CoCl2脅迫下青稞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆與表達(dá)分析

喬 楓 張 麗 耿貴工 陳 志 曾 陽 謝惠春

(1.青海師范大學(xué) 青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；2.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016)

青稞(Hordeumvulgarevar nudum)是青藏高原地區(qū)種植的一種重要農(nóng)作物，可以作為西藏自治區(qū)和青海省農(nóng)牧民的主食。與其他植物相比青稞抗逆能力較強(qiáng)，如抗旱、抗鹽堿、抗冷、抗寒和抗病等[1-3]。青稞基因組中蘊(yùn)藏著大量的抗逆基因，其獨(dú)特的遺傳基礎(chǔ)、生理功能和次生代謝產(chǎn)物逐漸成為學(xué)者研究極端逆境的首選植物或農(nóng)作物材料[1-3]。青稞的抗逆作用是受到多方面調(diào)控的，在逆境下可以通過生理代謝調(diào)節(jié)，如滲透調(diào)節(jié)、生長發(fā)育調(diào)節(jié)，來抵抗不良環(huán)境。也可以通過基因表達(dá)調(diào)節(jié)，如通過轉(zhuǎn)錄因子、抗逆基因的誘導(dǎo)表達(dá)對逆境作出響應(yīng)。前人已從植物生理生化和分子生物學(xué)方面探討青稞抗逆境機(jī)制[4-6]。本研究探索在鈷脅迫下青稞幼苗相關(guān)抗逆基因的表達(dá)變化，為青稞的抗重金屬機(jī)制提供線索和科學(xué)依據(jù)。

鈷易被植物根系吸收，能夠在植物的不同組織中如根、莖中積累，影響植物的生長發(fā)育，超過一定濃度后，鈷會(huì)抑制植物的生長甚至引起植物死亡[7]。我國大部分地區(qū)的土壤鈷含量為5～40 mg/kg，鈷含量平均背景值為11.6 mg/kg[8]。當(dāng)植物體內(nèi)的Co2+過高時(shí)，嚴(yán)重?fù)p傷植物細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和代謝酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽合成酶(GSH)等活性，植物會(huì)因毒害而死亡[9-10]。小麥遭受Co2+脅迫后，施用生物炭可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，可以最大限度地減少Co2+誘導(dǎo)的氧化損傷[11]。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)及microRNA測序研究鈷脅迫下垂柳的基因表達(dá)和生理生化指標(biāo)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 100 μmol/L 的鈷脅迫植株的葉片枯黃、根系生長受阻、POD和SOD活性升高，過氧化氫酶(CAT)活性降低；轉(zhuǎn)錄組序列分析發(fā)現(xiàn)鈷脅迫的植物根部有1 165 個(gè)差異基因和62個(gè)差異表達(dá)microRNA，地上部分組織中有836個(gè)差異基因和80個(gè)差異表達(dá)microRNA[12]。植物如何降低或減弱Co2+的毒害作用，是農(nóng)作物抗逆生理研究的熱點(diǎn)之一。目前，青稞幼苗響應(yīng)鈷脅迫分子機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究設(shè)置不同濃度Co2+處理，分析青稞‘昆侖15號(hào)’幼苗中抗逆相關(guān)的過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽合成酶(GSH)、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和超氧化物歧化酶(SOD)的基因表達(dá)差異，旨在闡明青稞植株抗氧化酶基因?qū)o2+脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制，以期為青稞的抗Co2+栽培和育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試青稞品種為‘昆侖15號(hào)’，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物所提供。

挑選無病蟲害的種子，先用水沖洗3次，再用2%的次氯酸鈉消毒3 min，后用去離子水洗2～3次。在直徑為20 cm的培養(yǎng)皿中鋪放2層濾紙，將滅過菌的青稞種子均勻地分散在培養(yǎng)皿的濾紙上，每個(gè)培養(yǎng)皿放50粒種子，置于光照培養(yǎng)箱中，溫度為28 ℃，每天定時(shí)定量用去離子水處理，保持一定的濕度。持續(xù)處理8 d，待青稞幼苗長出2片子葉，選取長勢一致的幼苗用于氯化鈷溶液處理。

將氯化鈷(分析純)配置成30、70、100、150、200和250 mg/L的6個(gè)Co2+處理濃度，用6種處理液對青稞幼苗繼續(xù)處理培養(yǎng)，對照用去離子水處理，每天定時(shí)定量處理。持續(xù)處理7 d，取樣用于分析幼苗相關(guān)逆境基因的表達(dá)變化。

1.2 青稞總RNA的提取及cDNA的合成

青稞幼苗葉片總RNA的提取選用Tiangen生化公司(北京)公司的植物總RNA提取試劑盒，cDNA的第一鏈的合成選用TaKaRa公司的PrimeScriptTM1st strand cDNA synthesis，瓊脂糖PCR產(chǎn)物的測序選用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pGEM-T easy(美國Promega公司) 及測序、引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。在線Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列，見表1。

1.3 序列的生物信息學(xué)分析

采用 DNAstar 軟件拼接基因測序結(jié)果，得到青稞PAL基因的全長cDNA序列。序列Blast相似性比對在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上分析，ORF 的查找和核苷酸的翻譯在軟件 ORF Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 上進(jìn)行，PAL基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)等在ExPASy(http:∥www.expasy.org)上分析，多種植物PAL的氨基酸序列的多重比對由Mega 3.1軟件Clustal X (1.83)完成，系統(tǒng)發(fā)育樹采用最小進(jìn)化法(Minimum Evolution)構(gòu)建。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 引物設(shè)計(jì)

選用28SrRNA作為參比基因，同時(shí)設(shè)置滅菌超純水為陰性對照。根據(jù)NCBI網(wǎng)站里大麥(Hordeumvulgare)的超氧化物歧化酶基因(SOD)、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)、苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、過氧化物酶基因(POD)、谷胱甘肽合成酶基因(GSH)、28SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)引物在Primer 3.0完成，合成引物由上海桑尼生物科技有限公司完成，引物序列見表1。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法采用 SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司)試劑盒。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性 40 s；95 ℃ 變性 10 s，62～64 ℃延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)，熒光定量 PCR 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)反應(yīng)的融解曲線、擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物定量?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量通過2-ΔΔCt方法計(jì)算[13]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Excel 2016處理，在α=0.05水平上分析差異顯著性，作圖選用Sigmal Plot 14.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞PAL基因的克隆

采用電子同源克隆法，以青稞幼苗葉片RNA為模板，使用不同引物組合擴(kuò)增青稞PAL基因序列，并且在NCBI網(wǎng)站比對分析，結(jié)果顯示青稞測序結(jié)果與大麥PAL基因序列有較高的相似性。其中經(jīng)PALF1/PALR1引物組合擴(kuò)增、測序青稞PAL基因片段長度為1 200 bp，經(jīng)PALF2/PALR2擴(kuò)增的產(chǎn)物測序?yàn)?00 bp，經(jīng)PALF2/PALR3擴(kuò)增的產(chǎn)物測序?yàn)?30 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。將獲得的3個(gè)片段用DNAstar軟件拼接成一個(gè)連續(xù)的序列。在此序列上設(shè)計(jì)引物組合PALF3/PALR4擴(kuò)增全長序列后，經(jīng)測序獲得 2 142 bp 的序列(圖1)。

(a)RNA提取結(jié)果;(b)PALF1/PALR1結(jié)果; (c)PALF2/PALR2結(jié)果; (d)PALF2/PALR3結(jié)果;(e)PALF3/PALR4結(jié)果. M，DL 2 000 Marker

2.2 青稞PAL基因生物信息學(xué)分析

青稞PAL基因cDNA序列為2 142 bp，其堿基序列相對應(yīng)的編碼氨基酸有713個(gè)。將青稞PAL的cDNA序列，命名為HvPAL基因(Genbank No. MK695675)。將青稞PAL氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域，表明HvPAL的第195～211(GTITASGDLVPLSYIA)的氨基酸是苯丙氨酸/組氨酸解氨酶的保守結(jié)構(gòu)域，位于苯丙氨酸/組氨酸解氨酶的活性中心，見圖2。青稞PAL氨基酸序列同時(shí)有保守的催化激活位點(diǎn)(第433位-N、第434位-G、第476位-H和第483～487位的HNQDV序列)，脫氨基位點(diǎn)(第426位-L、第427位-V和第469位-L)，這些保守的激活位點(diǎn)與脫氨基位點(diǎn)與擬南芥和煙草的PAL一致。經(jīng)POSORT和Motif Scan軟件分析，青稞PAL氨基酸的N-端無蛋白信號(hào)肽定位序列，推測是可溶性蛋白，在C-端序列有2個(gè)雙亮氨酸基元(LL)，分別在第563～564位和第698～699位。

黃底方框中為苯丙氨酸/組氨酸解氨酶的保守結(jié)構(gòu)域

2.3 青稞PAL編碼蛋白與其他植物同源性比較

由圖3可知，青稞與大麥、小麥和水稻等的PAL氨基酸序列相似性為90%。

對青稞PAL氨基酸序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其三級(jí)空間結(jié)構(gòu)中α-螺旋占93.25%；無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量較少，見圖4。

2.4 PAL氨基酸構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖5可知，本研究中的青稞PAL氨基酸序列聚在禾本科分支，與植物傳統(tǒng)的分類結(jié)果一致。

2.5 青稞基因的表達(dá)

2.5.1青稞抗逆相關(guān)基因的表達(dá)變化

由圖6(a) 可知，青稞幼苗隨Co2+濃度增加其POD基因的表達(dá)升高，與對照相比，在200和250 mg/L Co2+處理下，POD基因表達(dá)分別是對照的15.1和13.2倍(P<0.05)，在 200 mg/L Co2+濃度時(shí)POD基因表達(dá)量最大，均達(dá)到顯著水平；其他Co2+處理POD基因表達(dá)增加但沒有達(dá)到顯著水平。

30～150 mg/L Co2+處理下，青稞PAL基因表達(dá)呈逐漸增加趨勢(圖6(b))，在150 mg/L Co2+濃度時(shí)PAL基因表達(dá)是對照的42倍(P<0.05)，其他濃度下，PAL基因的表達(dá)量較對照沒有顯著差異，見圖6(b)。

30～150 mg/L Co2+濃度下(圖6(c))，青稞幼苗中GSH基因表達(dá)呈逐漸增加趨勢；100～150 mg/L Co2+處理濃度時(shí)，GSH基因表達(dá)量較對照顯著增加(P<0.05)；150 mg/L的Co2+濃度下基因表達(dá)為最高水平。其余濃度處理下，GSH基因相對表達(dá)量未達(dá)到顯著水平。

青稞葉片P5CS基因表達(dá)量隨著30～200 mg/L Co2+濃度增加呈逐漸升高趨勢(圖6(d))，其中100～200 mg/L Co2+濃度下P5CS基因表達(dá)是對照的13～27倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，150 mg/L Co2+濃度下達(dá)到最大值；其余濃度處理下，P5CS基因相對表達(dá)量未達(dá)到顯著水平。

在30～150 mg/L的Co2+處理，SOD表達(dá)量逐步升高，在70 mg/L Co2+濃度下達(dá)到最大值，是對照的9.2倍(P<0.05)。其他Co2+濃度處理下，青稞葉片中SOD表達(dá)量與對照差異不顯著，見圖6(e)。

玫紅色代表氨基酸相同, 深綠色代表有2種或以上氨基酸相同。方框內(nèi)為PAL/HIS的保守結(jié)構(gòu)域。

藍(lán)色，α-螺旋；紅色，無規(guī)則卷曲。Blue，α-helix; Red，Randon coil.

2.5.2基因表達(dá)量的相關(guān)性

由表2可知，青稞幼苗在不同Co2+濃度處理下，不同基因表達(dá)量之間的相關(guān)系數(shù)(R2)不同。在0.05水平上相關(guān)系數(shù)R2=0.754，在0.01水平上R2=0.874。PAL與GSH基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(R2=0.850)。GSH與P5CS(R2=0.594)、POD與P5CS(R2=0.542)、GSH與SOD(R2=0.616)均呈正相關(guān)關(guān)系，但未達(dá)到顯著水平。由低到高Co2+濃度處理，青稞幼苗SOD、P5CS、PAL、POD、GSH基因表達(dá)也依次增強(qiáng)，共同作用以抵御和適應(yīng)Co2+逆境脅迫。

圖5 PAL氨基酸分子系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙酸合成途徑中的第一個(gè)酶，也是其代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，植物PAL受干旱、低溫、紫外線和病原物等不同因素的影響而誘導(dǎo)基因表達(dá)增加[14-15]。PAL活性增加可使植物抵抗不良環(huán)境或病原菌侵染的能力提高。通?？梢园阎参锏腜AL活性作為誘導(dǎo)抗性的一個(gè)參考指標(biāo)[16-18]。本研究克隆了青稞HvPAL基因，發(fā)現(xiàn)該基因的氨基酸序列含有苯丙氨酸解氨酶、組氨酸裂解酶和苯丙氨酸-組氨酸裂解酶3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。青稞PAL與大麥、小麥等的氨基酸序列相似性達(dá)90%，氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，青稞與小麥、大麥、水稻和玉米等聚為禾本科分支，這與已有研究結(jié)果一致[19]。本研究青稞幼苗在0～150 mg/L Co2+處理下，PAL基因表達(dá)逐漸增加，在150 mg/L Co2+處理時(shí)達(dá)到最大值。綜上，逆境誘導(dǎo)青稞PAL基因的表達(dá)來響應(yīng)和抵抗Co2+的脅迫，這與絲瓜響應(yīng)逆境的PAL基因表達(dá)的變化結(jié)果一致[20]。

SOD是一類重要的抗氧化酶，能夠?qū)⒊趸镒杂苫D(zhuǎn)化為過氧化氫和分子氧，是抗氧化防御的第一道防線[21]。超氧化物歧化酶基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上調(diào)控，在發(fā)育和應(yīng)答生物或非生物脅迫中起保護(hù)植物的作用[22]。在10～40 ℃，3個(gè)落葉松超氧化物歧化酶基因(LkSOD2、LkSOD4和LkSOD6)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中，在鹽脅迫下均表現(xiàn)出較高的發(fā)芽率和較長的根長[22]。LkSOD5基因可恢復(fù)擬南芥atfsd2-2突變體的淺綠色和矮化表型[22]。本研究中在30～150 mg/L的Co2+處理，SOD表達(dá)量升高，植物通過提高SOD酶的表達(dá)量來清除超氧化物自由基，降低活性氧對青稞幼苗的傷害。

小寫字母表示在0.05水平的差異。

表2 鈷脅迫下青稞關(guān)鍵酶基因相對表達(dá)量間的相關(guān)分析

在30～150 mg/L Co2+濃度處理下，與對照組相比，青稞SOD、POD、P5CS、GSH和PAL基因的相對表達(dá)量均表現(xiàn)為增加，但是這些抗逆基因表達(dá)的響應(yīng)時(shí)間順序不同。在200和250 mg/L Co2+處理下，P5CS和POD基因的相對表達(dá)量增加。結(jié)果顯示，Co2+脅迫下青稞幼苗中多種抗氧化酶表達(dá)量升高，共同提高植物抵御逆境脅迫的能力。

Co2+脅迫下青稞葉片響應(yīng)重金屬脅迫的相關(guān)基因之間也存在著普遍的相關(guān)關(guān)系。PAL與GSH基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.850，達(dá)到顯著正相關(guān)關(guān)系。PAL與P5CS、POD與P5CS、GSH與SOD、GSH與P5CS基因的相關(guān)系數(shù)分別為0.632、0.542、0.616、0.594，均為正相關(guān)關(guān)系。SOD、P5CS、PAL、POD和GSH基因的最大表達(dá)量隨Co2+處理濃度的增加而依次增加，這些基因通過相互協(xié)調(diào)表達(dá)以便提高青稞幼苗對環(huán)境脅迫的響應(yīng)能力，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證基因表達(dá)與逆境生理指標(biāo)的關(guān)系。