離子色譜-脈沖安培檢測法測定洋常春藤游離糖成分含量

史萬忠，欒紹齋，倪力軍

（1. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203； 2. 中國人民解放軍71239 部隊93 分隊，遼寧 營口115002； 3. 華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

常春藤為五加科常綠藥用和觀賞植物，《歐洲藥典》將洋常春藤Hedera helix L. 收錄為藥用植物［1］。洋常春藤提取物作為一種傳統(tǒng)的祛痰藥物，其提取溶劑一般為30% ～70%乙醇，常用劑型有片劑、膠囊、泡騰片、口服液、糖漿劑，已在歐洲多個國家獲批上市［2］。洋常春藤中主要藥用生物活性化合物為三萜皂苷，以及其他化合物如黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油、維生素、糖類等。目前，對洋常春藤中三萜皂苷、黃酮苷類、苯丙素類化學成分的研究較多，但尚無研究糖類成分的報道［3-7］。離子色譜法利用被測物質(zhì)的離子性進行分離和檢測，能有效分析所有游離糖成分，檢測速度快，無需衍生化。陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法分離能力強，靈敏度高，在糖及相關化合物的分析中有獨特優(yōu)勢［8-12］，本研究中采用此方法測定不同產(chǎn)地洋常春藤游離糖的含量，并優(yōu)化離子色譜條件，為后續(xù)藥用部位和藥用成分的研究提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ThermofisherICS-6000 型離子色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），配置有脈沖安培檢測器（工作電極為金電極）；ML104/02 型電子分析天平（精度為0.1 mg），XSE105DU 型電子天平（精度為0.01 mg），均購于梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司；DS-3510 DTH 型超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司，功率為180 W，頻率為40 kHz）；有機相針式濾器（上海安譜科學儀器有限公司）；FW177 型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；UPK-I-10T 型去離子水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

D-葡萄糖醛酸（批號為140648-201804，純度為99.8% ），D-核糖（批號為140668-201302，純度為99.6% ），海藻糖（批號為190073-201501，純度為99.7%），D-無水葡萄糖（批號為110833-201707，純度為99.9%），D-果糖（批號為111504-201703，純度為99.8%），阿拉伯糖（批號為111506-200202，純度為99.5% ），蔗糖（批號為111507-201704，純度為100.0% ），乳糖（批號為100058-201605，純度為94.8% ），半乳糖（批號為100226-201506，純度為100.0%），D-木糖（批號為111508-201605，純度為99.9%），D-半乳糖醛酸（批號為111646-201702，純度為95.1%），鼠李糖（批號為111683-201502，純度為98.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；On Guard RP 前處理柱（上海安譜實驗科技股份有限公司）；氫氧化鈉、醋酸鈉均為優(yōu)級純（德國Merck 公司）；試驗用水為自制去離子水。試驗中所用11 批次洋常春藤藥材分別采集于山東、上海、廣東、江蘇。經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所陳士林教授鑒定為正品。采集藥材的信息見表1。

表1 洋常春藤藥材信息Tab.1 Information of Hedera helix

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:ThermoDionexCarboPacPA1 分析柱（250mm×4 mm），Thermo DionexCarboPac PA1 保護柱（50 mm ×4 mm）；檢測器:四電位脈沖安培檢測器，AS -AP 自動進樣器；流動相:超純水（A）-50 mmol/ L NaOH 和1 mol/L NaAc 溶液（B）-100 mmol/L NaOH 溶液（C），梯度洗脫程序見表2；柱溫:25 ℃；流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL。

表2 離子色譜流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution program of ion chromatography（%）

2.2 溶液制備

混合對照品溶液:取海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸對照品適量，精密稱定，加超純水制成每1 mL 含海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸分別為1.237，1.159，1.012，1.707，1.285，1.397，1.225，1.267，1.270，1.430，1.201，1.202 mg 的對照品貯備液。取對照品貯備液適量，加超純水制成每1 mL 含海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖，D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸分別為49.48，46.36，40.48，68.28，51.40，55.88，49.00，50.68，50.80，57.20，48.04，48.08 μg 的混合對照品溶液，搖勻，采用0.22 μm水系過濾膜濾過，即得。

供試品溶液:取樣品粉末（過40 目篩）0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加去離子水50 mL，加熱回流3 h，減壓回收溶劑，殘渣用去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加去離子水至刻度，搖勻，采用0.22 μm 水系過濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗:不加洋常春藤樣品，直接加入去離子水，按供試品溶液制備方法制備空白溶液，按2.1 項下色譜條件進樣檢測。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)干擾洋常春藤游離糖成分的色譜峰。離子色譜圖見圖1。

1. 海藻糖 2. 鼠李糖 3. 阿拉伯糖 4. 半乳糖 5. D-葡萄糖 6. D-木糖 7. D-果糖 8. D-核糖 9. 蔗糖10. 乳糖 11. D-半乳糖醛酸 12. D-葡萄糖醛酸A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 空白溶液圖1 專屬性試驗離子色譜圖1.trehalose 2. rhamnose 3.arabinose 4. galactose 5. D-glucose 6. D-xylose 7. D-fructose 8. D-ribose 9.sucrose 10.lactose 11. D-galacturonic acid 12. D-glucuronic acidA.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank solutionFig.1 Ion chromatograms for specificity test

線性關系考察:取2.2 項下混合對照品溶液，依次稀釋0，2，2.5，5，10 倍，配制成系列質(zhì)量濃度梯度的混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件，精密吸取10 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積積分值（Y）為縱坐標、對照品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果見表3。

表3 各被測成分線性關系考察結(jié)果（n ＝5）Tab.3 The linear relationship of each component（n ＝5）

精密度試驗:精密吸取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定。結(jié)果海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸峰面積的RSD 分別為2.66% ，2.81% ，2.12% ，1.98% ，2.98% ，2.87% ，2.58% ，2.68% ，2.61%，2.86%，1.64%，1.36%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取樣品（批號JS160731-1 葉），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進樣6 次。結(jié)果阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖、蔗 糖 峰 面 積 的 RSD 分 別 為2.12% ，2.98% ，2.58%，2.61%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取同一批（批號JS160731-1 葉）樣品6 份，每份0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入對照品貯備液（阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖和蔗糖對照品含量分別為0.607 2，1.285 0，1.102 5，3.175 0 mg）適量，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入離子色譜儀，按2.1 項下色譜條件進樣測定，用外標法計算回收率。結(jié)果阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖的平均回收率分別為99.21%，97.84% ，97.32% ，96.20% ，RSD 分 別 為3.46% ，3.85% ，2.94%，3.28%（n ＝6）。

表4 11 批次洋常春藤藥材中4 種糖類成分含量測定結(jié)果（mg/g，n ＝2）Tab.4 Results of content determination of four sugars in 11 batches of Hedera helix（mg/g，n ＝2）

2.4 樣品含量測定

取11 批次洋常春藤干燥莖和葉，依法制備供試品溶液，過0.22 μm 水相濾膜，精密吸取10 μL 注入離子色譜儀，按2.1 項下色譜條件進樣測定2 次，記錄色譜圖，用外標法計算樣品含量。含量測定結(jié)果見表4，色譜圖見圖2。

1. 阿拉伯糖 2. D-無水葡萄糖 3. D-果糖 4. 蔗糖A. 莖 B 葉圖2 樣品含量測定離子色譜圖1.arabinose 2. D-glucose 3. D-fructose 4. sucroseA.Stem B.LeafFig.2 Ion chromatograms for content determination of samples

2.5 樣品含量分析

根據(jù)11 批次洋常春藤藥材中4 種游離糖成分含量測定結(jié)果，按不同藥用部位和不同產(chǎn)地分類匯總并計算4 種游離糖成分含量，詳見表5。可見，不同產(chǎn)地和部位（莖或葉）洋常春藤中的游離糖成分主要為阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖和蔗糖4 種。不同部位比較顯示，莖中D-無水葡萄糖和D-果糖含量均高于葉中，莖中阿拉伯糖和蔗糖含量均低于葉中；不同產(chǎn)地比較顯示，上海產(chǎn)的阿拉伯糖含量最高，江蘇產(chǎn)的D-無水葡萄糖和D-果糖含量最高，廣東產(chǎn)的蔗糖含量最高；廣東產(chǎn)洋常春藤（莖＋葉）中4 種游離糖成分總含量最高，平均總含量為82.23 mg/g，蔗糖含量為67.46%，占比最高。

表5 不同產(chǎn)地和部位洋常春藤藥材游離糖成分含量測定結(jié)果（mg/g）Tab.5 Content of free sugar components in Hedera helix from different places of origin and different parts（mg/g）

3 討論

糖類的檢測方法主要有氣相色譜法［13-14］、高效毛細管電泳法［15-16］、高效液相色譜法［17］等。氣相色譜法要求待測物在分析條件下可氣化，且不分解；高效毛細管電泳法和高效液相色譜法均采用紫外檢測器，要求待測物有紫外吸收。由于糖類大都無足夠的揮發(fā)性，且無吸光基團，故上述3 種分析方法都需先對其進行衍生化，操作煩瑣，結(jié)果重復性差，不利于開展大批量精準檢測。雖然高效液相色譜法也可以采用示差檢測器，無需衍生化，但其靈敏度較低，且受溫度和流動相影響較大，穩(wěn)定性和重復性都欠佳。

本研究中采用梯度洗脫程序，通過梯度淋洗改變流動相的pH，使各成分有效分離。糖類為pKa 在12 ～14的弱酸，其中半乳糖、果糖、木糖、葡萄糖的pKa 值分別為12.35，12.03，12.15，12.28，在高pH 淋洗液中均會部分或全部以陰離子形式存在，可在陰離子交換柱上保留并得到分離。當100 mol/L NaOH 溶液（流動相C）比例大于25%時，保留時間縮短，由于半乳糖和葡萄糖屬差相異構(gòu)體和位置異構(gòu)體，半乳糖和葡萄糖不能完全分離；低于15%時，半乳糖和葡萄糖可完全分離；低于25%時，核糖和蔗糖不能完全分離。試驗發(fā)現(xiàn)，如果初始時間段流動相C 比例過低，后續(xù)提高流動相C 比例，核糖和蔗糖仍不能完全分離。為使各成分達到分離要求，故設置初始流動相C 比例為18% ，并梯度提高至30%；糖醛酸類物質(zhì)保留相對較長，醋酸根具有比氫氧根更強的淋洗能力，故提高醋酸根濃度洗脫出糖醛酸類物質(zhì)。最終確定梯度洗脫條件。

本研究中比較了洋常春藤藥材供試品溶液制備中不同藥材粒徑（過10，20，40，60 目篩）、不同料液比（1 ∶50，1 ∶100，1 ∶200，m/ V）和不同加熱回流提取時間（1，2，3，4 h）的提取效果，最終確定最佳提取條件。

試驗結(jié)果顯示，洋常春藤莖和葉中均含有4 種游離糖成分（阿拉伯糖、D -無水葡萄糖、D -果糖和蔗糖）。莖和葉部位的4 種游離糖中，蔗糖和D -無水葡萄糖含量較高，其次為D -果糖，阿拉伯糖含量最低；不同產(chǎn)地洋常春藤中，各游離糖成分的含量有明顯差異。

綜上所述，本方法可全面評價洋常春藤中發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)及對其中有效提取部位進行質(zhì)量控制，分離能力強，靈敏度高，可為后續(xù)用藥部位和藥用成分內(nèi)控指標的建立提供參考。