氫氧化鋁佐劑對(duì)百日咳菌毛抗原的吸附特性分析

楊柏峰，朱德武，陳雯，周以斯，王麗，龔貝哲，方習(xí)靜，霍夢(mèng)穎，胡源，楊曉明

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)菌類疫苗研究室，湖北 武漢430207；2.國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430207；3.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京100029

博德特百日咳桿菌（Bordetella pertussis）是引起嬰兒呼吸道疾病的一種主要烈性傳染病病原體，世界范圍內(nèi)許多國(guó)家因接種百日咳疫苗使該疾病的死亡率和發(fā)病率大大降低。近幾年，即使在疫苗接種率達(dá)到85%以上的一些發(fā)達(dá)國(guó)家，也出現(xiàn)了因百日咳死亡和發(fā)病率升高的現(xiàn)象，尤其是在年齡較大的兒童和青少年中病例仍在增加，并作為攜帶者向未接種疫苗的嬰幼兒傳播，這間接證明了當(dāng)前主流疫苗的一些不足，以及需要在成年人群中接種百日咳疫苗的必要性［1-2］。

目前已上市的百日咳疫苗抗原主要是百日咳毒素（pertussis toxin，PT）和百日咳絲狀血凝素（filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA），部分含有百日咳黏附素（pertactin，PRN）和百日咳菌毛（fimbriae，F(xiàn)im）蛋白。Fim 是一類具有黏附功能的細(xì)胞外膜蛋白，有Fim2 和Fim3 兩種血清型，早期抗-Fim 抗體被作為保護(hù)性的標(biāo)志物之一［3］。近期瑞士和德國(guó)的百日咳疫苗臨床試驗(yàn)顯示，通過ELISA 檢測(cè)抗Fim 抗體水平在5 ～ 8 EU ／ mL 以上，表面其與感染百日咳風(fēng)險(xiǎn)的降低呈一定的相關(guān)性［4］，因此，在無細(xì)胞組分百日咳疫苗中增加Fim 抗原具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

為了增強(qiáng)疫苗的免疫效果，通用方法是在疫苗配方中加入鋁佐劑，目前已上市的百日咳疫苗均用含鋁佐劑，如氫氧化鋁［Al（OH）3］、磷酸鋁吸附百日咳抗原。經(jīng)大量研究證實(shí)，設(shè)計(jì)含鋁佐劑疫苗需考慮的一個(gè)最關(guān)鍵的問題就是抗原與鋁佐劑的吸附方式和吸附率。通常認(rèn)為，靜電吸引、疏水吸引和配基交換是鋁佐劑吸附抗原的主要方式，其中靜電吸引最為常見；因蛋白質(zhì)易發(fā)生折疊，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化，減少了蛋白疏水區(qū)域?qū)λh(huán)境的暴露，因此限制了由疏水作用而產(chǎn)生的吸附［5］；配基交換是Al（OH）3表面的羥基被抗原表面的磷酸基團(tuán)所取代，這種吸附方式作用力最強(qiáng)。大多數(shù)疫苗的免疫效果與佐劑對(duì)抗原的吸附率密切相關(guān)，而疫苗中磷酸根和NaCl濃度等因素會(huì)影響佐劑對(duì)抗原的吸附強(qiáng)度。湛琳麗等［6］和GUPTA 等［7］利用小鼠模型試驗(yàn)均證實(shí)，影響抗原免疫原性的最重要因素之一是佐劑對(duì)抗原的吸附率，吸附率越高，免疫效果越好，反之，免疫效果越差。田俊楠等［8］在鋁佐劑重組戊型肝炎疫苗中發(fā)現(xiàn)，隨著疫苗中磷酸根含量的增加，鋁佐劑對(duì)抗原的最大吸附量逐漸降低，而免疫小鼠后誘導(dǎo)的抗體滴度反而逐漸升高，表明在一定范圍內(nèi)增加磷酸根離子的濃度雖然在一定范圍內(nèi)可降低鋁佐劑對(duì)抗原的吸附強(qiáng)度，但疫苗誘導(dǎo)的血清抗體滴度卻呈上升趨勢(shì)?；谏鲜隼碚?，若在百日咳疫苗中添加新抗原，需首先研究佐劑對(duì)新抗原的吸附方式、吸附能力以及影響吸附率的因素。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Al（OH）3佐劑吸附Fim 抗原的吸附特性、吸附能力進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)吸附過程中的磷鋁比進(jìn)行篩選，探討Al（OH）3佐劑吸附Fim 抗原后的免疫原性與疫苗中PO43-濃度的關(guān)系，分析抗體滴度與不同磷鋁比條件下吸附率的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 抗原及佐劑 Fim 抗原經(jīng)層析純化得到，純度達(dá)95%，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)菌類疫苗研究室提供；Al（OH）3佐劑Alhydrogel?購(gòu)自丹麥Brenntag Biosector 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)CD1 小鼠（ICR），雌性，體重20 ～ 24 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0099，飼養(yǎng)于武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要試劑及儀器 WHO 鼠源抗百日咳血清標(biāo)準(zhǔn)品（97／642）購(gòu)自英國(guó)生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定研究所（NIBSC）；抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體購(gòu)自美國(guó)SeraCare Life Sciences 公司；Lowry 法2（通則0731 第二法福林酚法）測(cè)定蛋白相關(guān)試劑、ELISA 法相關(guān)試劑等均為國(guó)產(chǎn)分析純；酶標(biāo)儀（SpectraMax?ABSPlus）購(gòu)自谷分子儀器公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550）購(gòu)自日本島津公司；Zeta 電位及粒度分析儀（ZS90）購(gòu)自英國(guó)馬爾文儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)板沖洗機(jī)購(gòu)自北京楠華科技開發(fā)有限公司。

1.4 Fim 抗原和A l（O H）3佐劑等電點(diǎn)（pI）檢測(cè) 將百日咳Fim 抗原原液分別調(diào)節(jié)至不同pH 值，測(cè)定不同pH 值下的Zeta 電位（mV），共檢測(cè)3 次，取平均值，以pH 值為橫坐標(biāo)，測(cè)得的Zeta 電位為縱坐標(biāo)繪制折線圖，折線圖與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)即為蛋白的pI［9］；Al（OH）3佐劑pI 檢測(cè)方法與Fim 抗原相同。

1.5 A l（O H）3佐劑與Fim 抗原吸附方式的確定

1.5.1 Fim 抗原吸附特性檢測(cè) 以濃度0.06 mol／L NaCl 為例，主要操作步驟如下：在不同離心管中加入等體積Al（OH）3（10 mg Al ／ mL）溶液，再加入不同體積的Fim 抗原液，制成Fim-Al（OH）3復(fù)合物，用0.35% NaCl 溶液定容至相同體積，每份離心管中Al（OH）3佐劑最終鋁濃度相同，為0.03 mg Al ／ mL，每份復(fù)合物中Fim 抗原終質(zhì)量濃度依次增加，為18.6、37.3、56、74.7、93.3 和140 μg ／ mL，最后調(diào)pH 至8.0，室溫（25 ℃）吸附1 h，每隔15 min 輕輕振蕩，使其充分吸附。吸附好的樣品5 000 ×g離心10 min，取上清，采用Lowry 法2 測(cè)定蛋白含量，并按下式計(jì)算吸附量。以上清蛋白濃度（μg ／ mL）為橫坐標(biāo)，吸附量（μg ／ mg Al）為縱坐標(biāo)繪制抗原的吸附等溫線，同時(shí)以上清蛋白含量為自變量，上清蛋白含量／ 吸附量為因變量擬合為直線，通過朗格繆爾（Langmuir）方程計(jì)算Al（OH）3對(duì)Fim 抗原的吸附能力和吸附系數(shù)，直線斜率（k）的倒數(shù)（1 ／k）為抗原的吸附能力（μg ／ mg Al），k與截距（b）的比值（k／b）為吸附系數(shù)（mL ／ μg）［10］。

1.5.2 不同離子強(qiáng)度對(duì)Fim 抗原吸附能力影響的檢測(cè) 樣品制備過程同1.5.1 項(xiàng)，不同之處是用2 mol／L NaCl 溶液定容，各組NaCl 溶液終濃度分別為0.25、0.50 和0.75 mol ／ L，F(xiàn)im 抗原終濃度和鋁濃度與1.5.1 項(xiàng)一致。對(duì)不同鹽濃度下的吸附量進(jìn)行Langmuir 方程擬合，繪制吸附等溫線和擬合線性。

1.5.3 不同磷鋁摩爾比（P ／ Al）對(duì)Fim 抗原吸附率影響的檢測(cè)

1.5.3.1 不同P／Al 條件下Al（OH）3佐劑帶電檢測(cè)在若干離心管中加入等量Al（OH）3佐劑，用200 mmol／L磷酸鹽（pH 6.5）調(diào)節(jié)P／Al 至0、0.135、0.27、0.405、0.54、0.675 和0.81，再用醋酸或氫氧化鈉調(diào)pH 至7.5，測(cè)定不同P ／ Al 下的Zeta 電位，判斷加入磷酸鹽后Al（OH）3佐劑的帶電情況。

1.5.3.2 不同P／Al 條件下Fim 吸附率檢測(cè) 在若干離心管中加入等量Al（OH）3佐劑，采用先加磷酸鹽后加抗原進(jìn)行吸附，使用0.1mg Al 吸附100 μg Fim 抗原，將樣品分為7 組，每組P ／ Al 分別為0、0.135、0.27、0.405、0.54、0.675 和0.81，使用醋酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至7.5，吸附48 h 后，按照《中國(guó)藥典》三部（2015 版）“吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗”中3.1.2 檢測(cè)吸附率：將樣品5 000 ×g離心10 min，吸取上清，同時(shí)取樣品適當(dāng)稀釋，采用Lowry 法2 測(cè)定蛋白含量，并按下式計(jì)算吸附率（P）。

式中Cs 為供試品上清液蛋白含量，Ct 為供試品蛋白含量。

1.6 復(fù)合物的配制 根據(jù)加入磷酸鹽濃度和佐劑吸附先后順序的不同依次標(biāo)記為Y1 ～Y9：Y1 為不加磷酸鹽，Y2 ～Y5 為先吸附后加磷酸鹽組（P ／ Al 分別為0.135、0.27、0.54、0.81），Y6 ～Y9 為先加磷酸鹽后吸附組（P／Al 分別為0.135、0.27、0.54、0.81），所有復(fù)合物配制完成后48 h 檢測(cè)吸附率，剩余樣品置于4 ℃冰箱保存待用。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為10 組：樣品組（Y1 ～Y9）和陰性對(duì)照組（NS），每組10 只。樣品組經(jīng)腹腔注射5 倍稀釋的樣品，陰性對(duì)照組注射無菌生理鹽水，0.5 mL ／ 只，免疫后第28 天經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采全血，37 ℃孵育2 h 后，5 000 ×g離心7 min，分離血清，-20 ℃冰箱保存待用。

1.8 小鼠血清IgG 的檢測(cè) 采用間接ELISA 法。用5 μg ／ mL Fim 抗原包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜；分別加入2 倍系列稀釋的小鼠血清和百日咳血清標(biāo)準(zhǔn)品（97 ／642），37 ℃預(yù)孵1 h 后，按照常規(guī)ELISA 步驟操作。用OPD 顯色，2 mol ／ L 濃硫酸終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品（97 ／ 642）的數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，利用雙平行線分析方法對(duì)小鼠血清樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算小鼠血清中Fim 抗原特異性抗體IgG 的含量，以幾何平均濃度（GMC）表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件對(duì)小鼠血清中抗Fim 抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Fim 抗原與A l（O H）3佐劑pI分析 在pH 為3.48、5.01、5.69、6.19、7.12、7.77 的條件下，測(cè)得的Fim抗原Zeta 電位為6.29、1.12、-0.318、-2.24、-3.13和-5.33；在pH 為7.55、8.54、9.24、9.44、9.84、10.3 的條件下，測(cè)得的Al（OH）3佐劑Zeta 電位為15.47、5.67、1.86、0.61、-5.93 和-11.31。Fim 抗原的pI 在pH 5.5 左右，pH 大于5.5 時(shí)，F(xiàn)im 帶負(fù)電荷；Al（OH）3佐劑pI 在pH 9.4 附近，pH 小于9.4時(shí)，Al（OH）3佐劑帶正電荷。見圖1。

2.2 A l（O H）3佐劑與Fim 抗原吸附方式的確定

2.2.1 Fim 吸附能力與吸附系數(shù) 在pH 8.0，25 ℃條件下，隨著Fim 抗原的逐漸增加，吸附量也逐漸升高，最后到達(dá)1 個(gè)平穩(wěn)期，見圖2。擬合線性圖見圖3，擬合方程為y= 0.000 340 7x+ 0.000 545 5，確定系數(shù)R2= 0.992 390 6，達(dá)0.99 以上，表明回歸直線對(duì)觀測(cè)值的擬合程度好。在pH 8.0 時(shí)，k為0.000 340 7，b為0.000 545 5，F(xiàn)im 的吸附能力為2 935 μg ／ mg Al（1 ／ 0.000 340 7），吸附系數(shù)為0.62 5 mL ／ μg（0.000 340 7 ／ 0.000 545 5），即每100 μg Fim 僅需0.1 mg Al（OH）3即能完全吸附。

圖1 Fim 抗原（A）和Al（OH）3 佐劑（B）的pI 測(cè)定Fig.1 Determination of pIs of Fim antigen（A）and aluminum hydroxide adjuvant（B）

圖3 在pH 8.0，25 ℃下Al（OH）3 佐劑吸附Fim 抗原的Langmuir 線性擬合（0.06 mol ／ L）Fig.3 Linear Langmuir plot for adsorption of Fim antigen onto aluminum hydroxide adjuvant at pH 8.0，25 ℃（0.06 mol／L）

2.2.2 不同離子強(qiáng)度對(duì)Fim 抗原吸附能力的影響NaCl 濃度在0.06、0.25、0.50 和0.75 mol ／ L 條件下，曲線均為典型的Langmuir 吸附等溫線，即隨著抗原濃度的增加，吸附量逐漸上升，最后達(dá)到平穩(wěn)期，見圖4。經(jīng)Langmuir 線性方程擬合后，4 個(gè)線性方程的R2均在0.90 以上，見圖5，表明線性擬合良好。隨著鹽濃度的增加，Al（OH）3對(duì)Fim 抗原的吸附率基本保持平穩(wěn)，見表1，表明離子強(qiáng)度對(duì)Al（OH）3吸附Fim 抗原的影響較小，Al（OH）3與Fim 抗原的吸附方式除了靜電作用，還存在其他方式。

2.2.3 不同P／Al 對(duì)Fim 抗原吸附率的影響 當(dāng)P／Al為0 時(shí)，Al（OH）3的Zeta 電位為正數(shù)，而加入少量磷酸鹽后，Al（OH）3的Zeta 電位均為負(fù)值，與抗原攜帶的電荷為同性（均帶負(fù)電）；在所有P ／ Al 條件下，Al（OH）3對(duì)Fim 抗原的吸附率均＞90%。見表2。

圖4 不同鹽濃度下Fim 抗原的吸附等溫線Fig.4 Langmuir adsorption isotherm of Fim antigen at various sodium chloride concentrations

圖5 不同鹽濃度下Al（OH）3 吸附Fim 抗原的Langmuir線性擬合Fig.5 Linear Langmuir plot for adsorption of Fim antigen onto aluminum hydroxide adjuvant at various sodium chloride concentrations

表1 pH 8.0，25 ℃條件下不同離子強(qiáng)度對(duì)Fim 抗原吸附能力的影響Tab.1 Effect of ionic strength on adsorption capacity of Fim antigen to aluminum hydroxide adjuvant at pH 8.0，25 ℃

表2 不同P ／ Al 下Al（OH）3 的Zeta 電位和Fim 抗原吸附率Tab.2 Zeta potential of aluminum hydroxide adjuvant and adsorption rate of Fim antigen at various P ／ Al ratios

2.3 不同吸附順序和P／A l條件下配制的復(fù)合物的吸附率 所有條件下，Al（OH）3對(duì)Fim 抗原的吸附率均保持在90%以上。其中采用先吸附后加磷酸鹽順序，吸附率隨著P ／ Al 濃度的增加呈下降趨勢(shì)（Y1 ～Y5 組的吸附率分別為96.5%、94.8%、92.9%、91.8%和91.3%）；采用先加磷酸鹽后吸附方式，吸附率下降趨勢(shì)基本保持一致（Y6 ～Y9 組的吸附率分別為93.5%、93.3%、93.6%和92.7%）。

2.4 小鼠血清中Fim 抗體水平 在吸附復(fù)合物中加入磷酸鹽后，除了Y5 組，其他各組抗-Fim 抗體滴度均有所升高，且隨著磷酸根濃度的增大，小鼠抗體水平保持在穩(wěn)定狀態(tài)。采用先加磷酸鹽后吸附方式制備的復(fù)合物（Y6 ～Y9 組），其抗體水平均略高于先吸附后加磷酸鹽組（Y2 ～Y5），其中Y6 組顯著高于其他組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.003 和0.043）。見圖6。

圖6 不同復(fù)合物免疫小鼠血清抗體滴度（x ± SD，n =8）Fig.6 Serum antibody titers of mice immunized with various complexes（x ± SD，n =8）

3 討 論

在含鋁佐劑（氫氧化鋁，磷酸鋁）疫苗的研發(fā)和檢測(cè)中，吸附率是檢驗(yàn)疫苗質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)?？乖c鋁佐劑的吸附方式主要有靜電吸引、疏水作用和配基交換，前者在高離子強(qiáng)度下會(huì)降低吸附率，甚至?xí)?，而配基交換作用力很強(qiáng)，在抗原與佐劑帶相同電荷時(shí)也會(huì)發(fā)生吸附，受離子強(qiáng)度的影響小。有文獻(xiàn)報(bào)道，吸附率的高低反過來又影響疫苗的效力，因此，為了保證鋁佐劑對(duì)目標(biāo)抗原的吸附率，可通過以下兩種方式來改變抗原的吸附率：一是對(duì)Al（OH）3進(jìn)行磷酸化，該方法可顯著降低Al（OH）3對(duì)目標(biāo)蛋白的吸附能力；二是對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行磷酸化，提高抗原與佐劑的吸附能力，如溶菌酶［11］和阿巴伏單抗（Abagovomab）［12］。Al（OH）3對(duì)抗原的吸附能力明顯優(yōu)于磷酸鋁，這種高吸附能力可能與其晶體形態(tài)、為蛋白質(zhì)吸附提供均勻的表面結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)與鋁之間較強(qiáng)的靜電吸引有關(guān)。Al（OH）3對(duì)目標(biāo)抗原的吸附能力隨著抗原分子量的增加呈線性下降趨勢(shì)，其中一個(gè)原因可能是Al（OH）3的初級(jí)顆粒在溶液中形成聚集體，而較小分子量的蛋白質(zhì)更易擴(kuò)散至聚集體顆粒的縫隙中，從而形成了更高的吸附能力。

大量對(duì)鋁佐劑吸附蛋白質(zhì)的研究表明，通過靜電／或疏水吸引力吸附蛋白質(zhì)的吸附系數(shù)非常低，如溶菌酶（0.002 mL ／ μg）、肌紅蛋白（0.002 mL ／ μg）［13］和牛血清白蛋白（0.012 mL ／ μg）［14］；通過配基交換方式的吸附系數(shù)通常較高，如乙型肝炎表面抗原（6.0 mL ／ μg）［15］、卵清蛋白（0.086 mL ／ μg）［16］。由于本公司已注冊(cè)申報(bào)的“吸附無細(xì)胞百白破疫苗（組分）（DTacP）”使用Al（OH）3作為佐劑，考慮到與在研產(chǎn)品的連續(xù)性，本研究選擇Al（OH）3作為佐劑來探討其對(duì)Fim 抗原的吸附特性。

本研究檢測(cè)的Fim 等電點(diǎn)約在5.5 左右，符合ZHANG 等［17］在pH 6.0 時(shí)利用電鏡觀察到Fim 蛋白形成縱向聚集菌毛束的現(xiàn)象。通過比較不同NaCl濃度對(duì)Al（OH）3吸附Fim 抗原的能力，探討了Fim抗原的吸附機(jī)理。研究檢測(cè)Fim 抗原和Al（OH）3佐劑的等電點(diǎn)分別為5.5 和9.4，在pH 8.0 時(shí)，由于Fim 抗原帶負(fù)電，Al（OH）3佐劑帶正電荷，靜電吸引在其吸附中發(fā)揮一定作用。在pH 8.0，25 ℃單層吸附條件下所測(cè)得的吸附能力為2 935 μg ／ mg Al（0.06 mol／L），在0.75 mol／L NaCl 條件下，Al（OH）3對(duì)Fim 抗原的吸附能力為2 828 μg ／ mg Al，與低離子強(qiáng)度下的吸附能力無顯著差別，表明Al（OH）3吸附Fim 抗原的作用力除了靜電吸引，可能還存在其他作用力。在Al（OH）3佐劑中加入不同磷酸鹽后，pH 7.5 測(cè)得磷酸化的Al（OH）3全部帶負(fù)電，與Fim抗原在此pH 條件下所帶電荷相同，但吸附率仍很高（90%以上），證明Fim 抗原與Al（OH）3佐劑的吸附作用除了靜電吸引，還有配基交換。不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的吸附能力存在一定的不同，應(yīng)予以接受，因各實(shí)驗(yàn)室使用的氫氧化鋁的質(zhì)量屬性（如晶體形狀和比表面積）可能存在差異，從而影響其吸附容量。

當(dāng)抗原與氫氧化鋁佐劑以配基交換方式吸附時(shí)，會(huì)因結(jié)合過于緊密而不易被抗原呈遞細(xì)胞（antigenpresenting cells，APC）攝取，出現(xiàn)疫苗誘導(dǎo)的抗體水平與吸附強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象?？紤]到Fim 與Al（OH）3佐劑的吸附除了靜電吸引外，還存在配基交換，本研究選擇在吸附抗原前通過加入磷酸鹽的方式來降低對(duì)Fim 抗原的吸附強(qiáng)度。通過小鼠血清中Fim 抗體滴度結(jié)果推測(cè)，先加入磷酸根離子可能通過改變鋁佐劑pI 而降低了Fim 抗原的吸附度，從而在一定程度上提高了抗原在免疫部位的瞬時(shí)濃度，更易被佐劑刺激活化的DC 識(shí)別，增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的提呈，從而引發(fā)更高水平的體液免疫應(yīng)答。上述結(jié)果表明，在設(shè)計(jì)更好效力的蛋白抗原疫苗配方時(shí)，了解影響目標(biāo)蛋白吸附的因素（磷酸鹽、賦型劑和NaCl 等）至關(guān)重要［18-19］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Al（OH）3吸附Fim 抗原主要存在靜電吸引和配基交換兩種作用力，后者的特點(diǎn)是吸附系數(shù)高，在動(dòng)物組織液中較穩(wěn)定，因此，可通過改變疫苗中磷酸根濃度來改變Al（OH）3佐劑對(duì)Fim 抗原的吸附率，進(jìn)而改善疫苗的免疫效力，為組分百日咳疫苗中增加Fim 抗原提供了數(shù)據(jù)支持。