二十二碳六烯酸誘導(dǎo)小鼠宮頸癌相關(guān)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡的作用

陳永俊，孫文佳，何金蓉，馬雁冰

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650000

據(jù)2018 年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球每10 萬人中，即有3 人患宮頸癌，而每10 萬死亡人數(shù)中，即有7 人是由于宮頸癌而死亡；在56.9 萬例新發(fā)宮頸癌中，約84%出現(xiàn)在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國家［1］。隨著人乳頭瘤狀病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗的應(yīng)用，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率明顯下降，但由于預(yù)防性疫苗對已建立的持續(xù)感染及腫瘤無顯著效果，以及接種率、接種人群、保護(hù)面等的影響，仍存在大量由于HPV 感染而患宮頸癌的人群。免疫治療在宮頸癌治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。腫瘤免疫治療通常通過激活人體內(nèi)殺傷腫瘤的免疫細(xì)胞以及調(diào)控腫瘤營造的免疫環(huán)境而達(dá)到治療目的。在腫瘤免疫治療中存在以下難題：腫瘤的高突變引起的異質(zhì)性和低免疫原性，以及腫瘤細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞和其他人體細(xì)胞構(gòu)成的免疫抑制微環(huán)境，顯著制約免疫細(xì)胞的產(chǎn)生及其對腫瘤細(xì)胞的識別與殺傷，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，解決這兩個難題成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵［2］。

免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD）指細(xì)胞在死亡過程中會釋放細(xì)胞內(nèi)的ATP、鈣網(wǎng)蛋白、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）和高遷移率簇蛋白1（high mobility group box protein B1，HMGB1）等，起到“發(fā)現(xiàn)我”、“吃我”的信號作用，趨化并激活免疫細(xì)胞，從而達(dá)到抵抗病原體的作用［3］。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，部分化療藥物能引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD，協(xié)同擴(kuò)大腫瘤的治療效果，如奧沙利鉑、米托蒽醌、和多柔比星等［4］，但化療藥物在使用過程中通常具有明顯的副作用，會出現(xiàn)血細(xì)胞減少癥狀、代謝毒性等問題［5］；同時，要在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性焦亡往往需要更高的劑量，因此，篩選能夠有效誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生ICD 的低毒性藥物是近幾年癌癥治療的研究方向之一。

焦亡是新型的ICD 方式，其首次報(bào)道是在弗氏志賀菌感染的巨噬細(xì)胞中，其特征是細(xì)胞膜打孔膨脹，出現(xiàn)空泡狀細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞膜破裂前，會釋放很多焦亡小體、胞內(nèi)物質(zhì)和炎癥因子［6］。已有研究顯示，二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、花青素和二甲雙胍作為腫瘤治療的潛在藥物，能誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)焦亡形式的ICD，起到抑制腫瘤增殖的作用，如在三陰性乳腺癌中，DHA 能誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞出現(xiàn)焦亡，并釋放大量的炎癥因子［7］；二甲雙胍能激活人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 中的GSDME 切割，誘導(dǎo)炎癥，抑制細(xì)胞增殖［8］；花青素為一種天然的水溶性色素，具有抗氧化特性，能誘導(dǎo)口部鱗狀細(xì)胞癌出現(xiàn)焦亡性死亡［9］。上述研究表明，二甲雙胍、花青素及DHA 具有誘導(dǎo)腫瘤ICD 的治療潛力。

本研究使用不同藥物處理小鼠宮頸癌TC-1 細(xì)胞，篩選出能有效誘導(dǎo)ICD 的藥物，并根據(jù)其藥物毒力動力學(xué)特征優(yōu)化策略，為進(jìn)一步開展腫瘤細(xì)胞焦亡研究，以及基于小鼠腫瘤模型開展以誘導(dǎo)焦亡的納米化藥物及ICD 細(xì)胞疫苗進(jìn)行免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 小鼠宮頸癌TC-1 細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基購自以色列biologicalindustrial 公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物、IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific 公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇等購自西隴化工股份有限公司；DHA 購自美國MCE公司；花青素購自中國維克奇生物科技公司；二甲雙胍購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠抗β-actin 單克隆抗體、兔抗LC3b 多克隆抗體抗體以及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和抗鼠IgG 均購自英國Abcam 公司；ATP 檢測試劑盒和LDH 檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)公司公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS、100 U ／ mL 青霉素和0.1 mg／L 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)TC-1 細(xì)胞。

1.4 花青素、二甲雙胍和D H A 對T C-1 細(xì)胞毒性的檢測 將TC-1 細(xì)胞按5 × 104個／ 孔接種12 孔板，1 mL ／ 孔，過夜培養(yǎng)后，用20 mmol ／ L 二甲雙胍處理TC-1 細(xì)胞33 h［8］，2 mg ／ mL 花青素處理TC-1 細(xì)胞23 h［9］，100 μmol ／ L DHA 處理TC-1 細(xì)胞23 h、200 μmol ／ L DHA 處理TC-1 細(xì)胞4 h［10］，以不加藥物的細(xì)胞作為對照。顯微鏡觀察不同藥物處理后的細(xì)胞形態(tài)。

1.5 不同劑量D H A 對T C-1 細(xì)胞死亡影響的檢測 將TC-1 細(xì)胞按5 × 104個／ 孔接種12 孔板，1 mL ／ 孔，過夜培養(yǎng)后，用不同濃度DHA（0、40、80、120、160、200 μmol ／ L）處理TC-1 細(xì)胞8 h，顯微鏡觀察細(xì)胞死亡情況，并檢測LDH 釋放率。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 D H A 處理不同時間對T C-1 細(xì)胞死亡影響的檢測 將TC-1 細(xì)胞按5 × 104個／ 孔接種12 孔板，1 mL ／ 孔，過夜培養(yǎng)后，根據(jù)1.5 項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，用160 μmol ／ L DHA 處理TC-1 細(xì)胞不同時間（4、6、8、10、12 h），顯微鏡觀察細(xì)胞死亡情況，并檢測LDH釋放率。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 D H A 誘導(dǎo)T C-1 細(xì)胞IC D 的檢測 將TC-1 細(xì)胞按5 × 104個／ 孔接種12 孔板，1 mL ／ 孔，過夜培養(yǎng)后，用不同濃度DHA（0、80、120、160、200 μmol ／ L）處理TC-1 細(xì)胞8 h，再用160 μmol／L DHA 處理TC-1細(xì)胞不同時間（0、4、8、12 h），檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中ATP 釋放量。另用160 μmol ／ L DHA 處理TC-1 細(xì)胞6 和12 h，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-6、IL-1茁、TNF-α 的含量。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 LD H 檢測 收樣前1 h，在陽性孔中加入10%乳酸脫氫酶釋放劑，取上清，400 ×g離心5 min，取120 μL 加入96 孔板，再加入60 μL 檢測工作液（乳酸溶液、酶溶液、INT 溶液按體積比1 ∶1 ∶1 混勻），反應(yīng)5 min，在酶標(biāo)儀波長490、620 nm 處測定吸光度值，并按下式計(jì)算細(xì)胞死亡率。

細(xì)胞死亡率（%）=（處理樣品吸光度值- 培養(yǎng)基吸光度值）／（細(xì)胞最大酶活性的吸光度值- 樣品對照孔吸光度值）×100%

1.9 A T P 檢測 細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)4 ℃，12 000 ×g離心5 min，取上清置于4 ℃。配置10 μmol ／ L、5 μmol ／ L、1 μmol ／ L、0.5 μmol ／ L、0.1 μmol ／ L、1 nmol ／ L 的ATP 標(biāo)準(zhǔn)液，在96 孔板中加入100 μL稀釋好的ATP 檢測工作液，室溫放置5 min，再加入20 μL 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)5 min 后，在化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測。

1.10 細(xì)胞因子檢測 采用夾心ELISA 法。用捕獲抗體（1 ∶250 稀釋）包被96 孔板，100 μL ／ 孔，置于濕盒中4 ℃過夜；用洗液（PBST，含0.5‰吐溫-20的PBS）洗滌3 次，每次2 min，用200 μL ELISA ／ELISPOT Diluent（1 ×）室溫封閉1 h；至少洗滌1 次，加入經(jīng)DHA 處理的細(xì)胞上清和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，室溫放置2 h；洗滌3 次，加入檢測抗體（1 ∶250稀釋），室溫孵育2 h；洗滌5 次，加入HRP 標(biāo)記的Streptavidin（1 ∶100 稀釋），室溫孵育30 min；洗滌7次，加入TMB 溶液，室溫避光反應(yīng)15 min，加入終止液（2 N H2SO4），在酶標(biāo)儀波長450 和620 nm 處測定吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.11 D H A 誘導(dǎo)T C-1 細(xì)胞自噬的檢測 有文獻(xiàn)報(bào)道，DHA 會誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬［11］和焦亡，本研究對不同濃度DHA 處理的TC-1 細(xì)胞進(jìn)行Western blot 檢測，以了解DHA 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的可能形式。將TC-1 細(xì)胞按1 × 106個／孔接種6 孔板，培養(yǎng)1 d 后，用不同濃度的DHA（0、40、80、120、160、200 μmol／L）處理5 h。收集細(xì)胞和上清，用PBS 清洗細(xì)胞3 次，用體積為60 μL 含10 μg ／mL 蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑的RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，期間反復(fù)吹打細(xì)胞提取總蛋白，4 ℃，13 800 ×g離心15 min，吸取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，取10 μg，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入50 mL 5%脫脂奶，室溫封閉2 h；分別加入LC3b（1 ∶1 000 稀釋）、茁-actin（1 ∶3 000稀釋）抗體，4 ℃孵育過夜；1 × TBST 清洗3 次，每次10 min，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔及抗鼠IgG（均1 ∶5 000 稀釋），室溫孵育2 h；1 × TBST 清洗3 次，每次10 min，使用ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色，成像并拍攝照片，用ImageJ 測定灰度值。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPadPrism 進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理、分析及作圖。組間比較采用非配對t檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 花青素、二甲雙胍和D H A 對T C-1 細(xì)胞的毒性顯微鏡下觀察顯示，經(jīng)20 mmol ／ L 二甲雙胍處理的TC-1 細(xì)胞與對照組相比增殖減緩，且發(fā)生細(xì)胞死亡，見圖1；經(jīng)2 mg ／ mL 花青素處理23 h 的TC-1細(xì)胞與對照組相比，呈現(xiàn)明顯的死亡情況，且也具有細(xì)胞焦亡的胞膜膨脹形狀，見圖2；經(jīng)200 μmol ／ L DHA 處理4 h 的TC-1 細(xì)胞出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，且死亡的細(xì)胞具有焦亡的特征，而經(jīng)100 μmol ／ L DHA處理23 h 的細(xì)胞僅狀態(tài)不佳，見圖3。根據(jù)不同藥物處理細(xì)胞后的死亡形態(tài)、細(xì)胞死亡率和藥物成本，本研究以DHA 作為主要研究對象，探究其對TC-1細(xì)胞特性的影響。

圖1 顯微鏡觀察二甲雙胍對TC-1 細(xì)胞的毒性（× 400）Fig.1 Microscopy of toxicity of metformin to TC-1 cells（× 400）

圖2 顯微鏡觀察花青素對TC-1 細(xì)胞的毒性（× 400）Fig.2 Microscopy of toxicity of anthocyanins to TC-1 cells（× 400）

圖3 顯微鏡觀察DHA 對TC-1 細(xì)胞的毒性（× 400）Fig.3 Microscopy of toxicity of DHA to TC-1 cells（× 400）

2.2 不同劑量D H A 對T C-1 細(xì)胞死亡的影響 顯微鏡下觀察顯示，隨著DHA 濃度的增加，TC-1 細(xì)胞的狀態(tài)越差，經(jīng)160 和200 μmol ／ LDHA 處理后，出現(xiàn)大量懸浮死亡的細(xì)胞，見圖4。LDH 釋放檢測結(jié)果顯示，DHA 對TC-1 細(xì)胞具有劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作用（P ＜0.05），見圖5。

圖4 顯微鏡觀察不同濃度DHA 對TC-1 細(xì)胞死亡的影響（× 400）Fig.4 Microscopy of effect of different concentrations of DHA on death of TC-1 cells（× 400）

2.3 D H A 處理不同時間對T C-1 細(xì)胞死亡的影響 顯微鏡下觀察顯示，經(jīng)160 μmol ／ L DHA 處理的TC-1細(xì)胞隨著處理時間的延長，細(xì)胞死亡率也逐漸增加，6 h 時，TC-1 細(xì)胞出現(xiàn)死亡情況，處理12 h 的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞焦亡形態(tài)特征，見圖6。LDH 釋放檢測結(jié)果顯示，隨著DHA 處理時間的延長，與對照組相比，細(xì)胞死亡率明顯增加（P ＜0.05），見圖7。

圖5 不同濃度DHA 對TC-1 細(xì)胞LDH 釋放的影響Fig.5 Effect of different concentrations of DHA on release of LDH from TC-1 cells

圖6 顯微鏡觀察DHA 處理不同時間對TC-1 細(xì)胞死亡的影響（× 400）Fig.6 Microscopy of effect of DHA treatment on death of TC-1 cells for different time durations（× 400）

圖7 DHA 處理不同時間對TC-1 細(xì)胞LDH 釋放的影響Fig.7 Effect of DHA treatment for different time durations on release of LDH from TC-1 cells

2.4 D H A 誘導(dǎo)T C-1 細(xì)胞的IC D 經(jīng)不同濃度DHA處理8 h，TC-1 細(xì)胞釋放了更多的ATP，且160 μmol／L DHA 處理組的細(xì)胞釋放量更高（P＜0.05）；經(jīng)160μmol／L DHA 處理4 h，細(xì)胞上清中的ATP 升至最高，隨后下降，但均高于未處理組（P ＜0.05）。見圖8。經(jīng)160 μmol ／ L DHA 處理后的TC-1 細(xì)胞與未處理組相比，其IL-6、IL-1β、TNF-α 的分泌量顯著升高（P ＜0.05），見圖9。綜合以上結(jié)果，表明DHA 能夠誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞ICD。

2.5 D H A 誘導(dǎo)T C-1 細(xì)胞的自噬 經(jīng)DHA 處理后的TC-1 細(xì)胞其LC3bⅡ與Ⅰ型比例升高，見圖10 和圖11。表明DHA 能夠有效誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞提高自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

圖8 DHA 誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞釋放ATP 的情況Fig.8 Induction of ATP release from TC-1 cells by DHA

圖9 DHA 誘導(dǎo)TC-1 釋放炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的情況Fig.9 Induction of releases of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α from TC-1 by DHA

圖10 Western blot 分析不同濃度DHA 處理5 h TC-1 細(xì)胞LC3bⅡ的表達(dá)情況Fig.10 Western blotting of expression of LC3bⅡin TC-1 cells treated with different concentrations of DHA for 5 h

圖11 不同濃度DHA 處理5 h TC-1 細(xì)胞LC3bⅡ的表達(dá)情況Fig.11 Expression of LC3b Ⅱin TC-1 cells treated with different concentrations of DHA for 5 h

3 討 論

目前癌癥的主要臨床治療手段仍為手術(shù)切割、化療、放療等，而免疫療法具有廣闊的發(fā)展前景。嵌合抗原受體T 細(xì)胞療法（cChimeric antigen receptorsmodified T cells，CAR-T）和免疫檢查點(diǎn)療法的出現(xiàn)，給癌癥的免疫治療帶來了希望，但仍受到明顯的限制，如腫瘤類型、個體應(yīng)答情況及可能的副作用等。近年來發(fā)現(xiàn)，一些化療藥物能引起癌細(xì)胞發(fā)生ICD，激發(fā)機(jī)體免疫，增強(qiáng)治療效果，如何有目的的安全而高效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD，并充分利用其特征實(shí)現(xiàn)有效腫瘤治療成為新的研究方向，因此，探討低毒性、可誘導(dǎo)癌細(xì)胞ICD 的藥物，摸索其優(yōu)化誘導(dǎo)策略，研究ICD 的死亡動力學(xué)與免疫應(yīng)答特征，對于有效利用腫瘤細(xì)胞ICD 達(dá)到治療目的具有重要意義。

DHA 是Omega-3 不飽和脂肪酸家族中的重要成員，是身體發(fā)育必要的營養(yǎng)成分，具有抑制機(jī)體炎癥、抗氧化的作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平，已有研究發(fā)現(xiàn)DHA 對癌細(xì)胞可能具有較好的靶向毒性作用［12］；同時，也有小鼠模型研究報(bào)道，利用DHA 和二甲雙胍制備納米藥物，抑制了4T1 乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移［13］。焦亡是新的細(xì)胞ICD 方式，本課題組擬基于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡，探討有效的腫瘤免疫治療策略，如納米化藥物靶向遞送焦亡誘導(dǎo)劑，以及利用焦亡的腫瘤細(xì)胞作為疫苗激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答等。而這些研究的重要基礎(chǔ)是如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的焦亡。本研究用二甲雙胍、花青素和DHA 分別對宮頸癌相關(guān)細(xì)胞TC-1 進(jìn)行體外誘導(dǎo)處理，發(fā)現(xiàn)花青素和DHA 能有效刺激細(xì)胞出現(xiàn)空泡的焦亡形態(tài)，但花青素所需成本較高。在用DHA 體外誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞死亡的過程中，重點(diǎn)考察了誘導(dǎo)物濃度效應(yīng)及死亡進(jìn)程的時間特征；此外，對DHA 誘導(dǎo)的TC-1 細(xì)胞進(jìn)行LC3b 檢測發(fā)現(xiàn)，DHA 能誘導(dǎo)TC-1 細(xì)胞提高自噬，并釋放了大量的炎癥因子及ICD 的相關(guān)分子ATP，結(jié)合其“細(xì)胞溶脹”這一典型的焦亡形態(tài)特征，提示DHA 誘導(dǎo)了TC-1 細(xì)胞的免疫原性焦亡。

綜上所述，本研究初步確定了DHA 誘導(dǎo)TC-1細(xì)胞ICD 的優(yōu)化條件，并了解了基本特征，為相關(guān)研究的進(jìn)一步開展奠定了基礎(chǔ)。