帕瑞昔布經(jīng)miR-152/ERBB3 信號通路對卵巢癌Skov3 細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用

王志君，仇 瑋

（1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 無錫 214144； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤病理科，江蘇 南京 210029）

卵巢癌（OC）為婦科常見的惡性腫瘤，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療為手術(shù)加鉑類和紫杉烷類輔助化學(xué)治療（簡稱化療）［1］。雖然許多上皮性卵巢癌患者初治時有良好反應(yīng)，但復(fù)發(fā)率較高，生存率低于50%［2］。研究表明，卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在環(huán)氧合酶2（COX-2）的過表達(dá)，同時炎癥與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，COX-2 參與炎癥的調(diào)控［3-4］，故抑制COX-2 可能表現(xiàn)出潛在的抗癌作用。帕瑞昔布為新型COX-2 選擇性抑制劑，常用于術(shù)后鎮(zhèn)痛，不良反應(yīng)發(fā)生率低，且對大腸癌和食道腺癌等有治療作用［5］。microRNA（miR）是一類高度保守的非編碼RNA，miRNA 的異常表達(dá)與癌變密切相關(guān)，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、致癌等過程中起關(guān)鍵作用。miR-152 是卵巢癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物，在卵巢癌組織中低表達(dá)［6］。表皮生長因子受體3（ERBB3）是miR-152 的靶基因［7］，尚不清楚帕瑞昔布經(jīng)miR-152/ERBB3 信號通路對卵巢癌的抗癌作用。本研究中探討了帕瑞昔布經(jīng)miR-152/ERBB3 信號通路對卵巢癌Skov3 細(xì)胞的增殖和凋亡作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

試藥:帕瑞昔布（美國 Sigma 公司，批號為QP182400）；卵巢癌Skov3 細(xì)胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫，批號為5173）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號為PM190040）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號為31600-034）；四噻唑藍(lán)（MTT，美國Amresco 公司，批號為0793）；AnnexinV/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號為CA1020）；Trizol（美國Invitrogen 公司，批號為15596026）；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號為HS0148），Ultra SYBR One Step RNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） Kit 熒光定量PCR 試劑盒（批號為HS0614），均購于寶生物工程＜大連＞有限公司。miR-152，ERBB3，COX-2，以及磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、U6 引物，均由大連TaKaRa 公司設(shè)計并合成。miR-152上游引物為5′-TCAGTGCATGACAGAACTTGGAA -3′，下游引物為5′-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3′ ；ERBB3 上游引物為 5′-GCAGATCAGTGTGTAGCGTG-3′ ， 下游引物為 5′-CGTGTGCAGTTGAAGTGACA-3′；COX-2 上游引物為5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′ ，下游引物為5′-TGTGCAGGTGCCGGTTCAG-3′；PI3K 上游引物為5′-ATCATGGGCTGGACATTGGA-3′，下游引物為5′-ACAGGGACATCAGTCGCTTCA-3′；Bcl-2 上游引物為5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′，下游引物為5′-TGTGCAGGTGCCGGTTCAG-3′；Bax 上游引物為5′-ATCATGGGCTGGACATTGGA-3′，下游引物為5′ -ACAGGGACATCAGTCGCTTCA-3′；Caspase-3 上游引物 為5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′，下游引物為5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG -3′；U6引物序列上游引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTG CGTGTCAT-3′。

儀器:Elite 系列二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技有限公司）；1-14K 型高速低溫離心機(jī)（美國Sigma 公司）；HBS-1096B 型酶標(biāo)儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；奧林巴斯CX43 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；NanoDrop 2000c 型蛋白核酸檢測儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；BDFACSCanto 型流式細(xì)胞儀，CFX96型實時熒光定量PCR，均購自美國BIO-RAD 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37 ℃及5% CO2條件下培養(yǎng)Skov3 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行試驗，分為陰性對照組，帕瑞昔布低、中、高劑量組和陽性對照組。陰性對照組加入無血清DMEM 培養(yǎng)基，帕瑞昔布低、中、高劑量組分別加入終濃度為50，100，200 μmol/L 的帕瑞昔布［8］，陽性對照組加入含有終濃度為4 μmol/L 的順鉑［9］，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 MTT 法測定Skov3 細(xì)胞增殖

以5×103個/孔將細(xì)胞接種于96 孔板中（每孔200 μL），待細(xì)胞融合后，按1.2 項下方法進(jìn)行干預(yù)。試驗結(jié)束前4 h 加入MTT（每孔20 μL），繼續(xù)培養(yǎng)，再加入100 μL 二甲基亞砜振蕩10 min，搖勻，用酶標(biāo)儀在630 nm 波長處測定吸光度值，根據(jù)公式［細(xì)胞增殖率（%）＝OD試驗組/ OD對照組］計算細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Skov3 細(xì)胞凋亡

以5×104個/孔將細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)（每孔3 mL），按1.2 項下方法操作，給予受試物干預(yù)48 h 后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心，棄上清液，用1×Bindingbuffer 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Skov3 細(xì)胞中各指標(biāo)水平

以5×104個/孔將細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)（每孔3 mL），按1.2 項下方法操作，給予受試物干預(yù)48 h，使用Trizol從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，制備20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃、30 s，變性95 ℃、5 s，60 ℃、45 s，38 個循環(huán)，61 ℃時采集熒光，用實時熒光定量PCR 儀檢測，并對其表達(dá)量進(jìn)行分析，以U6 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct 法計算miR-152，ERBB3，COX-2，PI3K，Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對Skov3 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與陰性對照組比較，帕瑞昔布低、中、高劑量組和陽性對照組的細(xì)胞增殖率均顯著降低，細(xì)胞凋亡率均顯著增加，帕瑞昔布高、中、低劑量組的細(xì)胞增殖率和凋亡率均呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與陽性對照組比較，帕瑞昔布低、中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見表1、圖1 和圖2。

A. 陰性對照組 B. 帕瑞昔布低劑量組 C. 帕瑞昔布中劑量組 D. 帕瑞昔布高劑量組 E. 陽性對照組圖1 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞增殖的影響（×200）A.Negative control group B.Low-dose parecoxib group C.Medium-dose parecoxib group D.High-dose parecoxib group E.Postive control groupFig.1 Effect of parecoxib on the proliferation of Skov3 cells（×200）

A. 陰性對照組 B. 帕瑞昔布低劑量組 C. 帕瑞昔布中劑量組 D. 帕瑞昔布高劑量組 E. 陽性對照組圖2 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞凋亡的影響A.Negative control group B.Low-dose parecoxib group C.Medium-dose parecoxib group D.High-dose parecoxib group E.Postive control groupFig.2 Effect of parecoxib on the apoptosis of Skov3 cells

表1 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s，%）Tab.1 Effect of parecoxib on the proliferation and apoptosis of Skov3 cells（± s，%）

表1 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（± s，%）Tab.1 Effect of parecoxib on the proliferation and apoptosis of Skov3 cells（± s，%）

注:與陰性對照組比較，a P ＜0.05；與帕瑞昔布低劑量組比較，b P ＜0.05；與帕瑞昔布中劑量組比較，c P ＜0.05；與帕瑞昔布高劑量組比較，d P ＜0.05。下表同。Note:Compared with those in the negative control group，a P ＜ 0.05；compared with those in the low-dose parecoxib group，b P ＜0.05；compared with those in the medium-dose parecoxib group，c P ＜0.05；compared with those in the high-dose parecoxib group，d P ＜0.05；as well as the following tables.

組別陰性對照組帕瑞昔布 低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組細(xì)胞增殖率100.00 ±8.42 83.28 ±10.08a 67.13 ±8.45ab 56.73 ±3.48abc 46.28 ±7.15abcd細(xì)胞凋亡率0.16±0.03 0.47±0.09a 1.69±0.36ab 2.44±0.23abc 3.20±0.48abcd

表2 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞中miR-152，ERBB3，COX-2，PI3K mRNA 水平的影響（± s）Tab.2 Effect of parecoxib on the levels of miR-152，ERBB3，COX-2 and PI3K mRNA in Skov3 cells（± s）

表2 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞中miR-152，ERBB3，COX-2，PI3K mRNA 水平的影響（± s）Tab.2 Effect of parecoxib on the levels of miR-152，ERBB3，COX-2 and PI3K mRNA in Skov3 cells（± s）

組別陰性對照組帕瑞昔布 低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組miR-152 1.00±0.08 0.76±0.05a 0.58±0.04ab 0.43±0.09abc 0.28±0.07abcd ERBB3 1.00±0.04 0.82±0.14a 0.55±0.07ab 0.36±0.10abc 0.13±0.02abcd COX-2 1.00±0.09 0.81±0.05a 0.65±0.05ab 0.47±0.10abc 0.24±0.05abcd PI3K 1.00±0.20 0.74±0.15a 0.60±0.02ab 0.42±0.10abc 0.32±0.05abcd

2.2 對Skov3 細(xì)胞中miR-152，ERBB3，COX-2，PI3K mRNA 水平的影響

與陰性對照組比較，帕瑞昔布低、中、高劑量組和陽性對照組細(xì)胞中miR -152，ERBB3，COX -2 和PI3K mRNA 水平均顯著降低，帕瑞昔布高、中、低劑量組呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與陽性對照組比較，帕瑞昔布低、中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見表2。

2.3 對Skov3 細(xì)胞中Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA水平的影響

與陰性對照組比較，帕瑞昔布低、中、高劑量組和陽性對照組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA 水平均顯著降低，Bax 和Caspase-3 mRNA 水平均顯著升高，帕瑞昔布高、中、低劑量組呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與陽性對照組比較，帕瑞昔布高、中、低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。詳見表3。

表3 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞中Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA水平的影響（± s）Tab.3 Effect of parecoxib on the levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA in Skov3 cells（± s）

表3 帕瑞昔布對Skov3 細(xì)胞中Bcl-2，Bax，Caspase-3 mRNA水平的影響（± s）Tab.3 Effect of parecoxib on the levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA in Skov3 cells（± s）

組別陰性對照組帕瑞昔布 低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組Bcl-2 1.00±0.07 0.81±0.26a 0.73±0.04ab 0.57±0.09abc 0.40±0.10abcd Bax 1.00±0.10 1.28±0.06a 1.53±0.08ab 1.94±0.29abc 2.60±0.42abcd Caspase-3 1.00±0.02 1.44±0.64a 1.69±0.35ab 1.97±0.12abc 2.53±0.46abcd

3 討論

目前，卵巢癌最好的治療方法是手術(shù)結(jié)合順鉑聯(lián)合紫杉醇化療，但長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥，臨床療效越來越差［10］。COX-2 參與腫瘤的發(fā)生，COX-2 抑制劑表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌作用。帕瑞昔布為新型COX-2 選擇性抑制劑，具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用［11］。此外，帕瑞昔布可減少家族性腺瘤癌模型小鼠的息肉數(shù)量，并使經(jīng)偶氮甲烷處理的大鼠胃癌的發(fā)生率降低50% ～84%［12-13］。本研究結(jié)果表明，帕瑞昔布能抑制Skov3 細(xì)胞的增殖，同時誘導(dǎo)Skov3 細(xì)胞的凋亡。雖然帕瑞昔布抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用不如順鉑強(qiáng)，但其毒副作用小，上述抗癌作用可能是通過抑制miR-152/ERBB3 信號通路來調(diào)節(jié)的，具有研究價值。

miR 參與機(jī)體大部分復(fù)雜的生物學(xué)過程，尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miR-152 可作為腫瘤抑制劑在許多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。miR-152 在卵巢癌中高表達(dá)，在高轉(zhuǎn)移性卵巢癌中這種高表達(dá)更明顯［14］。miR-152 和miR-185 的聯(lián)合作用通過靶向調(diào)控DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1），在卵巢癌的治療中起著重要作用［15］。體外試驗發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-152 可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡［16］。本研究中，帕瑞昔布可下調(diào)miR-152 在Skov3 細(xì)胞中的表達(dá)。同時，miR-152 調(diào)控Skov3 細(xì)胞增殖和凋亡的作用可能是通過靶基因ERBB3 來實現(xiàn)。

ERBB3 是ERBB 家族的4 個成員之一，可將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致多種癌細(xì)胞增殖、存活、凋亡、遷移、侵襲等調(diào)控過程發(fā)生變化，參與黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤的生理病理通路調(diào)控［17］。ERBB3 可能激活下游的COX-2 和PI3K，與腫瘤發(fā)生和治療耐藥相關(guān)［18］。COX-2 和PI3K 被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡過程中起重要作用，在卵巢癌中已觀察到COX-2 和PI3K 的過表達(dá)［19］。越來越多的研究表明，ERBB3 是潛在的癌癥治療靶向標(biāo)志物。ERBB3 通過PI3K/蛋白激酶（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。Bcl-2家族參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，Bcl-2 是主要的抗凋亡蛋白，Bax 是促凋亡蛋白，接受上游的刺激信號，啟動線粒體凋亡程序，通過一系列調(diào)控，最終激活Caspase-3，而Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的啟動因子，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡最終階段［20-21］。本研究結(jié)果顯示，帕瑞昔布可同時抑制上游的miR-152/ERBB3 信號通路，從而抑制Skov3 細(xì)胞中Bcl-2 mRNA 水平的表達(dá)，促進(jìn)Bax 和Caspase-3 mRNA 水平的表達(dá)，同時誘導(dǎo)Skov3 細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，帕瑞昔布可抑制Skov3 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制miR-152/ERBB3 信號通路有關(guān)。以上研究為今后臨床抗癌藥物的開發(fā)提供了試驗依據(jù)，但目前尚不清楚是否有更多的信號通路介導(dǎo)帕瑞昔布的作用，仍需作進(jìn)一步研究。