α-唾液淀粉酶膠體金免疫滲濾法的建立及其在中藥酶學(xué)作用研究中的應(yīng)用

金旻逸，丁越，陳靜雯，蘭金帥，李俊松，鐘高仁，張彤

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海201203；2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海200090；3.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海200032

α-唾液淀粉酶（salivary alpha-amylase，sAA）是唾液中最豐富的蛋白質(zhì)，主要由腮腺、下頜下腺和舌下腺分泌，屬于消化酶的一種，可水解α-1，4 糖苷鍵，將淀粉降解為葡萄糖和麥芽糖［1-2］。sAA 與腮腺炎、糖尿病［3-4］、壓力誘導(dǎo)的各種心身疾病，如失眠［5］、焦慮［6］、社會(huì)心理應(yīng)激［7］等的發(fā)生密切相關(guān)。因此，作為良好的非侵入性生物標(biāo)志物，常被用于多種疾病的早期診斷和后期療效評(píng)估。

sAA 的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括淀粉-碘化鉀比色法、分光光度法［8］、ELISA 法、免疫熒光法［9］等，但這些方法操作費(fèi)時(shí)，需要借助大型儀器和專(zhuān)業(yè)人員，較難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而生物傳感器技術(shù)、免疫試紙條技術(shù)的不斷發(fā)展，均為sAA 快速檢測(cè)方法的研究提供了新的技術(shù)支持。如VENTURA 等［10］采用石英晶體微天平結(jié)合光化學(xué)固定技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人體液中sAA 的快速定量檢測(cè)；ZHANG 等［11］以淀粉為反應(yīng)底物，利用sAA 水解作用將淀粉分解為麥芽糖，再通過(guò)麥芽糖與鐵氰化鉀在堿性條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)而引起的電位變化計(jì)算酶活性，最終建立起基于電位法的sAA 快速檢測(cè)方法。

膠體金免疫滲濾法是在ELISA 試驗(yàn)、膠體金標(biāo)記技術(shù)和試紙條快速檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用特異性抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)滲濾膜上的斑點(diǎn)顯色情況對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，無(wú)需大型儀器，方便大規(guī)模生產(chǎn)，特別適合目標(biāo)物的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)分析。為了進(jìn)一步提高sAA 在臨床診治及患者自我監(jiān)測(cè)中的檢測(cè)效率，本研究采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，制備金標(biāo)抗體復(fù)合物，并根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制原理，在最佳滲濾條件下，建立sAA 膠體金免疫滲濾半定量檢測(cè)方法。同時(shí)，鑒于sAA 與中醫(yī)脾氣虛證療效評(píng)價(jià)的相關(guān)性，將研制的免疫滲濾試紙應(yīng)用于中藥白術(shù)及葛根的酶學(xué)作用研究，進(jìn)一步驗(yàn)證新方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 膠體金（20 nm）、吸水墊、滲濾卡購(gòu)自上海杰一生物科技有限公司；sAA 多克隆抗體（9.6 mg ／ mL）、sAA 購(gòu)自SIGMA-ALDRICH（中國(guó)）；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽粉劑、PBST 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；硝酸纖維素膜（NC 膜，0.45 μm）購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare Life science；碳酸鉀、Tween 20、甲醇、濃硫酸、pH 試紙（精密）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Goat anti-rabbit IgG-HRP、TMB One Solution（HRPbased ELISA）購(gòu)自愛(ài)必信上海生物科技有限公司；AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG（H + L）購(gòu)自Jackson ImmunoResearch Laboratories，INC.；96 孔 酶 標(biāo)板購(gòu)自康寧（上海）管理有限公司。

1.2 飲片 生白術(shù)飲片、炒白術(shù)飲片、葛根飲片購(gòu)自上海虹橋中藥飲片有限公司。

1.3 膠體金質(zhì)量評(píng)定 采用目測(cè)法觀察膠體金溶液（20 nm）顏色、透明度，再利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200 ～ 1 100 nm 范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)，觀察最大吸收峰的峰形和峰寬。

1.4 膠體金標(biāo)記sA A 抗體的最適條件篩選

采用紫外分光光度法和目測(cè)法分別篩選最佳pH 值和最佳抗體標(biāo)記量［12］。

1.4.1 最佳pH 值

1.4.1.1 紫外分光光度法 在5 mL 膠體金溶液中分別加入不等量（0、50、100、200、300、400 μL）0.1 mol ／ L K2CO3，調(diào)pH 值至5.5、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0，取1.5 mL 試管，分別加入上述1 mL 不同pH 值的膠體金溶液和同體積抗體（48 μg ／ mL），靜置15 min，4 ℃，447 ×g離心10 min，取上清液，在400 ～ 600 nm 范圍內(nèi)測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)和吸光度值，將最大吸收峰處所對(duì)應(yīng)的膠體金pH 值作為最佳標(biāo)記pH 值。

1.4.1.2 目測(cè)法 在膠體金標(biāo)記抗體樣品中加入100 μL 10% NaCl 溶液，8 h 后觀察顏色變化。

1.4.2 最佳抗體標(biāo)記量

1.4.2.1 目測(cè)法 在1 mL 膠體金溶液（pH 8.5）中分別加入同體積不同稀釋比例（1 ∶100、1 ∶150、1 ∶200、1 ∶250、1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000）的抗體溶液，對(duì)照管分別加入PBS 緩沖液（0.01 mol ／ L，pH 7.4）和蒸餾水，充分混勻，靜置15 min，再分別加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻后靜置2 h，觀察混合液顏色變化，將剛好由紅變藍(lán)時(shí)的抗體濃度再加20%，作為最佳標(biāo)記量。

1.4.2.2 紫外分光光度法 將膠體金標(biāo)記抗體樣品靜置15 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液后，靜置10 min，4 ℃，447×g離心10 min，取上清液，在400～600 nm 范圍內(nèi)掃描，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)和吸光度值，以出現(xiàn)最大吸收峰時(shí)所對(duì)應(yīng)的抗體用量為最小保護(hù)劑量，在此基礎(chǔ)上增加20%，作為穩(wěn)定的抗體蛋白用量。

1.5 金標(biāo)抗體復(fù)合物的制備 取5 mL 用0.1 mol ／ L K2CO3溶液調(diào)至最佳pH 值的膠體金溶液，不斷攪拌下緩慢加入5 mL 最佳稀釋比例的sAA 抗體，混勻，磁力攪拌20 min；加入2.5 mL 5% BSA 至終濃度為1%，再緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)20 min，4 ℃過(guò)夜；將上述金標(biāo)抗體復(fù)合物4 ℃，447 ×g低速離心15 min，取上清液，11 180 ×g高速離心30 min；棄上清液，保留管底沉淀，用250 μL Tris-HCl 緩沖液溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 金標(biāo)抗體復(fù)合物的質(zhì)量分析 采用紫外分光光度法、Mey 氏穩(wěn)定化試驗(yàn)法、ELISA 法對(duì)金標(biāo)抗體復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)量分析，驗(yàn)證復(fù)合物的穩(wěn)定性及抗體活性。

1.6.1 紫外分光光度法 在400 ～ 800 nm 范圍內(nèi)對(duì)膠體金和金標(biāo)抗體復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，判斷金標(biāo)抗體復(fù)合物是否制備成功。

1.6.2 Mey 氏穩(wěn)定化試驗(yàn)法 在2 mL 金標(biāo)抗體復(fù)合物、膠體金溶液中分別加入200 μL 10% NaCl 溶液，混勻，室溫靜置3 h，觀察顏色變化，判斷金標(biāo)抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性。

1.6.3 ELISA 法 分別加入100 μL 濃度為0.000 5、0.005、0.05、0.5 μg ／ mL 的sAA 至96 孔酶標(biāo)板中，4 ℃包被12 h；加入PBST（0.05%），100 μL ／ 孔，洗滌3 次，每次3 min，加入1% BSA，100 μL ／ 孔，37 ℃封閉2 h；同上洗滌3 次，加入不同稀釋比例（1 ∶6、1 ∶24、1 ∶96、1 ∶384、1∶1 536、1 ∶6 144）的金標(biāo)抗體復(fù)合物，100 μL ／ 孔，37 ℃孵育1 h；同上洗滌3 次，分別加入Goat anti-rabbit IgG-HRP（1 ∶10 000或1∶100 000 稀釋?zhuān)?00 μL ／ 孔，37 ℃孵育1 h；同上洗滌3 次，加入底物顯色液（TMB One Solution），100 μL ／ 孔，37 ℃避光顯色30 min；加入2 mol ／ L H2SO4，100 μL ／ 孔，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A450值，以P ／ N ≥2，即A450值大于2 倍空白對(duì)照的最高稀釋比例作為抗體的ELISA 終點(diǎn)效價(jià)。

1.7 sA A 膠體金免疫滲濾法的建立

1.7.1 實(shí)驗(yàn)方法 將硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡8 min，取出晾干，膜上畫(huà)出直徑6 mm 的圓圈，將10 μL 工作濃度的sAA 包被于圓圈中，質(zhì)控組包被2 μL 1.3 mg ／ mL Affinipure Donkey Anti-rabbit IgG，分別用50 μL 封閉液滲透全膜，進(jìn)行封閉，再用100 μL PBST 洗滌NC 膜3 次，室溫下自然干燥；將10 μL待測(cè)樣品與10 μL 金標(biāo)抗體復(fù)合物提前混合反應(yīng)，一起加至滲濾卡后，競(jìng)爭(zhēng)性地與膜上的包被抗原結(jié)合，洗滌后，根據(jù)反應(yīng)膜圓圈內(nèi)斑點(diǎn)的顯色情況判斷待測(cè)樣品是否呈陽(yáng)性，質(zhì)控組斑點(diǎn)應(yīng)顯示紅色，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效［12］。

1.7.2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化 采用單因素試驗(yàn)對(duì)包被液種類(lèi)、包被條件、封閉液種類(lèi)、封閉條件、洗滌液種類(lèi)、抗原抗體最佳工作濃度、包被抗原與金標(biāo)抗體反應(yīng)條件、待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體反應(yīng)條件等8 個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得出膠體金免疫滲濾法最佳反應(yīng)條件［12］。

1.8 膠體金免疫滲濾試紙性能的驗(yàn)證

1.8.1 靈敏度 按膠體金免疫滲濾法最佳反應(yīng)條件，對(duì)不同質(zhì)量濃度（0、0.25、0.5、1、5、10、20、80、320、640、750、1 000 μg ／ mL）的sAA 待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試紙的顯色結(jié)果判斷方法靈敏度。其中空白對(duì)照組1 加入的樣品為20 μL 0.01 mol ／ L PBS 緩沖液（pH 7.4），空白對(duì)照組2 包被含8%甲醇的0.01 mol ／ L PBS 緩沖液（pH 7.4），加入的樣品為10 μL 0.01 mol ／ L PBS 緩沖液（pH 7.4）與10 μL金標(biāo)抗體（1 ∶1）的混合液。

1.8.2 初步穩(wěn)定性 將包被有抗原的滲濾試紙密封保存于4 ℃，每隔7 d 取3 份滲濾試紙檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.5 μg ／ mL 的sAA 待測(cè)樣品，連續(xù)考察1 個(gè)月，以試紙顯色情況，判斷試紙的初步穩(wěn)定性。

1.9 sA A 膠體金免疫滲濾法在中藥酶學(xué)作用研究中的應(yīng)用

1.9.1 白術(shù)提取液對(duì)sAA 活性影響的檢測(cè) 將10 μL不同濃度（15.625、31.25、62.5 mg ／ mL）的生白術(shù)或炒白術(shù)提取液與10 μL 320 μg ／ mL sAA 溶液，于37 ℃水浴反應(yīng)15 min；加入10 μL 金標(biāo)抗體原液，繼續(xù)37 ℃水浴反應(yīng)15 min；反應(yīng)結(jié)束后，將混合樣品加至免疫滲濾卡內(nèi)，通過(guò)與空白對(duì)照組斑點(diǎn)的顯色深淺進(jìn)行對(duì)比，判斷白術(shù)水提液對(duì)sAA 與其抗體特異性結(jié)合活性的影響。其中，空白對(duì)照組以雙蒸水代替白術(shù)提取液，質(zhì)控點(diǎn)斑點(diǎn)應(yīng)顯紅色，否則試驗(yàn)無(wú)效。

1.9.2 葛根提取液對(duì)sAA 活性影響的檢測(cè) 將10 μL不同濃度（25、50、100、1 000 mg ／ mL）的葛根提取液與10 μL 10 μg ／ mL sAA 溶液于37 ℃水浴反應(yīng)15 min；加入10 μL 金標(biāo)抗體（1 ∶1）溶液，繼續(xù)37 ℃水浴15 min；反應(yīng)結(jié)束后，將混合樣品加至免疫滲濾卡內(nèi)，通過(guò)與空白組斑點(diǎn)的顯色深淺進(jìn)行對(duì)比，判斷葛根提取液對(duì)sAA 與其抗體特異性結(jié)合活性的影響，各濃度葛根提取液樣品平行檢測(cè)2 份。其中，空白對(duì)照組以雙蒸水代替葛根提取液，質(zhì)控點(diǎn)斑點(diǎn)應(yīng)顯紅色，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

2 結(jié) 果

2.1 膠體金質(zhì)量 膠體金溶液（20 nm）呈鮮亮的酒紅色，無(wú)明顯漂浮物和顆粒沉淀。在200 ～ 1 100 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有1 個(gè)單吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)為519 nm，且吸收峰峰寬較小，表明金納米粒子分布均勻，見(jiàn)圖1。

圖1 膠體金紫外可見(jiàn)光吸收光譜Fig.1 UV visible absorption spectrum of colloidal gold

2.2 膠體金標(biāo)記sA A 抗體的最適條件

2.2.1 最佳pH 值 不同pH 條件下的膠體金標(biāo)記抗體溶液放置8 h 后，僅pH 值為8.5 和9.0 的樣品仍保持紅色不變，見(jiàn)圖2；不同pH 值（5.5、6.5、7.0、8.0、8.5 和9.0）的膠體金標(biāo)記抗體溶液的吸光度值分別為0.289 3、0.304 5、0.272 6、0.337 7、0.354 6 和0.324 0，當(dāng)pH 值為8.5 時(shí)，膠體金標(biāo)記抗體溶液的吸光度值最大，確定pH 8.5 為最佳標(biāo)記pH 值。

圖2 膠體金標(biāo)記抗體溶液放置8 h 后溶液顏色的變化Fig.2 Change in color of colloidal gold nanoparticle-labeled antibody bioconjugates after storage for 8 h

2.2.2 最佳抗體標(biāo)記量 膠體金溶液與稀釋比例為1 ∶100、1 ∶150、1 ∶200、1∶250 和1 ∶500 的抗體蛋白結(jié)合時(shí)，溶液的吸光度值分別為0.419 4、0.438 2、0.327 9、0.273 2 和0.199 5，稀釋比例為1 ∶1 000和1 ∶2 000 時(shí)未檢測(cè)到吸光度值；與稀釋比例為1 ∶100 和1 ∶150 的抗體蛋白結(jié)合時(shí)，溶液顏色保持不變，稀釋比例為1 ∶150 時(shí)，溶液吸光度值最大，在此基礎(chǔ)上增加20%，即以抗體稀釋比例1 ∶125 作為最佳抗體標(biāo)記量。見(jiàn)圖3。

圖3 2 h 后膠體金標(biāo)記抗體溶液的顏色變化Fig.3 Change in color of colloidal gold nanoparticle-labeled antibody bioconjugates after storage for 2 h

2.3 金標(biāo)抗體復(fù)合物的質(zhì)量分析 根據(jù)膠體金標(biāo)記sAA 抗體的最適條件，確定金標(biāo)抗體復(fù)合物的制備方法：取5 mL 用0.1 mol ／ L K2CO3調(diào)至最佳標(biāo)記pH 值為8.5 的膠體金溶液，不斷攪拌下緩慢加入5 mL 稀釋比例為1 ∶125 的sAA 抗體，磁力攪拌20 min；加入2.5 mL 5% BSA 至溶液終濃度為1%，繼續(xù)緩慢攪拌20 min，4 ℃放置過(guò)夜；4 ℃，447 ×g低速離心15 min，收集上清液，4 ℃，11 180 ×g高速離心30 min，棄上清液，留離心管底部沉淀，250 μL Tris-HCl 緩沖液溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)抗體通過(guò)靜電吸附結(jié)合至膠體金顆粒表面后，膠體金粒徑發(fā)生變化，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，吸收峰峰寬增加，金標(biāo)抗體復(fù)合物制備成功，見(jiàn)圖4；Mey 氏穩(wěn)定化試驗(yàn)法觀察結(jié)果顯示，加入10%氯化鈉溶液后，膠體金溶液立即變?yōu)樗{(lán)色，而金標(biāo)抗體復(fù)合物在室溫下靜置3 h，仍保持紅色不變，表明金標(biāo)抗體復(fù)合物穩(wěn)定性良好，見(jiàn)圖5；ELISA 法檢測(cè)結(jié)果顯示，抗原包被濃度為0.5 μg ／ mL，二抗稀釋比例為1 ∶100 000 時(shí)，抗體稀釋比例與A450值線性關(guān)系較好，A450值的變化能反映抗體濃度的變化，因此將金標(biāo)抗體復(fù)合物的效價(jià)定為1 ∶384，見(jiàn)圖6。

2.4 sA A 膠體金免疫滲濾法試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 包被緩沖液 空白對(duì)照組的滲濾膜上無(wú)斑點(diǎn)顯色，背景干擾較少，實(shí)驗(yàn)組中，使用含8%甲醇的PBS 緩沖液（0.01 mol ／ L，pH 7.4）稀釋抗原進(jìn)行包被，滲濾膜上斑點(diǎn)最深，最均勻，顯色效果最好，因此，選擇0.01 mol ／ L pH 7.4 PBS + 8%甲醇作為包被液，見(jiàn)圖7。

圖4 膠體金與金標(biāo)抗體復(fù)合物紫外可見(jiàn)光譜對(duì)比圖Fig.4 UV-visible spectrum of AuNPs and AuNPs-antibody bioconjugate

圖5 金標(biāo)抗體復(fù)合物和膠體金的穩(wěn)定性觀察Fig.5 Stability of AuNPs-antibody and AuNPs

圖6 金標(biāo)抗體復(fù)合物效價(jià)的ELISA 檢測(cè)Fig.6 ELISA titer of colloidal gold-labeled antibody bioconjuage

圖7 包被緩沖液的選擇Fig.7 Optimization of coating buffer

2.4.2 包被條件 37 ℃包被15 或30 min，滲濾膜上斑點(diǎn)顏色均較深，且均勻，考慮到檢測(cè)時(shí)間的長(zhǎng)短，確定37 ℃包被15 min 為最佳包被條件，見(jiàn)圖8。

圖8 包被條件的選擇Fig.8 Optimization of condition for coating

2.4.3 封閉液 用0.01 mol／L pH 7.4 PBS+2%BSA作為封閉液時(shí)，滲濾膜上斑點(diǎn)顯色均勻，顏色最深，為最佳封閉液，見(jiàn)圖9。

圖9 封閉液的選擇Fig.9 Optimization of blocking buffer

2.4.4 封閉條件 滲濾樣品在37 ℃下封閉15 min，膜上斑點(diǎn)顯色均勻，效果最佳，確定最適封閉條件為37 ℃15 min，見(jiàn)圖10。

2.4.5 洗滌液 洗滌液為0.01 mol／L PBS 時(shí)，斑點(diǎn)雖然顯色最深，但不均勻，部分金標(biāo)抗體黏附在膜上無(wú)法洗滌干凈；而洗滌液為0.01 mol ／L PBS+0.4%Tween-20 和0.01 mol ／ L PBS + 0.6% Tween-20時(shí)，斑點(diǎn)顯色均勻，顏色較深，考慮到節(jié)省試劑用量，最終以0.01 mol ／ L PBS + 0.4% Tween-20 作為最適洗滌液，見(jiàn)圖11。

2.4.6 抗原抗體最佳工作濃度 當(dāng)金標(biāo)抗體使用原液時(shí)，其濃度過(guò)高，包被抗原為0 μg ／ mL 時(shí)，仍存在背景干擾，對(duì)樣品檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生較大影響；當(dāng)金標(biāo)抗體稀釋比例為1 ∶3、1 ∶6、1 ∶12 和1 ∶24 時(shí)，斑點(diǎn)顏色太淡或基本無(wú)色，無(wú)法進(jìn)行結(jié)果判斷；只有當(dāng)金標(biāo)抗體稀釋比例為1 ∶1 時(shí)，不僅背景干擾較小，且包被抗原濃度為10 ～ 25 μg ／ mL 時(shí)，斑點(diǎn)顯色均勻，顏色較深，考慮到節(jié)省試劑用量，最終以10 μg ／ mL 作為最佳抗原包被濃度，1 ∶1 作為最佳金標(biāo)抗體稀釋比例，見(jiàn)圖12。

圖10 封閉條件的選擇Fig.10 Optimization of condition for blocking

圖11 洗滌液的選擇Fig.11 Optimization of washing buffer

2.4.7 包被抗原與金標(biāo)抗體反應(yīng)條件 將10 μL 稀釋比例為1 ∶1 的金標(biāo)抗體加在包被10 μL 10 μg／mL sAA 的NC 膜上，25 ℃反應(yīng)10 min，樣品斑點(diǎn)淡，無(wú)法進(jìn)行判斷，20 min 時(shí)，斑點(diǎn)顯色均勻；37 ℃反應(yīng)10 min時(shí)，斑點(diǎn)顯色與25 ℃20 min 時(shí)相似，當(dāng)時(shí)間增加至20、30、60 min 時(shí)，斑點(diǎn)顏色加深，但由于溫度較高，受熱時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致部分金標(biāo)抗體黏附在NC 膜上無(wú)法洗滌干凈，斑點(diǎn)顯色不均勻，因此，將25 ℃反應(yīng)20 min 作為金標(biāo)抗體與包被抗原的最佳反應(yīng)條件。見(jiàn)圖13。

圖12 金標(biāo)抗體稀釋比例為1 ∶1 時(shí)的抗原最佳包被濃度選擇Fig.12 Optimization of antigen concentration for coating at a dilution ratio of colloidal gold-labeled antibody of 1 ∶1

圖13 包被抗原與金標(biāo)抗體最適反應(yīng)條件的選擇Fig.13 Optimization of condition for reaction of coated antigen with colloidal gold-labeled antibody

2.4.8 待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體反應(yīng)條件 37 ℃條件下，待測(cè)樣品中的酶與金標(biāo)抗體結(jié)合較多，相應(yīng)NC膜上的斑點(diǎn)顯色較淺，為了使待測(cè)樣品中的酶能與金標(biāo)抗體結(jié)合完全，將37 ℃作為最佳反應(yīng)溫度，并繼續(xù)考察反應(yīng)時(shí)間，見(jiàn)圖14；在37 ℃條件下，分別預(yù)先反應(yīng)15 和20 min，滲濾樣品的斑點(diǎn)顯色效果無(wú)明顯差異，為縮短反應(yīng)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，將37 ℃反應(yīng)15 min 作為待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體預(yù)先反應(yīng)的最適條件，見(jiàn)圖15。

圖14 待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體最適反應(yīng)溫度Fig.14 Optimization of temperature for reaction of test samples with colloidal gold-labeled antibody

2.5 sA A 膠體金免疫滲濾法的建立 通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，確定sAA 膠體金免疫滲濾法的操作步驟。①包被：將10 μL 10 μg ／ mL sAA（用含8%甲醇的0.01 mol ／ L pH 7.4 PBS 稀釋?zhuān)┌挥贜C 膜中央的圓圈中；質(zhì)控點(diǎn)包被2 μL 1.3 mg ／ mL Affinipure Donkey Anti-rabbit IgG；37 ℃包被15 min；②封閉：以50 μL 含2% BSA 的0.01 mol ／ L pH 7.4 PBS為封閉液，滲透全膜，37 ℃封閉15 min；③洗滌：用100 μL 含0.4% Tween-20 的0.01 mol ／ L PBS 洗膜3 次；④待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體反應(yīng)：將10 μL 待測(cè)樣品與10 μL 稀釋比例為1 ∶1 的金標(biāo)抗體在37 ℃條件下反應(yīng)15 min；⑤樣品檢測(cè)：將20 μL 待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體預(yù)反應(yīng)液加至滲濾膜，25 ℃反應(yīng)20 min，再用100 μL 含0.4% Tween-20 的0.01 mol ／ L PBS洗膜3 次，觀察斑點(diǎn)顯色情況；⑥結(jié)果判斷：根據(jù)NC膜上的斑點(diǎn)顯色情況判斷待測(cè)樣品是否呈陽(yáng)性，質(zhì)控點(diǎn)斑點(diǎn)應(yīng)顯紅色，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

圖15 待測(cè)樣品與金標(biāo)抗體最適反應(yīng)時(shí)間Fig.15 Optimization of time for reaction of test samples with colloidal gold-labeled antibody

2.6 膠體金免疫滲濾試紙的性能驗(yàn)證

2.6.1 靈敏度 當(dāng)sAA 濃度低于5 μg ／ mL 時(shí)，斑點(diǎn)顯色與0 μg ／ mL 樣品無(wú)明顯差異，因此將酶濃度低于5 μg ／ mL 樣品判為陰性；當(dāng)sAA 濃度為5 ～1 000 μg ／ mL 時(shí)，試紙檢測(cè)區(qū)斑點(diǎn)顏色逐漸變淺，且明顯淺于0 μg ／ mL 的斑點(diǎn)顏色，因此免疫試紙的檢測(cè)靈敏度為5 μg／mL；當(dāng)sAA 濃度高于1 000 μg／mL時(shí)，斑點(diǎn)顯色趨于空白對(duì)照組，因此將酶濃度高于1 000 μg ／ mL 樣品判為陽(yáng)性。見(jiàn)圖16。

圖16 膠體金滲濾試紙靈敏度考察結(jié)果Fig.16 Test for sensitivity of colloidal gold filtration test paper

2.6.2 初步穩(wěn)定性 4 ℃條件下每隔7 d 取3 個(gè)試紙檢測(cè)sAA 樣品，結(jié)果顯示，28 d 內(nèi)試紙穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，見(jiàn)圖17。

圖17 膠體金免疫滲濾試紙的穩(wěn)定性考察結(jié)果Fig.17 Test for stability of colloidal gold filtration test paper

2.7 sA A 膠體金免疫滲濾法在中藥酶學(xué)作用研究中的應(yīng)用

2.7.1 白術(shù)提取液對(duì)sAA 與其抗體特異性結(jié)合的影響 白術(shù)提取液對(duì)sAA 與其抗體的特異性結(jié)合活性有一定的促進(jìn)作用，樣品組斑點(diǎn)隨白術(shù)提取液濃度的增加變淺，表明促進(jìn)作用與濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖18。

圖18 白術(shù)水提液對(duì)酶-抗體特異性結(jié)合的影響Fig.18 Effect of Atractylodes macrocephala water extracts on specific binding of sAA to antibody

2.7.2 葛根提取液對(duì)sAA 與其抗體特異性結(jié)合的影響 葛根提取液對(duì)sAA 與其抗體的特異性結(jié)合活性有一定的抑制作用，會(huì)減少酶與金標(biāo)抗體的結(jié)合，樣品組斑點(diǎn)隨提取液濃度的增加變深，表明抑制作用與濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖19。

圖19 葛根水提液對(duì)酶-抗體特異性結(jié)合的影響Fig.19 Effect of Pueraria lobata water extracts on specific binding of sAA to antibody

3 討 論

sAA 是唾液蛋白的主要成分，占唾液總蛋白的40% ～50%，常作為反映消化道疾病的主要指標(biāo)［13］。鑒于唾液生物標(biāo)志物采集、存取的方便，建立一種簡(jiǎn)便、快速、低成本的sAA 快速檢測(cè)方法對(duì)相關(guān)疾病的臨床診治及患者自我監(jiān)測(cè)具有重要意義。

本研究采用膠體金標(biāo)記技術(shù)制備金標(biāo)抗體復(fù)合物，為sAA 免疫滲濾法的構(gòu)建提供了參考。pH 值和抗體標(biāo)記量是影響膠體金標(biāo)記技術(shù)的兩大因素，經(jīng)紫外分光光度法和目測(cè)法判斷，pH 值為8.5 的膠體金溶液標(biāo)記稀釋比例為1 ∶125 的sAA 抗體（原濃度為9.6 mg ／ mL），可獲得穩(wěn)定性、活性均良好的金標(biāo)抗體復(fù)合物。

在此基礎(chǔ)上，利用紙基免疫滲濾技術(shù)，通過(guò)包被液種類(lèi)、包被條件、封閉液種類(lèi)、封閉條件等8 個(gè)影響因素的考察，優(yōu)化免疫滲濾實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)研制的快速檢測(cè)試紙進(jìn)行靈敏度和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，免疫滲濾試紙的靈敏度為5 μg ／ mL，1 個(gè)月內(nèi)初步穩(wěn)定性良好，可實(shí)現(xiàn)sAA 在實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)的快速半定量檢測(cè)。

此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，白術(shù)對(duì)sAA 活性有促進(jìn)作用［14］，而葛根有抑制作用［15］，本文酶學(xué)作用研究結(jié)果與其相似，但兩者是否具有關(guān)聯(lián)性，尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究建立的膠體金免疫滲濾法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、快速、成本低、易于實(shí)現(xiàn)大批量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可為sAA 的快速檢測(cè)提供更多選擇，同時(shí)，該方法在相關(guān)疾病的診斷及療效評(píng)估中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。