過表達腦紅蛋白對大鼠脊髓損傷的神經(jīng)保護作用及其機制

王浩，張雄，唐寧曼，王曉林

1.四川省達州市中心醫(yī)院，四川 達州635000；2.重慶醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，重慶400016

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種具有很強破壞性的損傷方式，可導致傷者損傷下方的感覺和運動功能完全喪失。SCI 后，機體存在原發(fā)性和繼發(fā)性的損傷機制。原發(fā)性損傷是由于損傷直接導致脊髓水腫、白質(zhì)內(nèi)軸突纖維連續(xù)性中斷和神經(jīng)元立即死亡，從而導致難以逆轉(zhuǎn)和恢復的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。而繼發(fā)性損傷則是在原發(fā)性損傷后，脊髓經(jīng)歷了一系列的病理變化，如缺氧、活性氧生成、缺血、凋亡、自噬和炎癥等［1-2］，而這些病理改變是臨床治療干預脊髓損傷的潛在目標［3-4］。

腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）是一類廣泛分布于脊椎動物中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的新型攜氧球蛋白，其過表達可通過增強低氧感知或低氧反應來保護神經(jīng)元免受缺血缺氧的影響，還可通過清除NO 或調(diào)節(jié)活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的生成，在包括SCI 在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮很好的神經(jīng)保護作用［5-7］，但其機制尚不明確［8-9］。本實驗在SCI模型大鼠的脊髓損傷部位注射腺相關(guān)病毒攜帶的Ngb基因，觀察過表達Ngb 對SCI 大鼠神經(jīng)功能的影響，并探討其機制，為臨床治療SCI 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒 AAV-Ngb和對照AAV-Con 均由山東維真生物科技有限公司設(shè)計并構(gòu)建（將大鼠Ngb基因序列克隆入病毒載體，將攜帶Ngb的重組質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒等共轉(zhuǎn)染入HEK293 細胞，72 h 后收獲病毒顆粒）。

1.2 實驗動物 清潔級雄性成年（5 ～6 周齡）SD 大鼠90 只，體重150 ～200 g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（渝）2016-0001。所有大鼠均置于重慶醫(yī)科大學動物中心SPF 級代養(yǎng)室飼養(yǎng)，每籠4 只，溫度保持（24 ± 1）℃，12 h 光照晝夜循環(huán)，給予專用鼠糧和水，術(shù)前12 h 禁食，可飲水。

1.3 主要試劑及儀器 PI3K 抑制劑LY294002 購自美國Sigma 公司；凋亡原位檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；caspase-3 和caspase-9 酶活性檢測試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒及SDS-Page膠配置試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗鼠caspase-3、caspase-9、Akt 和p-Akt 抗體購自Santa Cruz 生物科技公司（上海浦東新區(qū)）；內(nèi)參抗體β-actin和HRP 標記的山羊抗兔IgG 購自北京博鰲森生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜和ECL 發(fā)光試劑盒購自美國Bio-rad 公司。

1.4 SC I大鼠模型的建立及分組處理 將90 只SD大鼠隨機分為5 組：假手術(shù)組、SCI 模型組（SCI）、陰性對照組（NC）、AAV-Ngb組（Ngb）和AAV-Ngb+LY249002 組（Ngb+LY），每組18 只。采用改良Allen′s法［10］制備SCI 大鼠模型：將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，取仰臥位固定于操作臺上，剃除毛發(fā)消毒后，于T10 棘突為中心作一長為3 cm 的切口，逐層暴露T10 背側(cè)面，并除去棘突和椎板。用改良Allen′s重物墜落裝置打擊大鼠T10 脊髓背側(cè)面，打擊成功后止血縫合傷口。術(shù)后3 d 內(nèi)行肌肉注射青霉素以防治感染，SCI 模型建立成功的標志為大鼠軀體顫動，雙下肢抽搐，出現(xiàn)遲緩性癱瘓和尾巴痙攣性擺動，脊髓撞擊處有出血水腫。假手術(shù)組大鼠僅暴露T10脊髓背側(cè)面，其余各組依次用微量注射器將生理鹽水、AAV-Con（1 滋g ／ 滋L）、AAV-Ngb（1 滋g ／ 滋L）溶液和AAV-Ngb（1 滋g ／ 滋L）+ LY294002 液（5 滋mol ／ L）注入損傷脊髓T10 所在節(jié)段的中點以及頭尾兩側(cè)，共18 滋L。

1.5 神經(jīng)功能評估 采用BBB（Basso Beattie Bresnahan）評分法［11］。術(shù)前2 d，將所有大鼠依次放入自制的泡沫盒中熟悉環(huán)境。每天3 次，注意觀察大鼠臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運動及其協(xié)調(diào)情況。建模成功后，于損傷后1、3、7、14、21、28 d，將各組所有大鼠放入泡沫盒中，記錄其后肢運動功能。無后肢運動為0 分，后肢運動正常為21 分，該過程由兩名不熟悉實驗方案的觀察者在每個時間點獨立觀察5 min，并記錄其分值。

1.6 細胞凋亡檢測 處死各組大鼠后，制備脊髓切片，按照凋亡原位檢測試劑盒說明書進行Tunel 染色：切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，用H2O2封閉30 min；0.15 mol ／ L PBS 振洗3 次，每次5 min，再用Proteinase K 進行細胞通透30 min；PBS 洗滌2次，用3%雙氧水封閉液，將切片置入封閉液中，室溫下放置10 min；PBS 沖洗后，用平衡液平衡10 min；加入Tunel 反應混合液于標本上，加蓋玻片，37 ℃反應1 h；加入2 × SSC 液終止反應后，PBS 洗滌3 次，行DAB 染色，蘇木素復染，中性樹膠封片觀察。細胞核染成棕褐色判為陽性細胞。

1.7 caspase-3、caspase-9 酶活性檢測 處死各組大鼠，迅速取出脊髓組織，加入蛋白裂解液，研磨后離心獲得上清液，移入已預冷的EP 管中，按試劑盒說明操作，立即測定caspase-3、caspase-9 酶活性。根據(jù)caspase-3 酶活性變化釋放的pNA 與caspase-3 的活性呈正比，將pNA 釋放的A405值作為caspase-3、caspase-9 酶活性值。

1.8 A kt、caspase-3 和caspase-9 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。稱取10 mg 脊髓組織，加入1 mL RIPA 裂解液（含0.01 mL PMSF），研磨后，4 830 ×g離心15 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度，變性后于-80 ℃冰箱保存。經(jīng)8% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，以5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h；加入兔抗鼠caspase-3、caspase-9、p-Akt、T-Akt 和β-actin 抗體（均用TBST 1∶200 稀釋），4 ℃冰箱中孵育過夜；TBST 沖洗后，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000 稀釋），室溫下孵育2 h；ECLipse 發(fā)光，運用凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并分析各目的蛋白與內(nèi)參βactin 光密度值的比值。試驗重復3 次，取平均值。

1.9 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α = 0.05，以P＜為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的BBB 評分 假手術(shù)組所有大鼠后肢的BBB 評分均為21 分，即滿分，提示其運動能力完全正常。而在SCI 術(shù)后1 d，其余4 組大鼠的BBB評分均處于極低水平，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（F=1.214，P=0.172）；術(shù)后3 d，這4 組大鼠的BBB評分均有所提高，差異無統(tǒng)計學意義（F=1.723，P=0.094）；術(shù)后7 d，Ngb 組大鼠的BBB 評分明顯高于SCI 和NC 組，且差異有統(tǒng)計學意義（F =3.175，P =0.035），隨著時間的推移，術(shù)后14、21 和28 d，BBB評分進一步升高（F =4.892 ～6.726，P =0.000 ～0.008）；Ngb + LY 組大鼠術(shù)后14、21、28 d 的BBB評分較Ngb 組顯著降低（F=3.210 ～4.196，P=0.017 ～0.037）。見圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)后不同時間的BBB 評分Fig.1 BBB scores of rats at various time points after SCI in various groups

2.2 各組大鼠脊髓組織中細胞的凋亡情況 假手術(shù)組大鼠脊髓組織中幾乎見不到凋亡細胞。SCI 和NC組凋亡細胞數(shù)量明顯多于假手術(shù)組，且隨著時間的推移，兩組凋亡細胞數(shù)量有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（F =2.238，P =0.075）；SCI 術(shù)后7 d，Ngb 組凋亡細胞數(shù)量較SCI 組明顯降低（F =3.251，P =0.041），術(shù)后28 d，達最低值（F=6.027，P=0.002）；Ngb + LY 組凋亡細胞數(shù)量較Ngb 組顯著增加（F =4.126，P =0.018）。見表1 和圖2。

表1 各組大鼠SCI 術(shù)后不同時間脊髓組織中的細胞凋亡數(shù)（±s，n = 3）Tab.1 Number of apoptotic cells in spinal cord tissue of rats in various groups at various time points after SCI（±s，n = 3）

表1 各組大鼠SCI 術(shù)后不同時間脊髓組織中的細胞凋亡數(shù)（±s，n = 3）Tab.1 Number of apoptotic cells in spinal cord tissue of rats in various groups at various time points after SCI（±s，n = 3）

注：a 表示與SCI 組比較，P ＜0.05；b 表示與Ngb + LY 組比較，P ＜0.05。

組別 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d假手術(shù) 2.37 ± 0.57 2.47 ± 0.31 2.18 ± 0.42 3.27 ± 0.49 2.98 ± 0.52 3.47 ± 0.29 SCI 48.34 ± 7.89 48.65 ± 4.57 46.39 ± 2.98 45.89 ± 8.71 45.34 ± 6.31 44.38 ± 5.23 NC 47.63 ± 6.52 47.25 ± 5.48 46.15 ± 8.45 45.78 ± 4.35 44.59 ± 6.14 44.23 ± 7.51 Ngb 46.19 ± 6.48 44.39 ± 6.19 36.78 ± 4.28a 30.63 ± 3.78a，b 25.65 ± 3.29a，b 18.72 ± 6.31a，b Ngb + LY 46.39 ± 2.69 45.87 ± 5.42 37.64 ± 4.23 34.91 ± 5.46 39.75 ± 3.64 40.15 ± 7.21

圖2 Tunel 染色觀察SCI 術(shù)后7 d 各組大鼠脊髓組織中細胞凋亡情況（× 100）Fig.2 Tunel staining of apoptotic cells in spinal cord of rats in various groups 7 d after SCI（× 100）

2.3 各組大鼠脊髓組織中caspase-3 和caspase-9 酶活性 假手術(shù)組大鼠脊髓組織中caspase-3 和caspase-9酶活性均很低；與假手術(shù)組比較，SCI 術(shù)后1 d，其余4 組caspase-3 和caspase-9 酶活性均顯著升高（F =22.831 ～35.674，P =0.000 ～0.004），但組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義（F =2.158 ～2.764，P =0.069 ～0.095）；術(shù)后3 d，各組caspase-3 和caspase-9 酶活性略降低，但差異無統(tǒng)計學意義（F=2.328 ～2.821，P =0.054 ～0.067）；術(shù)后7 d 開始，Ngb 組caspase-3和caspase-9 酶活性均顯著降低（F =3.514 ～4.386，P =0.012 ～0.038），至術(shù)后28 d，達最低值（F =6.538 ～8.751，P =0.000 ～0.002）；Ngb + LY 組caspase-3 和caspase-9 酶活性較Ngb 組顯著升高（F=3.452 ～4.389，P =0.011 ～0.024）。見圖3。

2.4 各組大鼠脊髓組織中A kt、caspase-3 和caspase-9蛋白的表達 與假手術(shù)組比較，SCI 和NC 組大鼠脊髓組織中p-Akt 蛋白的表達水平顯著下降（F =16.231 ～25.764，P =0.000 ～0.003），而與凋亡密切相關(guān)的caspase-3 和caspase-9 蛋白表達水平則明顯升高（F =19.472 ～29.324，P =0.000 ～0.002）；Ngb 組p-Akt 蛋白的表達顯著升高，而caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達顯著下降（F =5.784 ～8.951，P =0.002 ～0.008）；Ngb + LY 與Ngb 組比較，p-Akt蛋白的表達顯著下降（F=6.238 ～8.954，P=0.002 ～0.007），而caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達顯著升高（F =5.136 ～7.358，P =0.004 ～0.009）。見圖4 和圖5。

圖3 各組大鼠術(shù)后不同時間的caspase-3（A）和caspase-9（B）酶活性Fig.3 Activity of caspase-3（A）and caspase-9（B）of rats in various groups at various time points after SCI

圖4 Western blot 分析各組大鼠脊髓組織中T-Akt、p-Akt、caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達Fig.4 Western blotting of expressions of T-Akt，p-Akt，caspase-3 and caspase-9 in spinal cord tissues of rats in various groups

圖5 各 組大鼠脊 髓 組 織 中T-Akt、p-Akt、caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達Fig.5 Expressions of Akt，p-Akt，caspase-3 and caspase-9 in spinal cord tissue of rats in various groups

3 討 論

通常來說，脊髓受到原發(fā)性的機械損傷后，大量的神經(jīng)元變性、壞死，繼而導致神經(jīng)傳導中斷，使受損部位以下的運動、感覺功能部分或完全喪失。隨著時間的推移，繼發(fā)性損傷過程被激活，出現(xiàn)一系列的病理變化，進一步加重損傷。因此，繼發(fā)性損傷往往比原發(fā)性損傷更為嚴重。由于繼發(fā)性損傷是一個在細胞和分子水平上主動調(diào)節(jié)的過程，該過程可逆和可控［12］，為治療干預SCI 帶來了希望。

Ngb 是由德國生物學家BURMESTER 等［13］于2000 年發(fā)現(xiàn)的一種新型攜氧球蛋白，在神經(jīng)元內(nèi)表達豐富。在人體內(nèi)，Ngb 在腦內(nèi)的表達存在一個動態(tài)的變化過程，即隨著年齡的增加而呈遞減趨勢［14］。研究表明，Ngb 與氧有高度的親和力，能促進氧向線粒體擴散或直接介導氧在線粒體內(nèi)的傳遞，促進三磷酸腺苷的生成，繼而促進神經(jīng)元的物質(zhì)代謝［15］。以往更多的研究均集中于Ngb 在保護神經(jīng)元免受缺血缺氧造成的損傷中所起的重要作用，其機制也較明確［5-6］。新的研究也證實，過表達Ngb 對SCI 也有保護作用，其機制與抑制細胞凋亡、ROS 的產(chǎn)生、抗氧化等有關(guān)［8-9］，但深入的機制尚不明確。

本研究選取雄性SD 大鼠建模，是為了避免內(nèi)源性雌激素對實驗所造成的影響［16］；采用Allen′s 改良法建模，是由于該方法是一種經(jīng)典的SCI 建模方式，具有操作簡便、成功率高、成本低等特點。模型構(gòu)建成功后，采用常用于動物SCI 后運動功能狀態(tài)的BBB 系統(tǒng)進行評分，結(jié)果顯示，SCI 后1、3 d，與假手術(shù)組比較，其余4 組的評分均明顯處于很低水平；隨著時間的推移，BBB 評分均有所升高，SCI 和NC組輕微升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而Ngb組明顯升高，且隨著時間的推移，升高趨勢更明顯，提示Ngb 促進了SCI 后神經(jīng)功能的恢復。

眾所周知，凋亡是一種自然的生理過程，在維持細胞生長、促進脊髓發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。而細胞凋亡是繼發(fā)性SCI 的重要環(huán)節(jié)。因此，本實驗采用Tunel 染色法觀察了細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SCI 和NC 組凋亡細胞數(shù)明顯增多，而Ngb 組凋亡細胞數(shù)又顯著降低。細胞的凋亡經(jīng)歷了誘導、調(diào)控和效應3 個階段，而caspase 蛋白酶家族在該過程中起重要作用。caspase-9 是凋亡的啟動子，細胞受刺激后，凋亡的線粒體途徑被激活，線粒體釋放CytoC，在ATP／dATP 的參與下與Apaf-1結(jié)合，使其發(fā)生構(gòu)象進而寡聚化，與pro-caspase-9 之間相互作用，形成凋亡caspase-3，通過特異性裂解一套底物蛋白而使細胞發(fā)生凋亡。因此，caspase-3 和caspase-9 的活性及蛋白表達水平可直接反應SCI 部位細胞的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，在SCI 和NC 組中，與凋亡關(guān)系最為密切的caspase-3 和caspase-9的酶活性很高，蛋白表達水平也很高，均明顯高于假手術(shù)組；而過表達Ngb 后，caspase-3 和caspase-9 的酶活性及蛋白水平明顯降低。上述結(jié)果提示，過表達Ngb 能顯著抑制SCI 誘導的細胞的凋亡水平。

SCI 后，神經(jīng)元中許多信號通路可被迅速激活，如PI3K ／ Akt、ERK1 ／ 2、Nf-kappaB 等通路，它們在促凋亡和抗凋亡基因的表達中起重要作用。PI3K ／AkT 信號轉(zhuǎn)導通路是體內(nèi)重要的調(diào)控細胞存活的信號通路，其在細胞生長、發(fā)育、分化、存活和凋亡方面發(fā)揮重要作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)，應用Akt-siRNA 可阻斷Akt 的磷酸化，從而增強capase-9 的活性，進而促進肝癌細胞凋亡的發(fā)生［18］。LI 等［19］在對阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達Ngb 可通過激活PI3K ／Akt 信號通路，進而抑制下游靶基因caspase-3 和caspase-9 活性而抑制神經(jīng)元的凋亡，從而保護神經(jīng)元。本實驗發(fā)現(xiàn)，應用PI3K ／ Akt 抑制劑LY249002與Ngb 聯(lián)合作用后，與Ngb 組比較，BBB 評分又顯著降低，細胞的凋亡數(shù)也明顯升高，而caspase-3 和caspase-9 酶活性及蛋白表達水平也明顯升高，即LY249002 拮抗了Ngb 的保護作用。

綜上所述，過表達Ngb 對SCI 后有保護作用，能夠促進其運動功能的恢復，其機制與激活PI3K ／ Akt通路，進而抑制下游靶基因caspase 家族（caspase-3和caspase-9）的活性及蛋白表達水平，進一步抑制細胞的凋亡密切相關(guān)，豐富了Ngb 治療SCI 的抗凋亡作用及機制的理論基礎(chǔ)。