蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花固定化酶的制備及其結(jié)構(gòu)、性能分析

孟虹，趙怡，李憲臻，李蓉

大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116000

異麥芽酮糖（α-D-glucosylpyranosyl-1，6-D-fructofranose）是蔗糖的一種同分異構(gòu)體，其物理性質(zhì)與蔗糖相似，由于其能以緩慢的速率將葡萄糖釋放于血液中，避免人體血糖突然上升及下降，對(duì)人體機(jī)制具有保護(hù)作用，因此被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，是目前較受歡迎的甜味劑［1］。蔗糖異構(gòu)酶是一種高效的將蔗糖轉(zhuǎn)換成異麥芽酮糖的生物酶試劑，其高效專一，轉(zhuǎn)化效率高，但利用游離的蔗糖異構(gòu)酶作用時(shí)，其易失活、不穩(wěn)定、難以重復(fù)利用及效率低［2-3］。因此，一般選用將蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定化來(lái)解決這一問(wèn)題。酶的固定化方法較多，主要有物理及化學(xué)法［4-5］，傳統(tǒng)的固定化方法雖可提高酶的穩(wěn)定性，但往往會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低。

近年來(lái)，酶的固定化載體材料已逐漸由高分子材料轉(zhuǎn)向納米材料［6-7］，因納米材料擁有較大的表面積及巨大的空間結(jié)構(gòu)，增加了酶的裝載量，利于酶與底物充分接觸反應(yīng)，從而提高了游離酶的穩(wěn)定性［8］，卻不對(duì)游離酶的活性造成損失［9-10］。目前，納米花型固定化方法受到廣泛關(guān)注［11］。有文獻(xiàn)表明，利用含Cu2+的無(wú)機(jī)物與蛋白質(zhì)雜化形成的納米花，可提高游離酶的穩(wěn)定性及效率［12］。

本實(shí)驗(yàn)以蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ結(jié)合Cu2+制備納米花固定化酶（簡(jiǎn)稱蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花），優(yōu)化制備條件，通過(guò)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）及透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察納米花固定化酶的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并分析其穩(wěn)定性及重復(fù)利用性。

1 材料與方法

1.1 菌株 重組表達(dá)菌株pET28a-PalⅠE.coliBL21（DE3）［其中蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ（NCBI accession number AAK82938）來(lái)源于Klebsiella sp.LX3 菌株］及pET28a／E.coliBL21 由大連工業(yè)大學(xué)生物催化技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 主要試劑及儀器 IPTG、卡那霉素、LB 培養(yǎng)基、Q 柱及Ni 柱均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；蔗糖、葡萄糖及3，5-二硝基水楊酸均購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；無(wú)水硫酸銅購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；SpectraMax Paradigm 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器（上海）有限公司；JSM 6460掃描電子顯微鏡及JEM 2100 透射電子顯微鏡購(gòu)自日本電子株式會(huì)社。

1.3 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ的重組表達(dá)及純化 將pET28a-PalⅠ-E.coliBL21（DE3）重組菌接種于含50 μg ／ mL卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r ／ min 振蕩培養(yǎng)至A600為0.6 ～0.8 時(shí)，加入終濃度0.5 mmol ／L IPTG，16 ℃，200 r／min 振蕩誘導(dǎo)16 ～20 h；8 601×g離心10 min 收菌，進(jìn)行超聲破碎，15 428 ×g離心20 min，獲得蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ粗酶液；通過(guò)Q 柱及Ni 柱純化蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ。各產(chǎn)物進(jìn)行12% SDSPAGE 分析，以pET28a ／E.coliBL21 為對(duì)照。

1.4 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花的制備及條件優(yōu)化

1.4.1 制備 1.6 mg 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ溶于2 mL 10 mmol／L 磷酸鹽緩沖溶液，搖勻后滴入120 mmol／L無(wú)水硫酸銅溶液100 μL，掁蕩混勻，靜置反應(yīng)，用緩沖液洗滌3 次，13 440 ×g離心10 min，收集沉淀，測(cè)定蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花蛋白含量及酶活性。

1.4.2 磷酸鹽緩沖溶液pH 的優(yōu)化 磷酸鹽緩沖溶液的pH 分別設(shè)為6.0、7.4、8.0 及9.0，按1.4.1 項(xiàng)制備，確定最適pH。

1.4.3 制備時(shí)間的優(yōu)化 制備時(shí)間分別設(shè)為12、24、48、72 及120 h，按1.4.1 項(xiàng)制備，確定最適制備時(shí)間。

1.4.4 制備溫度的優(yōu)化 制備溫度分別設(shè)為4 及25 ℃，按1.4.1 項(xiàng)制備，確定最適制備溫度。

1.5 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花的結(jié)構(gòu)表征 以最適條件制備獲得的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花通過(guò)真空冷凍干燥，收集樣品均勻涂布于載玻片上，通過(guò)SEM 觀察其形貌及結(jié)構(gòu)特征。另取適量蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花粉末懸浮于無(wú)水乙醇中混勻，取2～3 滴于銅膜上，待液體完全揮發(fā)后通過(guò)TEM觀察單一納米花的花瓣結(jié)構(gòu)。

1.6 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花穩(wěn)定性的檢測(cè) 將游離的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ及蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花分別保存于pH 7.4 的磷酸緩沖液中，置4 ℃冰箱中儲(chǔ)存3、6、9、12 及15 d，分別測(cè)定其酶活性。

1.7 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花循環(huán)利用的檢測(cè)將制備的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花于37 ℃催化2%蔗糖反應(yīng)2 h，測(cè)定的酶活性設(shè)為100%，回收蔗糖異構(gòu)酶PalⅠI-Cu2+納米花，洗滌3 次，去除納米花表面殘留的底物蔗糖及產(chǎn)物異麥芽酮糖，重復(fù)催化反應(yīng)5 次，比較其酶活性變化。

1.8 酶活性測(cè)定 將蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ100 μL（或蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花0.016 mg）與200 μL 2%的蔗糖及1 700 μL 緩沖液組成2 mL 反應(yīng)體系，于37 ℃反應(yīng)2 h，使用3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS 法）檢測(cè)反應(yīng)后產(chǎn)生的還原糖量，并根據(jù)還原糖量檢測(cè)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ或PalⅠ-Cu2+納米花酶活性。酶活性以1 min 內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1 μmol ／ L 還原糖所需的酶量為1 U。

2 結(jié) 果

2.1 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ的鑒定 經(jīng)12%SDS-PAGE 分析，蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ粗酶液經(jīng)Q 柱及Ni 柱純化后，在相對(duì)分子質(zhì)量約66 000 處均可見(jiàn)1 條明顯的目標(biāo)條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。表明蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ表達(dá)正確。

圖1 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE profile of sucrose isomerase PalⅠ

2.2 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花的最適制備條件

2.2.1 磷酸鹽緩沖溶液pH 磷酸鹽緩沖溶液pH 為7.4 時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的酶活性最高，當(dāng)pH ＞8.0 后，其酶活性顯著降低至失活，見(jiàn)圖2。選擇7.4 為最適pH 值。

圖2 磷酸鹽緩沖溶液pH 對(duì)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花酶活性的影響Fig.2 Effect of pH value of phosphate buffer on enzyme activity of sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+nanoflower

2.2.2 制備時(shí)間 隨制備時(shí)間（12 ～48 h）逐漸增加，蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的酶活性逐漸升高并在48 h 時(shí)達(dá)峰值，制備時(shí)間的繼續(xù)增加，酶活性明顯下降，但仍保持在90%以上，見(jiàn)圖3。選擇48 h 為最適制備時(shí)間。

圖3 制備時(shí)間對(duì)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花酶活性的影響Fig.3 Effect of time for preparation on enzyme activity of sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+nanoflower

2.2.3 制備溫度 4 ℃制備的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的活性高于25 ℃下制備的PalⅠ-Cu2+納米花，表明于4 ℃反應(yīng)其穩(wěn)定性更高，見(jiàn)圖4。選擇4 ℃為最適制備溫度。

圖4 制備溫度對(duì)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity of sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+nanoflower

2.3 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花的結(jié)構(gòu)表征 SEM觀察顯示，蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花具有多級(jí)結(jié)構(gòu)，組成納米花的花瓣緊實(shí)周密，其形成的球型結(jié)構(gòu)均勻、分散性良好，每個(gè)球形結(jié)構(gòu)既獨(dú)立又集中，見(jiàn)圖5。TEM 觀察顯示，形成納米花的花瓣細(xì)膩飽滿，呈絲綢狀，每朵花瓣間緊密附著，形成1 個(gè)聚集體，邊緣整齊明顯，見(jiàn)圖6。

圖5 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花結(jié)構(gòu)的20 000 倍（A）及10 000 倍（B）SEM 觀察Fig.5 Structure of sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+ nanoflower under SEM at magnifications 20 000（A）and 10 000（B）

圖6 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花結(jié)構(gòu)的TEM 觀察Fig.6 Structure of sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+ nanoflower under TEM

2.4 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花的穩(wěn)定性 結(jié)果顯示，游離的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ于4 ℃放置6 d 后僅余50%的酶活性，9 d 后已基本失活；蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的酶活性隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)，活性有小幅度的下降，15 d 后酶活性仍保留80%的初始活性。見(jiàn)圖7。表明納米花結(jié)構(gòu)明顯提高了酶的穩(wěn)定性。

圖7 游離的蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ及蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的穩(wěn)定性Fig.7 Stabilities of free sucrose isomerase and sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+nanoflower

2.5 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-C u2+納米花的循環(huán)利用性 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花循環(huán)利用1 次后，其酶活性降低至初始酶活性的60%，之后的酶活性降低趨于穩(wěn)定，循環(huán)6 次后，酶活性仍余40%，見(jiàn)圖8。提示其具有較好的循環(huán)性能。

圖8 蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花的循環(huán)利用Fig.8 Cyclic utilization of sucrose isomerase PalⅠ-Cu2+nanoflower

3 討 論

Cu2+在滴加至磷酸緩沖液時(shí)會(huì)逐步形成花瓣聚集狀的納米花骨架。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向含有蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ磷酸鹽緩沖液中滴加Cu2+制備獲得雜化蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花。在最適的制備條件下，蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ酶分子均勻分布于溶液中，在納米骨架生成過(guò)程中，花瓣?duì)畹慕Y(jié)構(gòu)可顯著增加表面積，即可將更多的游離蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ酶包裹進(jìn)去，提高了蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ的固定化率，也對(duì)酶起保護(hù)作用，使其免受外界因素的干擾，增加了酶的穩(wěn)定性。

通過(guò)對(duì)蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花進(jìn)行SEM 及TEM 觀察表征，顯示其為單一的、花瓣緊實(shí)的球形結(jié)構(gòu)。與游離蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ相比，蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ-Cu2+納米花結(jié)構(gòu)具有更高儲(chǔ)存穩(wěn)定性及重復(fù)利用性，大大的提高了蔗糖異構(gòu)酶PalⅠ的循環(huán)利用率。

本研究表明，利用金屬離子制備納米花技術(shù)作為新型固定化技術(shù)擁有良好的穩(wěn)定性、實(shí)用性及高效性。在固定化酶領(lǐng)域中有無(wú)限的潛能，具有廣泛的發(fā)展前景。