1 例犢牛腹瀉大腸埃希菌的分離鑒定及毒力基因檢測(cè)

史量全，趙志炎，鄭佳瑋，王永強(qiáng)，李偲，劉鍇，馬德慧

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼028000

犢牛腹瀉常發(fā)生在1 月齡內(nèi)，犢牛出生后2 ～3 d 即可感染發(fā)病，由于新生犢牛自身免疫力較低，易感染環(huán)境中的致病菌，另外，氣候的突變與牛舍的環(huán)境較差等外界因素，也會(huì)誘導(dǎo)該病的發(fā)生，對(duì)犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育具有很大影響［1］。據(jù)報(bào)道，犢牛腹瀉發(fā)病率可達(dá)60%，死亡率高達(dá)30%，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖企業(yè)的發(fā)展［2］。

引起犢牛腹瀉的細(xì)菌種類不同，大腸埃希菌（E.coli）是主要的病原菌之一。該菌為條件致病菌，廣泛分布于自然界中，一年四季均可發(fā)病，患病犢牛多處于1 月齡內(nèi)，臨床上以腹瀉為主，糞便稀薄且為灰白色，精神沉郁，日漸消瘦，最終出現(xiàn)死亡。畜舍衛(wèi)生條件差是導(dǎo)致新生犢牛感染大腸埃希菌的重要原因。

本研究對(duì)分離自病死犢牛的1 株疑似大腸埃希菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和毒力基因檢測(cè)，以期為犢牛腹瀉病原的研究及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料 內(nèi)蒙古通遼市開魯縣某牛場(chǎng)犢牛肝臟、脾臟、腎臟及十二指腸等臟器。

1.2 主要試劑及儀器 血液瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、2YT 斜面培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；ID 肉湯鑒定培養(yǎng)管購(gòu)自廣州西馬克生物科技有限公司；通用引物購(gòu)自北京生工生物工程股份有限公司；ddH2O 和DL2000 marker購(gòu)自日本TaKaRa 公司；PCR Master Mix2 × Tap 和DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片和大腸埃希菌全套O 抗原診斷血清購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司；全自動(dòng)微生物生化鑒定儀購(gòu)自廣州西馬克生物科技有限公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；C600 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自北京深藍(lán)云生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明小白鼠4 只，雄性，6 周齡，體重16 ～ 20 g，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：201800020383。

1.4 病料采集及鏡檢 無菌操作，分別剪開犢牛心臟、肝臟、脾臟、腎臟表面，取內(nèi)層組織，與十二指腸內(nèi)容物分別進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢。

1.5 病原菌的分離純化及培養(yǎng) 將肝臟、脾臟、腎臟及十二指腸有明顯病變的部位涂布于血液瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，挑取分離病原菌單菌落，平板劃線于血液瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察。

1.6 病牛的組織病理學(xué)變化檢測(cè) 取病死犢牛的心臟、肝臟組織，固定后制片，HE 染色后鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn) 將肝臟、脾臟、腎臟及十二指腸血液瓊脂培養(yǎng)基中的單菌落分別接入LB 培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床過夜純化培養(yǎng)。細(xì)菌計(jì)數(shù)后，在菌液中加入LB 培養(yǎng)基至細(xì)菌數(shù)量為1.0×109個(gè)／mL，將4 管菌液混勻，每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.5 mL 菌液，每管菌液注射2 只，以2 只注射0.5 mL 生理鹽水的小鼠作為對(duì)照組，每隔4 h 觀察1 次小鼠生命體征并記錄。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，并對(duì)內(nèi)臟觸片進(jìn)行鏡檢。

1.8 生化試驗(yàn) 將血液瓊脂培養(yǎng)基中的單菌落逐漸接入ID 肉湯鑒定培養(yǎng)管，至菌懸液為0.6 麥?zhǔn)蠁挝?，注入生化鑒定板孔中，置全自動(dòng)微生物生化鑒定儀中，記錄結(jié)果。

1.9 藥敏試驗(yàn) 采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將菌體以平板劃線的方式涂布于血液瓊脂培養(yǎng)基中，使用無菌鑷子均勻貼入藥敏紙片，為了藥敏片與培養(yǎng)基緊密接觸，可適當(dāng)用無菌鑷子進(jìn)行按壓。設(shè)立1 個(gè)平行組，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)24 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.10 16S rR N A 的PC R 鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 用DNA 提取試劑盒提取菌液DNA，以其為模板，加入通用引物（16S RNA 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S RNA 1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增片段大小1 445 bp）［3］進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：ddH2O 7.5 μL，DNA 模板3 μL，上下游引物各1 μL，MIX 12.5 μL，共25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果命名為S，并在GenBank 進(jìn)行Blast。選取同源性相近的幾條序列，用DANMAN V6 軟件進(jìn)行編輯，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.11 分離菌株的毒力基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)大腸埃希菌毒力基因的18 對(duì)引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用PCR 法檢測(cè)分離菌株的毒力基因攜帶情況。

1.12 O 抗原的鑒定 將血液瓊脂培養(yǎng)基中的單菌落接入斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，用1 mL 生理鹽水沖掉斜面培養(yǎng)基的菌落，高壓蒸汽滅菌后，將菌液等量依次與大腸埃希菌全套O 抗原診斷血清在載玻片上混合，觀察凝集現(xiàn)象。

表1 大腸埃希菌毒力基因擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for amplificaton of virulence genes of E.coli

2 結(jié) 果

2.1 病牛的初步檢測(cè) 對(duì)病死犢牛進(jìn)行剖檢，主要為腸炎變化，腸道出血，其中十二指腸呈現(xiàn)較嚴(yán)重的狀態(tài)，腸內(nèi)容物成糊狀，顏色乳白且部分粘在黏膜上，腸系淋巴結(jié)輕微腫脹；胃黏膜也腫脹并伴有輕微出血；肝臟出血較嚴(yán)重；腎臟表面有出血點(diǎn)；心臟表面有針尖樣出血點(diǎn)。見圖1。

圖1 病死犢牛十二指腸及腸系膜（A）、肝臟（B）、腎臟（C）、心臟（D）的病變觀察Fig.1 Pathological changes in（A），liver（B），kidney（C）and heart（D）of calf which died from diarrhea

2.2 分離菌株的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征 在血液瓊脂培養(yǎng)基中可見溶血現(xiàn)象，在麥康凱培養(yǎng)基上可見粉紅色單菌落生長(zhǎng)，見圖2。顯微鏡下均可見革蘭陰性桿菌，菌體短小，兩端鈍圓，有些單獨(dú)出現(xiàn)，多數(shù)成對(duì)出現(xiàn)，見圖3。分離菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征均與大腸埃希菌相符。

圖2 分離菌株的菌落生長(zhǎng)特性Fig.2 Colony growth characteristics of isolates

圖3 分離菌株的鏡檢圖片（× 1 000）Fig.3 Microscopy of isolates（× 1 000）

2.3 病牛的組織病理學(xué)變化 HE 染色觀察顯示，心肌纖維壞死、斷裂，有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；竇狀隙顯著擴(kuò)張，肝細(xì)胞彌漫性壞死，有漿液性物質(zhì)和少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖4。

圖4 感染大腸埃希菌犢牛的組織病理學(xué)變化（HE 染色）Fig.4 Histopathological changes in calf infected with E.coli（HE staining）

2.4 動(dòng)物試驗(yàn) 接種混合菌液后4 h，小鼠精神沉郁，12 h 死亡，其余小鼠均未出現(xiàn)任何反應(yīng)。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠胃黏膜輕微腫脹充血，肝臟和腎臟有出血點(diǎn)。對(duì)小鼠內(nèi)臟觸片鏡檢，可見革蘭陰性桿菌，與最初鏡檢觀察的細(xì)菌相同，因此確定該菌為導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要致病菌。

2.5 生化試驗(yàn) 全自動(dòng)微生物生化鑒定儀鑒定結(jié)果為大腸埃希菌，見表2，置信度為99%。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，致病菌株對(duì)慶大霉素、新霉素、卡那霉素、氧氟沙星高度敏感，對(duì)紅霉素、丁胺卡那敏感，對(duì)諾氟沙星、青霉素不敏感，見表3。

2.7 16SrR N A 的PC R 鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 500 bp 的特異片段，大小與預(yù)期相符，見圖5。經(jīng)測(cè)序，PCR產(chǎn)物大小為1 445 bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，測(cè)序序列S 與人糞便分離大腸埃希菌（KJ803896.1）的親源性達(dá)99%，但與其他患者、動(dòng)物體內(nèi)或自然界分離的大腸埃希菌存在較大差異，見圖6。

2.8 分離菌株的毒力基因檢測(cè) PCR 結(jié)果顯示，該株致病性大腸埃希菌攜帶16 種不同毒力基因，見圖7。

2.9 O 抗原的鑒定 菌液分別與21 種多價(jià)血清混合，多價(jià)血清14 出現(xiàn)凝集反應(yīng)，再將多價(jià)對(duì)應(yīng)單價(jià)血清與菌液分別混合，最終O79 單因子血清凝集試驗(yàn)呈陽(yáng)性，且無自凝現(xiàn)象，表明該菌株O 抗原血清型為O79。

表2 致病菌生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Biochemical test of pathogenic isolate

表3 致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Drug sensitivity test of pathogenic isolate

圖5 16S rRNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoretic profile of PCR product of 16S rRNA

圖6 大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of E.coli

圖7 致病性大腸埃希菌毒力基因的PCR 鑒定Fig.7 Identification of virulence genes of pathogenic E.coli by PCR

3 討 論

隨著養(yǎng)牛數(shù)量的增加，患有腹瀉的犢牛數(shù)量也逐年增長(zhǎng)，直接影響?zhàn)B牛行業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益。犢牛腹瀉中，由大腸埃希菌感染而引起的腹瀉是發(fā)病的主要原因之一。雖然我國(guó)對(duì)于大腸埃希菌的研究有一定進(jìn)展，但對(duì)由大腸埃希菌引起的犢牛腹瀉仍無法進(jìn)行有效的預(yù)防［4］。雖然國(guó)內(nèi)已有用于預(yù)防幼畜腹瀉的大腸埃希菌基因工程疫苗及多價(jià)滅活疫苗，但由于不同地區(qū)犢牛大腸埃希菌分離株的血清型及所攜帶的菌毛抗原、產(chǎn)腸毒素特性不同，疫苗的免疫效果差異較大，給犢牛大腸埃希菌性腹瀉的免疫防治帶來一定難度［5］。

本研究通過對(duì)從腹瀉死亡犢牛體內(nèi)分離出的疑似犢牛感染發(fā)病致病菌進(jìn)行臨床癥狀、病理變化分析、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化、生化試驗(yàn)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、O-抗原鑒定、16S rRNA PCR 鑒定以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析等一系列鑒定，證明引起犢牛腹瀉的致病菌為大腸埃希菌O79 型。使用全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定較傳統(tǒng)方法耗時(shí)少，準(zhǔn)確率高，可減少人為的主觀判斷。

牛源大腸埃希菌病是由多個(gè)毒力因子共同導(dǎo)致的，其毒力因子主要有黏附素、內(nèi)毒素、外毒素、志賀毒素、溶血素等，毒素的形成與毒力基因密切相關(guān)。本研究從分離株大腸埃希菌基因組中共檢測(cè)到iroN、ompT、hlyF、Iss-F1、iutA、phoA、luxS、pfs、fimC、Stx2、tsh、iucD、cvac、Iss-F2、ompA、hlyE16 種毒力基因，其中fimC基因參與菌毛的生物合成，在細(xì)菌的黏附、入侵、繁殖過程中發(fā)揮重要作用；ompT基因參與外膜蛋白的合成，增強(qiáng)菌株的殺菌作用和禽致病性大腸埃希菌（avian pathogenicEscherichia coli，APEC）的毒力［6］；tsh 基因編碼產(chǎn)物溶血素能增強(qiáng)疫苗的免疫效果；Iss-F1和Iss-F2基因在大腸埃希菌的補(bǔ)體活性中具有重要作用［7］。該致病菌中檢測(cè)到的16種毒力基因可能與其高致病性密切相關(guān)。

該株大腸埃希菌對(duì)慶大霉素、新霉素、卡那霉素、氧氟沙星等藥物高度敏感，對(duì)紅霉素、丁胺卡那敏感，諾氟沙星、青霉素等藥物較不敏感，該結(jié)果為此次犢牛腹瀉的治療提供了參考，同時(shí)也反應(yīng)出養(yǎng)牛業(yè)對(duì)于抗生素類藥物的不合理使用而引發(fā)牛體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性的問題［8］。目前，世界各國(guó)均將抗生素作為治療動(dòng)物細(xì)菌病的首選藥物，抗生素的亂用和濫用使得病原體不斷產(chǎn)生耐藥性。大腸埃希菌的耐藥性已成為世界范圍內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)，國(guó)內(nèi)關(guān)于大腸埃希菌耐藥性和耐藥基因的報(bào)道也逐漸增多。動(dòng)物使用抗生素后，在機(jī)體內(nèi)和環(huán)境中均有一定程度的殘留，殘留的藥物可隨著食物不斷在食物鏈中積累［9］，最終進(jìn)入人體，這一系列問題應(yīng)該引起高度重視。

目前采用中藥療法治療犢牛腹瀉臨床達(dá)到了預(yù)期效果［10］，但目前引起犢牛腹瀉的大腸埃希菌血清型較多，對(duì)犢牛腹瀉的防治有很大障礙［11-12］。大腸埃希菌屬于條件致病菌，在畜牧業(yè)的日常預(yù)防中不能忽視，需要相關(guān)工作人員引起重視。

本實(shí)驗(yàn)分離的致病菌株有成為人畜共患病病原的潛在可能，對(duì)該地區(qū)預(yù)防大腸埃希菌病防控體系的建立提供了有效參考。