疾病治療靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步研究和論證。通過(guò)核心靶點(diǎn)模塊研究，可為潛在疾病靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和藥物組合設(shè)計(jì)提供一定依據(jù)和思路。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)羌活-益智仁藥對(duì)聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療NS 的增效減毒機(jī)制進(jìn)行了解析，研究結(jié)果尚需設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)加以驗(yàn)證。在不斷積累基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的同時(shí)，結(jié)合名老中醫(yī)的寶貴經(jīng)驗(yàn)，可為臨床新藥研發(fā)提供方向和依據(jù)。