表達rhG H-Fc 融合蛋白的CH O 工程細胞的傳代穩(wěn)定性分析

許佳慧，俞露，薛毅勇，梁久佳，富銳麗，王瑩，李利，劉涵

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春130062

中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是目前重組蛋白生產(chǎn)中使用最廣泛的哺乳動物細胞［1-3］，自2016 年以來，約70%的重組蛋白以及幾乎所有FDA 批準的單克隆抗體均由CHO 細胞生產(chǎn)［4-5］。CHO 細胞具有許多優(yōu)點：首先，由于CHO 細胞可產(chǎn)生與人類相似的翻譯后修飾，因此其表達產(chǎn)物更有可能在人類體內(nèi)具有相容性和生物活性；其次，這些細胞不易被人類病毒感染，從而將用于商業(yè)生產(chǎn)的生物安全風(fēng)險降至最低；此外，最重要的是，這些細胞能夠相對容易地轉(zhuǎn)染重組DNA，并將其整合至基因組上（基因組的可塑性），且可快速適應(yīng)外界環(huán)境變化，使其非常適用于大規(guī)模的工業(yè)懸浮培養(yǎng)，并能夠獲得可觀的產(chǎn)量［4，6］。但與這種極高的基因組可塑性經(jīng)常并行的是細胞系的不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為在長期培養(yǎng)過程中細胞產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量的下降［7］?；诖?，2006 年發(fā)布的《重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則》要求，表達重組蛋白的細胞進行遺傳穩(wěn)定性分析，F(xiàn)DA 和ICH 也進行了相關(guān)規(guī)定。因此，對構(gòu)建的CHO 細胞進行傳代穩(wěn)定性分析，無論對于CHO 細胞系的開發(fā)，還是實際的藥品研發(fā)、生產(chǎn)，均十分必要。

本實驗對1 株表達重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rhGH）-Fc 融合蛋白的CHO 工程細胞進行傳代穩(wěn)定性分析，旨在確定其在長期培養(yǎng)過程中的生產(chǎn)穩(wěn)定代次，以指導(dǎo)后續(xù)研究和生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 細胞 表達rhGH-Fc 融合蛋白的CHO 細胞株由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司細胞因子室構(gòu)建并保存；CHO-K1 細胞由北京比洋生物技術(shù)有限公司惠贈。

1.2 主要試劑及儀器 Hyclone Actipro 和Cell Boost 7a ／ 7b 培養(yǎng)基購自美國GE 公司；臺盼藍購自碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人生長激素單克隆抗體由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司生物技術(shù)室制備并惠贈；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 和10-250 kDa 預(yù)染蛋白ladder 購自美國Thermo Fisher 公司；增強型DAB 顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；總RNA 提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；RTPCR 試劑盒、高保真DNA 聚合酶和DNA marker DL2000 購自寶生物工程（大連）有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；PVDF 膜購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；一次性細胞培養(yǎng)方瓶、培養(yǎng)搖瓶和2 mL 細胞凍存管購自美國Corning 公司；程序降溫盒購自美國Thermo 公司；Count Star 細胞計數(shù)儀購自上海艾力特生命科學(xué)公司；YSI2950 生化分析儀購自美國Xylem 公司；AKTA 液相色譜系統(tǒng)購自美國GE 公司；Protein A 色譜柱購自蘇州納微科技股份有限公司；1600 凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 傳代細胞的制備 復(fù)蘇1 支液氮凍存的表達rhGHFc 融合蛋白的35 代CHO 細胞株，按3 × 105個／ mL接種搖瓶，于搖床中培養(yǎng)，細胞密度大于3×106個／mL時，進行連續(xù)傳代，分別于傳至50、70、90 代時凍存細胞各5 支。

1.4 傳代細胞的培養(yǎng)及表達 復(fù)蘇35、50、70 和90 代細胞各3 支，按（2 ～4）× 105個／ mL 接種搖瓶，于37 ℃搖床中培養(yǎng)，細胞密度達（5 ～7）× 106個／ mL時，每天按一定比例補加Cell Boost 7a ／ 7b 補料培養(yǎng)基，細胞密度達（1.2 ～1.5）× 107個／ mL 時，將溫度降為33 ℃，培養(yǎng)至第10 天終止表達。收集細胞培養(yǎng)上清液，離心后，收獲上清。

1.5 不同代次C H O 細胞生長曲線及生長動力學(xué)比較 細胞接種后，每隔24 h 計數(shù)，直至培養(yǎng)結(jié)束。相同代次3 瓶取平均值，繪制細胞生長曲線。按下式計算細胞在對數(shù)生長期的比生長速率（μ）［8］。

式中X 為活細胞密度（106個／ mL），t 為培養(yǎng)時間（h），n 和n-1 代表2 個連續(xù)的取樣計數(shù)時間點。

1.6 不同代次C H O 細胞rhG H-Fc 融合蛋白表達量的測定 采用Protein A 親和層析柱純化重組rhGHFc 融合蛋白［9］，UV 法測定純化后蛋白的濃度。

1.7 不同代次C H O 細胞rhG H-Fc 融合蛋白的鑒定 采用Western blot 法。經(jīng)8%還原型SDS-PAGE分離純化蛋白后，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，以10% BSA室溫封閉1 h；TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入鼠抗人GH 單抗（1∶800 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3 次，每次10 min，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000 稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗滌3 次，每次10 min，DAB 顯色，水終止反應(yīng)。

1.8 rhG H-Fc 融合蛋白基因序列穩(wěn)定性的檢測 用試劑盒提取33 ℃降溫表達后24 h 的CHO 細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用高保真DNA 聚合酶擴增cDNA，反應(yīng)條件為98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，共30 個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，膠回收位于約1 300 bp 處的條帶，送吉林省庫美生物技術(shù)有限公司測序。使用DNAMAN 8.0 軟件對比測序結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同代次C H O 細胞生長曲線及生長動力學(xué)比較

2.1.1 生長曲線 不同代次的CHO 細胞均經(jīng)24 h潛伏期后，進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)溫度降至33 ℃，細胞生長轉(zhuǎn)入平臺期并維持至第（8 ± 1）天，在第（7 ±1）天達到最大密度，隨后細胞密度開始下降。90 與35 代細胞曲線存在一定差異，70、50 與35 代細胞曲線重合度較好。見圖1。

圖1 不同代次重組CHO 細胞生長曲線Fig.1 Growth curve of recombinant CHO cells of various passages

2.1.2 生長動力學(xué) 50、70、90 代細胞在對數(shù)生長期的比生長速率與35 代相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但90 代與35 代相比的P值已明顯降低，見表1。

表1 不同代次CHO 細胞在對數(shù)生長期比生長速率的比較Tab.1 Specific growth rates in logarithmic phase of recombinant CHO cells of various passages

2.2 不同代次C H O 細胞rhG H-Fc 融合蛋白表達量的比較 50 和70 代細胞rhGH-Fc 融合蛋白的表達量［（239.683±8.728）和（239.245±8.649）mg／L］與35 代［（237.619 ± 15.087）mg ／ L］相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為-0.205 和-0.162，P分別為0.879 和0.848）；90 代細胞rhGH-Fc 融合蛋白的表達量［（137.383 ± 5.093）mg ／ L］與35 代相比明顯下降（t= 16.157，P＜0.001），下降比例達42%。

2.3 不同代次C H O 細胞rhG H-Fc 融合蛋白的W estern blot鑒定 不同代次的CHO 細胞表達產(chǎn)物均可與鼠抗人生長激素單抗發(fā)生特異性結(jié)合，于相對分子質(zhì)量約53 000 處可見特異性抗體結(jié)合條帶，見圖2。

圖2 Western blot 分析不同代次CHO 細胞rhGH-Fc 融合蛋白的表達Fig.2 Western blotting of expression of rhGH-Fc fusion protein expressed in CHO cells of various passages

2.4 不同代次C H O 細胞rhG H-Fc 融合蛋白基因序列的穩(wěn)定性 不同代次細胞cDNA 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分析，在約1 300 bp 處均可見特異性擴增條帶，大小與理論值相符見圖3。經(jīng)測序比對，不同代次細胞cDNA 序列保持一致，均與理論序列相符。

圖3 不同代次CHO 細胞rhGH-Fc 基因的PCR 鑒定Fig.3 Identification of rhGH-Fc gene in CHO cells of various passages by PCR

3 討 論

本研究證明，表達rhGH-Fc 融合蛋白的CHO 工程細胞傳代至第70 代之前，均可保持其穩(wěn)定性，即其生產(chǎn)穩(wěn)定代次（限傳代次）為70 代。限傳代次的確定，對后續(xù)研究和大規(guī)模生產(chǎn)均具有指導(dǎo)意義：首先，基本上可確定生產(chǎn)規(guī)模，如本文確定的70 代，意味著其生產(chǎn)規(guī)?？沙^5 000 L，完全可滿足該制品預(yù)期的生產(chǎn)規(guī)模；其次，生產(chǎn)規(guī)模在早期即可確定，后期可減少為達到無意義的培養(yǎng)規(guī)模放大所投入的人力、物力成本。因此，正如各國藥典所規(guī)定的一樣，在藥品研發(fā)階段必須增強對表達重組蛋白的CHO細胞系傳代穩(wěn)定性分析的重視。按照QbD 原則，最好應(yīng)在細胞構(gòu)建階段就加入這部分考察。

目前，已有多篇文獻報道了引起CHO 細胞不穩(wěn)定性的機制：如CHO 細胞核型漂移［10］、基因丟失［2］、基因沉默［11-12］，以及在長期培養(yǎng)過程中細胞固有的突變傾向［13］等?？傮w上，引起CHO 細胞不穩(wěn)定的原因是多層次（包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組），不均一的。但無論內(nèi)在機制如何，不穩(wěn)定的主要表現(xiàn)仍是表達產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。本實驗也印證了這一點，在考查的3 方面，細胞表達量變化最明顯，90代時下降比例已超過40%，但目的基因序列方面仍保持穩(wěn)定，提示產(chǎn)生這種變化的原因不在于基因的突變，推測其主要原因為傳代過程中的拷貝數(shù)丟失或基因沉默，因為對于表達重組蛋白的CHO 宿主細胞來說，為擺脫重組蛋白大量表達的負擔(dān)，其最有效的方法就是直接減少外源基因的拷貝［14］，或使外源基因沉默。比生長速率方面也印證了這一點：90 代細胞的比生長速率相對于35 代增大，差異雖無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但P值與50、70 代相比已明顯下降，對應(yīng)的在生長曲線上也可明顯看出90 代在對數(shù)生長期斜率明顯大于其他代次，提示隨著細胞在長期培養(yǎng)過程中穩(wěn)定性降低，其擴增速度逐漸加快，而重組蛋白的產(chǎn)量卻逐漸降低。

綜上所述，本實驗主要從細胞生長動力學(xué)、重組蛋白的產(chǎn)量以及重組基因序列3 方面考察表達rhGH-Fc 融合蛋白的CHO 工程細胞在長期培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性，確定其生產(chǎn)穩(wěn)定代次為70 代，可滿足5 000 L 以上的生產(chǎn)規(guī)模。下一步將對90 代以后不穩(wěn)定的原因進行驗證。