馬皰疹病毒1 型X J2015 株的增殖、純化及鑒定

賈欽瑞，鮑子磊，車傳忠，鄭學(xué)功，翟少華，冉多良

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052

馬皰疹病毒1 型（equine herpesvirus-1，EHV-1）是馬屬動物傳染性疾病重要病原之一，該病在全世界廣泛分布，患病馬主要臨床癥狀為呼吸系統(tǒng)疾病、孕馬流產(chǎn)、新生馬駒死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病，給養(yǎng)馬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1-4］。

目前該病防治措施主要以疫苗免疫為主，獲得高純度、高回收率、穩(wěn)定性較好的病毒能減輕免疫后副反應(yīng)，是提高疫苗質(zhì)量及安全的重要手段［5］。國內(nèi)還未研制EHV-1 商品化疫苗，純化工藝尚需補充。本研究采用蔗糖密度梯度超速離心法純化EHV-1病毒顆粒，通過免疫電鏡觀察、病毒效價、SDS-PAGE、Western blot、馬致病性試驗方法，對純化方法的可行性進(jìn)行分析，以期用于抗體制備、篩選及抗原檢測等相關(guān)研究，為該病毒的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞 EHV-1-XJ2015 分離株、RK-13 細(xì)胞由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 EHV-1 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由美國俄亥俄州動物疫病診斷實驗室（ALADS）惠贈；高糖培養(yǎng)基（DMEM）、雙抗購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自以色列BI 公司；胰酶、EDTA 購自北京索萊寶科技有限公司；硫酸銨、蔗糖、透析膜購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗馬IgG 購自美國Abcam 公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司。

1.3 實驗動物 母馬，2～3 歲，購自伊犁尼勒克馬場，通過間接ELISA 方法［6］篩選EHV-1 抗體陰性馬匹。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒增殖 RK-13 細(xì)胞長成致密單層時更換為含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，將EHV-1-XJ2015 按MOI = 0.1 接種細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至CPE 達(dá)90%以上時，收獲病毒液。

1.5 病毒濃縮及純化

1.5.1 濃縮 將病毒原液與pH 7.0 的60%飽和硫酸銨溶液混合，4 ℃攪拌過夜后靜置2 h；4 ℃，7 500 ×g離心60 min，棄上清，PBS 重懸沉淀并轉(zhuǎn)移至截留相對分子質(zhì)量100 kD 的透析袋中，4 ℃透析48 h。

1.5.2 純化 用PBS 配制10%、30%及60%的蔗糖密度梯度溶液，沿離心管側(cè)壁緩慢從高濃度至低濃度依次加入1 mL，取1 mL 濃縮病毒液加至梯度柱頂部，4 ℃，110 000×g離心2 h，收集純化病毒液，4 ℃，110 000 ×g離心2.5 h 進(jìn)行脫糖，預(yù)冷PBS 重懸病毒，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫電鏡觀察 采用液相免疫電鏡法-離心法。取待檢樣品（0.2 mL）與陽性血清（0.1 mL）充分混合，37 ℃感作1 h；10 000 ×g離心30 min，棄上清，PBS 重懸沉淀，于銅網(wǎng)吸附5 min，濾紙吸取多余病毒懸液，滴加20 g ／ L 磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，待銅網(wǎng)干燥后電鏡觀察。

1.7 病毒滴度檢測 采用Reed-Meunch 法檢測病毒原液、濃縮病毒液及純化病毒液病毒滴度，按下式計算病毒回收率。

1.8 純化抗原的鑒定 取RK-13 細(xì)胞上清液、病毒原液、濃縮病毒液及純化病毒液，進(jìn)行SDS-PAGE 分析及Western blot 鑒定。

1.8.1 SDS-PAGE 將樣品煮沸變性后，于12%SDSPAGE，80 V 電泳40 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，120 V 繼續(xù)電泳90 min；考馬斯亮藍(lán)染色24 h 后脫色、照相。

1.8.2 Western blot 將樣品經(jīng)12% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用5%脫脂乳4 ℃封閉過夜；加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（5%脫脂奶粉1 ∶200 稀釋），37 ℃孵育2 h；PBST 洗滌3 次，5 min ／ 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗馬IgG（5%脫脂奶粉1 ∶10 000稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌5 次，5 min ／ 次，DAB 顯色，照相。

1.9 馬體致病性試驗 用PBS 將純化病毒液稀釋至106TCID50／mL，鼻內(nèi)感染（超聲霧化器）馬，1 mL／匹，攻毒后觀察14 d，設(shè)攻毒組和PBS 對照組，每組2匹（分別編號為1 ～ 4 號），每日監(jiān)測體溫變化，并采用gB 熒光定量PCR 法檢測鼻液排毒情況。上游引物：5′-TCTTTAGCGGTGATGTGGAA-3′，下游引物：5′-AGGTCGTAGGTGCGGTTAGA-3′，擴(kuò)增片段大小130 bp。反應(yīng)體系：模板2.00 μL，上下游引物各1 μL，2 × PCR Master Mix 25 μL，Rnase free d H2O 21 μL。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性2 min；96 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸10 s，共40 個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒增殖情況 RK-13 細(xì)胞接種EHV-1-XJ2015后產(chǎn)生CPE，細(xì)胞圓縮、聚團(tuán)并形成合胞體，見圖1。

圖1 RK-13 細(xì)胞CPE 觀察（× 100）Fig.1 CPE of RK-13 cells（× 100）

2.2 病毒純化及電鏡觀察 結(jié)果顯示，pH 7.0 的60%飽和硫酸銨溶液將1 L 病毒液濃縮至50 mL（PBS 4 ℃透析48 h），經(jīng)蔗糖密度梯度離心后，形成3 個清晰條帶，見圖2；電鏡下觀察可見球形、有囊膜，直徑約120 nm 的病毒粒子，見圖3。

2.3 病毒滴度 病毒原液（1 000 mL，病毒滴度1 ×108.23TCID50／ 0.1 mL）經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，滴度可達(dá)1×1010.02TCID50／0.1 mL，回收率為61.7%。

2.4 純化抗原的鑒定 SDS-PAGE 分析顯示，各樣品在相對分子質(zhì)量約65 000 處均可見雜蛋白條帶，可能為血清白蛋白，經(jīng)純化后，雜蛋白明顯減少；Western blot 分析顯示，濃縮、純化病毒液在相對分子質(zhì)量25 000 ～ 150 000 之間的蛋白條帶能被馬多抗血清特異性識別，具有較好的反應(yīng)原性。見圖4。

圖2 EHV-1 蔗糖密度梯度離心Fig.2 Sucrose density gradient centrifugation of EHV-1

圖3 EHV-1 的電鏡觀察（× 60 000）Fig.3 Electron microscopy of EHV-1（× 60 000）

圖4 純化抗原的SDS-PAGE（A）及Western blot 分析（B）Fig.4 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of purified antigen

2.5 馬體致病性 PBS 對照組馬匹體溫正常，無排毒現(xiàn)象。病毒經(jīng)呼吸道感染馬后，均出現(xiàn)EHV-1 原發(fā)性感染的臨床癥狀，包括發(fā)熱、食欲不振、漿液性鼻液和下頜淋巴結(jié)腫大；感染第2 天出現(xiàn)不同程度發(fā)熱，體溫超過39 ℃，發(fā)熱持續(xù)了3 ～ 7 d，1 號馬體溫最高可達(dá)40 ℃，2 號馬體溫可達(dá)39.2 ℃。見圖5。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，1 和2 號馬匹均出現(xiàn)排毒現(xiàn)象，見圖6。

圖5 病毒感染馬的體溫變化Fig.5 Body temperature of horses infected with EHV-1

圖6 病毒感染馬的呼吸道排毒情況Fig.6 Virus shedding in respiratory tract of infected horses

3 討 論

目前尚無治療EHV-1 的特效藥，常用商品化滅活疫苗及減毒活疫苗進(jìn)行預(yù)防，我國尚未研制出相關(guān)疫苗，預(yù)防用疫苗依賴于進(jìn)口。病毒純化是動物病毒學(xué)研究的重要前提，在病毒微觀結(jié)構(gòu)研究、致病性研究、診斷抗原制備、新疫苗研制及病毒基因組測序等領(lǐng)域，均需要制備高純度的病毒粒子［7-8］。皰疹病毒難以純化，在純化過程中易導(dǎo)致病毒感染性喪失或不能有效分離細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)，但隨著純化工藝的不斷改進(jìn)，病毒純化已成為可能。其中密度梯度離心純化病毒方法簡單，操作易于掌握，可獲得完整病毒顆粒并保持病毒的感染性，病毒層條帶清晰利于回收，該技術(shù)常用于病毒免疫原性分析及全基因組功能方面研究［9-12］。

本研究采用60%飽和硫酸銨沉淀法及蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化EHV-1 后，病毒滴度顯著上升，可達(dá)1010.02TCID50／0.1 mL，病毒得率為61.7%；透射電鏡觀察病毒相對完整，直徑在100 ～ 200 nm 之間；純化病毒經(jīng)SDS-PAGE 分析，可見雜蛋白明顯減少，Western blot 分析，顯示出較好的反應(yīng)原性；動物致病性試驗中，感染馬出現(xiàn)原發(fā)性感染的臨床癥狀，包括發(fā)熱、食欲不振、漿液性鼻液和下頜淋巴結(jié)病腫大；熒光定量PCR 結(jié)果顯示，感染馬可長期通過呼吸道排毒，與之前報道的攻毒試驗結(jié)果相符［13］。本文為進(jìn)一步研究EHV-1 的致病機理以及減毒、滅活疫苗的研發(fā)提供了參考。