重組人粒細(xì)胞刺激因子生物學(xué)活性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的制備及協(xié)作標(biāo)定

劉蘭，于雷，丁有學(xué)，郭瑩，史新昌，饒春明

中國(guó)食品藥品檢定研究院 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

重組人粒細(xì)胞刺激因子（recombinant humna gra- nulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）是我國(guó)治療性重組生物制品的重要產(chǎn)品，該產(chǎn)品為小容量注射劑，主要用于治療放療、化療及骨髓移植后中性粒細(xì)胞減少癥［1］。

截至2019 年6 月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站（http: ／ ／ www.sda.gov.cn ／ WS01 ／ CL0001 ／）數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)現(xiàn)有15 家相關(guān)制藥企業(yè)，10 個(gè)規(guī)格，69 個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)。國(guó)內(nèi)rhG-CSF 制品生物學(xué)活性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：98 ／ 01；文號(hào)：2001 國(guó)生標(biāo)字0005，以下簡(jiǎn)稱(chēng)第1 批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品）量值可溯源至WHO 的第1 批rhG-CSF 生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品（88 ／ 502），以下簡(jiǎn)稱(chēng)第1 批國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品［2］。目前，第1 批國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品已更替為第2 批國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，因此，本研究以第2 批國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品量值為溯源，制備第2 批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡(jiǎn)稱(chēng)待標(biāo)品），以期為rhG-CSF 制品的質(zhì)量控制提供保障。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及原液 第2 批國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自NIBSC；rhG-CSF 原液（批號(hào)：CS2015B07）購(gòu)自廈門(mén)特寶生物工程股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 人血白蛋白（A502F6661）購(gòu)自?shī)W克特琺瑪藥劑生產(chǎn)有限公司；海藻糖（O0802A）購(gòu)自上海西寶生物科技有限公司；甘露醇（1508059）購(gòu)自河北華旭藥業(yè)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；水分測(cè)定儀851 Titrando 購(gòu)自瑞士Metrohm公司。

1.3 待標(biāo)品的制備 100 μg ／ mL rhG-CSF 原液加入凍干保護(hù)劑（人血白蛋白1.0 mg ／ mL、海藻糖1.0 mg ／ mL、氯化鈉溶液9.0 mg ／ mL、甘露醇7.0 mg ／ mL），按0.5 mL ／ 瓶分裝，凍干后充氮封口，置-20 ℃保存。于分裝過(guò)程中，約每500 支取1 次樣（共5 次），稱(chēng)重，計(jì)算灌裝變異度。

1.4 待標(biāo)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性的檢測(cè) 按《中國(guó)藥典》三部（2015 版）［3］規(guī)定的方法對(duì)待標(biāo)品進(jìn)行外觀、無(wú)菌、水分和生物學(xué)活性檢測(cè)。

1.5 待標(biāo)品熱加速穩(wěn)定性的檢測(cè) 將待標(biāo)品置-20、4、25、37 ℃分別放置1、2 和3 個(gè)月，各時(shí)間點(diǎn)取3 支樣品，以-20 ℃保存的待標(biāo)品為參照，計(jì)算其他溫度保存待標(biāo)品的相對(duì)生物學(xué)活性。同時(shí)采用熱動(dòng)力溫度衰減軟件建立擬合Eyring equation 方程：ln{k（t）} =A - B ／ T + ln（T），估算所制待標(biāo)品的衰減時(shí)間。

1.6 待標(biāo)品的協(xié)作標(biāo)定 組織國(guó)內(nèi)5 家實(shí)驗(yàn)室參加協(xié)作標(biāo)定。采用《中國(guó)藥典》三部（2015 版）［3］通則3525 中闡述的方法，即NFS-60 細(xì)胞／ 溴化四唑藍(lán)（MTT）顯色法／酸性裂解液／四參數(shù)方程分析法進(jìn)行標(biāo)定。將待標(biāo)品分成A 和B 兩組，以第2 批國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行平行檢測(cè)，同次試驗(yàn)在3 塊96 孔板上進(jìn)行，于不同時(shí)間進(jìn)行3 次試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 待標(biāo)品的分裝精度 5 個(gè)階段樣品檢測(cè)結(jié)果均值分別為0.501 2、0.500 0、0.500 5、0.500 1 及0.501 9 g，變異度分別為0.32%、0.31%、0.34%、0.36%、0.27%，總變異度＜1%，表明分裝精度較高。

2.2 待標(biāo)品的關(guān)鍵質(zhì)量檢測(cè) 待標(biāo)品外觀為白色疏松體，加入1 mL 注射用水后復(fù)溶為無(wú)色澄明液體；無(wú)菌生長(zhǎng)；水分含量為0.4%；生物學(xué)活性為具有與rhG-CSF 一致的使NFS-60 細(xì)胞增殖效應(yīng)。

2.3 待標(biāo)品的熱加速穩(wěn)定性 熱加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，獲得熱動(dòng)力溫度衰減軟件擬合Eyring equation方程為：ln{k（t）} = 18.49 - 7 853 ／ T + ln（T），R2=0.880。預(yù)測(cè)待標(biāo)品于-20 ℃貯存時(shí)，生物學(xué)活性衰減10%約需111 個(gè)月；于-30 ℃貯存時(shí)，生物學(xué)活性衰減10%約需417 個(gè)月。

2.4 待標(biāo)品的協(xié)作標(biāo)定 待標(biāo)品A 和B 的算術(shù)平均值分別為4.29 × 106和4.26 × 106IU ／ 支，標(biāo)準(zhǔn)差分別為為0.48 × 106和0.64 × 106IU ／ 支；待標(biāo)品A 和B 合并后算術(shù)平均值為4.27×106IU／支，標(biāo)準(zhǔn)差為0.56 × 106IU ／ 支。均值95%的置信區(qū)間為4.15×106～4.39×106IU／支，約為97%～103%。待標(biāo)品A 和B 對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)換后的幾何平均值分別為4.26×106和4.21×106IU／支，幾何變異度-1（geometric variability-1，GCV-1）分別為為0.12 和0.16；待標(biāo)品A 和B 合并后幾何平均值為4.23 × 106IU ／ 支，GCV-1為0.14。均值95%的置信區(qū)間為4.12×106～4.35×106IU／支，約為97% ～103%。見(jiàn)表2。本次協(xié)作標(biāo)定制備的待標(biāo)品賦值為4.2 × 106IU ／ 支。

表1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（相對(duì)生物學(xué)活性）Tab.1 Test result for thermal stability（relative biological activity）

表2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果Tab.2 Result of collaborative calibration

3 討 論

rhG-CSF 生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品在rhG-CSF 生物學(xué)活性測(cè)定過(guò)程中起到重要作用，可用于定量批生產(chǎn)的rhG-CSF 生物學(xué)活性量值［4］。rhG-CSF 生物學(xué)活性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)用區(qū)域內(nèi)rhG-CSF 生物學(xué)活性量值的標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化具有重要意義，是rhG-CSF 生物學(xué)活性溯源的源頭。rhG-CSF 生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性對(duì)應(yīng)用區(qū)域內(nèi)rhG-CSF 制品的定量有重要影響，穩(wěn)定性不佳將使rhG-CSF 生物學(xué)活性量值誤差較大，標(biāo)準(zhǔn)品隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，若其生物學(xué)活性持續(xù)降低將使被定量制品的生物學(xué)活性發(fā)生上升趨勢(shì)的飄移。另外，標(biāo)準(zhǔn)品的均勻性也會(huì)對(duì)檢測(cè)的不確定度產(chǎn)生附加影響。

Eyring 方程是關(guān)于化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)與溫度之間的關(guān)系式。該公式的首要前提是不同溫度下發(fā)生的反應(yīng)一致（僅速率不同），進(jìn)而在貯存壽命定量評(píng)估中應(yīng)用較廣泛［5-9］。該公式描述溫度對(duì)某種過(guò)程反應(yīng)速率的影響，若幾個(gè)反應(yīng)共同決定試驗(yàn)樣品的反應(yīng)速率，如標(biāo)準(zhǔn)品的貯存過(guò)程中發(fā)生氧化和聚集等［10-11］，則公式預(yù)測(cè)會(huì)產(chǎn)生偏移。通常將熱加速試驗(yàn)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)品存放的溫度和期間核查間隔的參考。

協(xié)作標(biāo)定方案中的待標(biāo)品A 和B 為同一待標(biāo)品的不同抽樣組，即在同一塊96 孔板上做了兩支供試品，目的是評(píng)估參與協(xié)作標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力［4］，結(jié)果表明，參與實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的變異度均在可接受范圍內(nèi)。

本研究制備了第2 批rhG-CSF 生物學(xué)活性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，并聯(lián)合5 家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了協(xié)作標(biāo)定。制備的標(biāo)準(zhǔn)品各項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）［3］的要求，且熱加速穩(wěn)定性良好，置-30 ℃可保存30 年以上；協(xié)作標(biāo)定制備的標(biāo)準(zhǔn)品賦值為420 萬(wàn)IU ／ 支。