銀連祛風(fēng)湯對慢性蕁麻疹模型小鼠免疫指標(biāo)的影響*

夏蔡虹，楊軍炎，盛國榮

（1. 江蘇省南通漢藥中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 南通 226001； 2. 江蘇省南通市第五人民醫(yī)院，江蘇 南通 226361）

慢性蕁麻疹是一種變態(tài)反應(yīng)性疾?。?］，發(fā)病過程中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）、白細(xì)胞介素4（IL-4）等細(xì)胞因子水平及T 淋巴細(xì)胞亞群CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率將發(fā)生改變［2-3］。銀連祛風(fēng)湯是治療慢性蕁麻疹的協(xié)定方劑，臨床療效顯著［4］。關(guān)于慢性蕁麻疹動物模型中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率等的報道較少，特別是同一動物模型中多種因子的表達(dá)水平更罕見。本研究中運(yùn)用卵白蛋白＋氫氧化鋁制備慢性蕁麻疹小鼠模型，觀察銀連祛風(fēng)湯對其MCP-1，Eotaxin，IL-4 蛋白相對表達(dá)水平，以及對CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率的影響，以探討銀連祛風(fēng)湯治療慢性蕁麻疹的作用機(jī)制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物:SPF 級KM 小鼠，日齡為28 ～32 d，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，購于南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為SCKX（蘇）2010-0023，動物許可證號為SYXK（蘇）2012-0031，實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員上崗證號分別為2100443，2091530。動物飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為45% ～70%的動物房內(nèi)，自然光照。實(shí)驗(yàn)室溫度為（25±1）℃，相對濕度為70%。

儀器:FACS Calibur 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；0412-1 型離心機(jī)（上海醫(yī)療器械＜集團(tuán)＞有限公司手術(shù)器械廠）；ELr-800 型酶標(biāo)儀（美國寶特公司）。

試藥:銀連祛風(fēng)湯由銀花、連翹、丹皮各10 g，生石膏、生地、土茯苓、茵陳各30 g，白蒺藜20 g，地骨皮、地膚子、炒僵蠶各15 g，生甘皮5 g 組方；飲片購于南通三越中藥飲片有限公司，由南通市食品藥品檢驗(yàn)中心龔旭東主任中藥師鑒定為正品；按處方推算，以體質(zhì)量60 kg 計，人體日攝入量為每日220 g 生藥，相當(dāng)于生藥3.67 g/（kg·d）。地氯雷他定分散片（海南普利制藥股份有限公司，規(guī)格為每片5 mg，按體質(zhì)量60 kg 計，推薦攝入量為5 mg/d，相當(dāng)于0.083 mg/（kg·d）；卵白蛋白（默克生命科學(xué)＜上海＞有限公司）；氫氧化鋁（AR級，源葉生物科技有限公司）；MCP-1，Eotaxin，IL-4 試劑盒（上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗人CD4 抗體、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記抗人CD8 抗體試劑盒，均購于上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.2 方法

動物分組與造模:按隨機(jī)數(shù)字表法將72 只小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為6 組，即正常組（A 組），模型組（B 組），銀連祛風(fēng)湯低、中、高劑量組［C1組、C2組、C3組，生藥18.35，36.70，55.05 g/（kg·d），即臨床用量的5，10，15 倍］，陽性藥對照組［D 組，地氯雷他定0.83 mg/（kg·d），即臨床用量的10 倍］，各12 只。用氫氧化鋁＋生理鹽水配制成氫氧化鋁懸液（1 g ∶1 mL），第1 天除A 組外其余各組小鼠均腹腔注射卵白蛋白與氫氧化鋁懸液的混合液（0.1 mg ＋0.1 mL）進(jìn)行初次免疫，第10 天進(jìn)行第2次免疫［5］，以建立慢性蕁麻疹小鼠模型。

給藥:臨用前，取C1組、C2組、C3組各劑量生藥，按常規(guī)方法分別制備銀連祛風(fēng)湯，并定容至1 200 mL，備用；取地氯雷他定分散片10 片（50 mg），溶于1 200 mL水，備用。C1組、C2組、C3組、D 組小鼠在初次免疫后的第6 天開始灌胃給藥，每天上午10:00 按0.02 mL/g小鼠體質(zhì)量灌胃1 次，A 組和B 組小鼠灌胃等體積生理鹽水。各組小鼠均連續(xù)灌胃21 d。

小鼠軀體情況觀察:于第1 次和第2 次免疫后的第2 天，分別觀察各組小鼠精神狀態(tài)、呼吸、皮毛、飲食、大小便、有無抓撓等情況。

血清和血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率檢測:末次給藥的第2 天，腹腔注射5 mL/kg 20%烏拉坦麻醉小鼠，每只小鼠分別經(jīng)眼球摘除取血1 mL，離心（1 500 r/min）30 min，取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。脫頸處死小鼠后，分別剝?nèi)∶恐恍∈笱鼙诮M織0.5 g，加2 mL 不含鈣、鎂的磷酸鹽（PBS）緩沖液，得血管壁組織勻漿，離心（3 000 r/min）30 min，取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清及血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以X±s 表示，行單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠軀體情況

第1 次免疫后，除個別小鼠出現(xiàn)異常行為外，其余小鼠均活動自如，未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)。第2 次免疫后，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組小鼠均出現(xiàn)不同程度抓撓、煩躁不安、易驚、皮毛光澤度變差等陽性反應(yīng)；各組小鼠飲食均正常，C1組、C2組、C3組小鼠大便褐黑色；A組小鼠基本無上述反應(yīng)。詳見表1。

表1 第2 次免疫后各組小鼠軀體情況（n ＝12）Tab.1 Body condition of mice in each group after the second immunization（n ＝12）

2.2 對小鼠血清中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率的影響

與A 組比較，B 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細(xì)胞陽性率均明顯升高，CD4＋細(xì)胞陽性率、CD4＋/CD8＋比值均明顯降低（P ＜0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平均明顯降低，C3組和D 組小鼠CD4＋細(xì)胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均明顯升高（P ＜0.05）；與C1組比較，C3組和D 組小鼠上述指標(biāo)變化顯著（P ＜0.05）。詳見表2 和表3。

表2 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血清中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.2 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on MCP-1，Eotaxin and IL-4 levels in serum of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

表2 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血清中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.2 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on MCP-1，Eotaxin and IL-4 levels in serum of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

注:與A 組比較，*P ＜0.01；與B 組比較，△P ＜0.05；與C1組比較，▲P ＜0.05。下表同。Note:Compared with those in group A，* P ＜0.01；compared with those in group B，△P ＜0.05；compared with those in group C1，▲P ＜0.05；as well as the following tables.

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）MCP-1 156.34±17.62 423.65±45.39*386.61±39.22△311.28±28.46△▲187.33±21.56△▲198.45±24.13△▲Eotaxin 38.19±4.39 86.47±10.37*74.91±10.26△63.89±8.58△▲45.93±6.77△▲46.54±6.32△▲IL-4 27.65±3.78 45.36±4.37*41.41±4.02△36.27±3.39△▲30.52±3.65△▲31.27±3.82△▲

表3 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血清中CD4＋，CD8＋細(xì)胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.3 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in serum of mice（± s，n ＝12）

表3 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血清中CD4＋，CD8＋細(xì)胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.3 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in serum of mice（± s，n ＝12）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）CD4＋（%）40.19±3.63 30.73±2.93*33.31±3.04△36.97±3.31△▲38.93±3.39△▲37.54±3.32△▲CD8＋（%）24.27±2.37 29.47±2.86*28.42±2.73 26.52±2.69△25.89±2.38△▲26.13±2.49△▲CD4＋/CD8＋1.69±0.46 1.04±0.21*1.12±0.26 1.37±0.33△▲1.54±0.43△▲1.47±0.42△▲

2.3 對小鼠血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，IL-4，Eotaxin 水平及CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率的影響

與A 組比較，B 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細(xì)胞陽性率均明顯升高，CD4＋細(xì)胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均明顯降低（P ＜0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平均明顯降低，C3組和D 組小鼠CD4＋細(xì)胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均明顯升高（P ＜0.05）；C1組比較，C3組小鼠上述指標(biāo)變化顯著（ P ＜0.05）。詳見表4 和表5。

表4 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.4 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the levels of MCP-1，Eotaxin and IL-4 in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

表4 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.4 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the levels of MCP-1，Eotaxin and IL-4 in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）MCP-1 154.76±15.78 410.55±43.28*367.51±31.12△287.43±23.21△▲158.79±16.28△▲179.41±19.52△▲Eotaxin 37.44±4.14 79.66±9.25*71.33±8.42△55.36±6.04△▲38.68±4.51△▲41.22±4.27△▲IL-4 25.47±3.59 43.86±4.48*41.27±3.96△35.07±3.65△▲27.14±3.47△▲28.66±3.75△▲

3 討論

卵白蛋白＋氫氧化鋁的混懸液制備慢性蕁麻疹小鼠模型重復(fù)性好，方法簡單［6-7］。本研究中，模型組及各用藥組小鼠首次免疫后，基本未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)。第2 次免疫后，模型組及各用藥組小鼠出現(xiàn)不同程度抓撓、煩躁不安、易驚、皮毛光澤度變差等陽性反應(yīng)。類似于人體變態(tài)反應(yīng)性疾病的主要臨床癥狀，符合蕁麻疹動物模型基本特征，提示造模成功。

研究表明，多種炎性細(xì)胞因子共同參與慢性蕁麻疹發(fā)病的免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)［3，8］，其中，輔助性T 淋巴細(xì)胞Th1和Th2的活性失衡是誘發(fā)慢性蕁麻疹等變態(tài)反應(yīng)性疾病的主要原因。Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)平衡。自分泌調(diào)節(jié)已被多種試驗(yàn)證實(shí)［9-10］，旁分泌機(jī)制研究尚不成熟。慢性蕁麻疹患者Eotaxin 和MCP-1 水平的表達(dá)均顯著升高［11-12］。MCP-1 可有效促進(jìn)Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4［2］。Eotaxin 對嗜酸粒細(xì)胞具有特異趨化作用，通過調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞并釋放IL-4 等Th2細(xì)胞因子，使其大量聚集在炎性部位［13-14］，導(dǎo)致Th1/Th2明顯失衡，從而引發(fā)慢性蕁麻疹等過敏性疾病?？梢?，MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平在慢性蕁麻疹中的表達(dá)會同步升高，這是一種正性調(diào)節(jié)關(guān)系。本研究中，用銀連祛風(fēng)湯治療慢性蕁麻疹模型小鼠，其血清及血管壁組織勻漿上清液中MCP-1 和Eotaxin 水平均降低，IL-4 水平隨之降低，與上述理論吻合。由于IL-4 等Th2類細(xì)胞因子在誘發(fā)慢性蕁麻疹等過敏反應(yīng)性疾病中起決定性作用［15］，當(dāng)IL-4 水平異常升高時，機(jī)體免疫出現(xiàn)向Th2方向漂移的傾向［16］，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)Th1/Th2處于失衡狀態(tài)。本研究中使用銀連祛風(fēng)湯后，IL-4 表達(dá)水平顯著下降，推測漂移現(xiàn)象隨之減弱。提示銀連祛風(fēng)湯可發(fā)揮治療慢性蕁麻疹的作用，同時糾正Th1和Th2失衡狀態(tài)。

表5 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.5 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，n ＝12）

表5 銀連祛風(fēng)湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.5 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，n ＝12）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）CD4＋（%）36.25±4.34 29.15±3.13*32.03±3.11△34.77±4.12△35.15±4.28△▲34.43±4.02△CD8＋（%）22.41±2.46 27.74±2.67*25.66±2.53 24.71±2.42△22.69±2.16△▲24.07±2.46△CD4＋/CD8＋1.55±0.42 1.03±0.19*1.22±0.25△1.41±0.35△1.53±0.41△▲1.44±0.39△

慢性蕁麻疹與T 淋巴細(xì)胞聯(lián)系緊密［17］，CD4＋和CD8＋細(xì)胞陽性率是成熟階段T 淋巴細(xì)胞的重要特征指標(biāo)。慢性蕁麻疹細(xì)胞免疫主要表現(xiàn)在血清輔助淋巴細(xì)胞CD4＋表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞CD8＋表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致CD4＋/CD8＋比值同步下降［18］。研究發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)CD4＋和CD8＋細(xì)胞比例失調(diào)，CD4＋/CD8＋比值降低［19-20］。本研究中，治療后小鼠血清及血管壁組織勻漿上清液中CD8＋細(xì)胞陽性率明顯降低，CD4＋細(xì)胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均升高。

慢性蕁麻疹模型小鼠血管壁組織勻漿上清液中的MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋，CD8＋細(xì)胞陽性率的改善程度要優(yōu)于血清的改善程度?？赡苁锹允n麻疹發(fā)病時血管通透性增加，表皮出現(xiàn)紅斑、水腫等蕁麻疹病變。治療后，血管通透性隨之降低，聚集在血管壁組織勻漿中的MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細(xì)胞陽性率明顯下降甚至消除，CD4＋細(xì)胞陽性率代償性升高，并彌補(bǔ)其功能上的不足。外周血由于全身循環(huán)，異常因子的徹底改善會相對慢一些，出現(xiàn)了時間窗，類似人類慢性蕁麻疹皮損已消除，但如不鞏固治療會反復(fù)發(fā)作。

本研究結(jié)果顯示，B 組小鼠血清及血管壁勻漿組織上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細(xì)胞陽性率均明顯高于A 組，CD4＋細(xì)胞陽性率明顯低于A 組。治療后，外周血及血管壁組織中上述因子的表達(dá)水平均明顯改善，且血管壁組織中的改善程度優(yōu)于外周血清。而C3組的指標(biāo)值接近正常值；C3組、C2組的改善程度優(yōu)于C1組。三者量效依賴關(guān)系良好。銀連祛風(fēng)湯治療慢性蕁麻疹的作用可能是通過降低外周血及血管壁組織中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細(xì)胞陽性率，升高CD4＋細(xì)胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值而實(shí)現(xiàn)的，提示MCP-1，Eotaxin，IL-4，CD4＋，CD8＋參與了慢性蕁麻疹的發(fā)生、發(fā)展過程。

中醫(yī)學(xué)將慢性蕁麻疹歸為“癮疹”范疇［21］，發(fā)病機(jī)制為風(fēng)寒夾濕，汗出當(dāng)風(fēng)，內(nèi)生風(fēng)邪，致濕熱蘊(yùn)結(jié)，陰虛血燥，濕邪化熱［22-23］。地氯雷他定是第二代抗組胺藥，治療慢性蕁麻疹療效確切，但復(fù)發(fā)率高。銀連祛風(fēng)湯處方中銀花、土茯苓清熱除濕，生地、丹皮涼血養(yǎng)陰，為君藥，四藥合用共奏清熱涼血消風(fēng)之功；連翹、石膏清熱瀉火，為臣藥；白蒺藜與地膚子清熱疏風(fēng)止癢；茵陳清熱利濕；炒僵蠶祛風(fēng)止痛；地骨皮清肺降火；生甘皮理氣降逆。全方配伍合理，共奏祛風(fēng)清熱、涼血消風(fēng)、潤燥通里之功。因此，銀連祛風(fēng)湯能從病因?qū)W上抑制慢性蕁麻疹的炎性反應(yīng)，使外周血及血管壁組織中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細(xì)胞陽性率明顯下降，CD4＋細(xì)胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值明顯升高，可有效改善毛細(xì)血管通透性增加等病理損傷，發(fā)揮治療慢性蕁麻疹的作用。

綜上所述，銀連祛風(fēng)湯能顯著降低慢性蕁麻疹模型小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平和CD8＋細(xì)胞陽性率，升高CD4＋細(xì)胞陽性率。但銀連祛風(fēng)湯調(diào)節(jié)慢性蕁麻疹患者體內(nèi)MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋，CD4＋細(xì)胞陽性率的具體作用通路及相關(guān)靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究。