非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01614表達(dá)及臨床意義

姜鑫 李國(guó)奇 吳登斌

1鞍鋼集團(tuán)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，鞍山150000；2鞍鋼集團(tuán)總醫(yī)院腫瘤科，鞍山150000

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，主要由腺癌和鱗狀細(xì)胞癌組成的非小細(xì)胞肺癌 (non-s mall cell l ung cancer，NSCLC)是肺癌的主要形式，約占所有肺癌的80%[1]。盡管NSCLC的治療取得了新的進(jìn)展，但NSCLC的預(yù)后仍然不理想，其5年總生存率(overall sur vival，OS)為15.9%[2]。因此，深入研究NSCLC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制對(duì)于改善該病的診斷、治療和預(yù)后至關(guān)重要。基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中只有一小部分 (＜2%)能夠編碼蛋白質(zhì)，而其余部分則由許多非編碼RNA 組成。越來(lái)越多的證據(jù)表明非編碼RNA 可能參與了腫瘤的發(fā)病機(jī)制，這為腫瘤的生物學(xué)研究提供了新的視角[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，l nc RNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的RNA，在許多癌癥中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、增殖和侵襲有關(guān)，可作為早期診斷、治療和預(yù)后的重要指標(biāo)[4]。近年來(lái)的研究證實(shí)了l nc RNA 在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤中的生物學(xué)功能[5-7]。然而，lnc RNA 在NSCLC進(jìn)展中的作用仍然不清楚。本研究通過(guò)微陣列分析表征了NSCLC中l(wèi) nc RNA 的表達(dá)譜，并鑒定了表達(dá)最異常的l nc RNA LINC01614，初步探討NSCLC 患者癌組織中LINC01614表達(dá)及臨床意義，為NSCLC患者預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月期間在鞍鋼集團(tuán)總醫(yī)院行手術(shù)切除的75例原發(fā)性NSCLC患者癌組織作為病例，并選取相對(duì)應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣＞5 c m)作為對(duì)照。其中男42例，女33例；年齡 (58.89±10.16)歲，年齡范圍為38～80歲。收集所有患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型及腫瘤長(zhǎng)徑等臨床基本資料進(jìn)行回顧性研究，NSCLC 患者出院后均進(jìn)行隨訪，隨訪資料完整。手術(shù)后樣本組織立刻放置在液氮中進(jìn)行保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷明確，符合原發(fā)性肺癌診療規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)在鞍鋼集團(tuán)總醫(yī)院進(jìn)行首程治療，未接受放療、化療及免疫治療；(3)有完整的臨床病歷或體檢資料，無(wú)其他遺傳病； (4)治療期間無(wú)死亡病例，患者均已出院。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類型的腫瘤；(2)近3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過(guò)抗生素；(3)合并其他結(jié)締組織、內(nèi)分泌和代謝疾病； (4)有嚴(yán)重心、肝、腎及精神病史或精神病家族史。采用美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) (2011)的NSCLC 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM 分期，收集所有患者的臨床資料。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 l nc RNA 微陣列分析 取出保存的組織標(biāo)本，研碎，加入1 ml TRIzol(美國(guó)Life Technologies公司)進(jìn)行提取RNA，根據(jù)Taq Man micro RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國(guó)ABI公司)說(shuō)明合成c DNA。按照入組順序進(jìn)行編號(hào)，應(yīng)用Excel隨機(jī)數(shù)生成器，生成8個(gè)隨機(jī)數(shù)，選取隨機(jī)數(shù)對(duì)應(yīng)編號(hào)的8例癌組織和相應(yīng)癌旁組織進(jìn)行mi R 微陣列分析。將c DNA 進(jìn)行pol y A 加尾Mix 和進(jìn)行生物素標(biāo)記，然后雜交到芯片上。采用安捷倫微陣列分析平臺(tái)，即人l nc RNA 陣列V3.0，保護(hù)30586 l nc RNA 的探針。實(shí)驗(yàn)Agilent芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，用Agilent GeneSpring GX v11.5軟件對(duì)時(shí)間進(jìn)行歸一化和差異化分析。以倍數(shù)變化＞2且P ＜0.05為存在差異。

1.3 用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 法檢測(cè)組織中LINC01614的水平 用1.2中所合成的c DNA 根據(jù)SYBR Premix Ex Taq T M Ⅱ熒光定量PCR 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃下預(yù)變性15 min，然后在94 ℃下變性15 s，在56 ℃下退火30 s，然后在70 ℃下延伸30 s，并重復(fù)40個(gè)循環(huán)。LINC01614引物序列：正向引物為5'-ACAGGGGAGGTGATAGCATT-3'，反向引物為5'-GACCAAAAGCCTTCATACATCTC-3'；GAPDH 引物序列：正向引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，反向引物為5-GGTATCCATCGCCATGCTC-3'。每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，以GADPH 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x-±s 表示，兩組比較采用t 檢驗(yàn)；多組用單因素方差分析進(jìn)行判斷；繪制出受試者工作特 征 (receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，確定LINC01614 診斷NSCLC 的效能參數(shù)；采用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析，采用多元逐步COX 回歸模型 (α入=0.05、α出=0.10)探討影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織之間l nc RNA 表達(dá)差異 對(duì)16個(gè)樣本進(jìn)行l(wèi) nc RNA 微陣列分析 (癌組織和癌旁組織各8 個(gè))，NSCLC 患者中發(fā)現(xiàn)3 261個(gè)l nc RNA 表達(dá)水平顯著不同，其中1 205個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 056個(gè)表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，LINC01614 為最紊亂的lnc RNA，在癌組織中表達(dá)上調(diào)，是癌旁組織的22.92倍。通過(guò)基因本體論分析和生物學(xué)途徑分析發(fā)現(xiàn)，LINC01614參與了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、P53和Wnt等NSCLC發(fā)病經(jīng)典途徑，(圖1、2)。

2.2 癌組織和癌旁組織中LINC01614的表達(dá)水平的比較 癌組織中LINC01614表達(dá)較癌旁組織增高(24.28±3.51比1.00±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=57.387，P ＜0.05)。與微陣列數(shù)據(jù)一致。

2.3 LINC01614的表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征的相關(guān)性 不同性別、年齡、吸煙史、病理類型及腫瘤長(zhǎng)徑的NSCLC患者癌組織中LINC01614相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 值均＞0.05)。不同臨床分期、組織分化程度和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 NSCLC 患者癌組織中LINC01614相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 值均＜0.05)；臨床分期越高、組織分化程度越低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，LINC01614 相對(duì)表達(dá)量越高(表1)。

圖2 差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼c RNA 的火山圖

2.4 LINC01614作為NSCLC 潛在生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值 通過(guò)繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，曲線下面積為0.788(95%CI：0.710～0.821)，以LINC01614相對(duì)表達(dá)量26.14作為截?cái)嘀?，將NSCLC 患者分為高表達(dá)組(26例)和低表達(dá)組(49例)，其診斷敏感度為58.62%，特異度為87.24%，對(duì)NSCLC具有診斷價(jià)值(圖3)。

表1 LINC01614的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 (x-±s)

圖3 非小細(xì)胞肺癌患者的LINC01614 受試者工作特征曲線

2.5 LINC01614表達(dá)對(duì)NSCLC 患者生存時(shí)間的影響 高表達(dá)組和低表達(dá)組的總生存期分別為22.2個(gè)月 (95%CI：20.1～34.6個(gè)月)和38.5個(gè)月(95%CI：25.3～45.5個(gè)月)，高表達(dá)組的生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (Z =10.248，P ＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 LINC01614 表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者總生存率的關(guān)系

2.6 NSCLC患者預(yù)后多因素分析 將NSCLC 患者臨床病理特征及LINC01614表達(dá)情況等變量納入，進(jìn)行多元COX 比例風(fēng)險(xiǎn)逐步回歸分析，結(jié)果顯示回歸方程整體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=35.136，P ＜0.001)，臨床分期晚 (Ⅲ期和Ⅳ期)、低分化、LINC01614 高表達(dá)和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

lnc RNA 的發(fā)現(xiàn)是后基因組時(shí)代的一個(gè)重要前沿。盡管lnc RNA 沒(méi)有表現(xiàn)出編碼蛋白的潛能，但它參與了一系列重要的生物活動(dòng)，包括胚胎發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、選擇性剪接和染色質(zhì)重塑。它們還對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、生存和代謝等許多細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)生重要影響[9]。l nc RNA 失調(diào)已被證實(shí)在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，如l nc RNAPVT1在胃癌中升高，通過(guò)調(diào)節(jié)P15和P16信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[10]。隨著包括高通量測(cè)序和基因芯片在內(nèi)的基因組技術(shù)的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)做出了巨大努力來(lái)鑒定與癌癥相關(guān)的lnc RNA。但與肺癌相關(guān)的l nc RNA 的研究仍處于起步階段，NSCLC 相關(guān)lnc RNA 的數(shù)據(jù)有限。因此，篩選出與NSCLC相關(guān)的l nc RNA 具有重要意義，可以成為NSCLC診斷和預(yù)后判斷的工具，甚至可以作為新的治療目標(biāo)。本研究利用l nc RNA 微陣列分析NSCLC患者癌組織和癌旁組織l nc RNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了3 261個(gè)l nc RNA 表達(dá)水平顯著不同，其中1 205個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 056個(gè)表達(dá)下調(diào)；同時(shí)，LINC01614為最紊亂的l nc RNA，在癌組織中表達(dá)上調(diào)，是癌旁組織的22.92倍，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)也證實(shí)了我們的分析。

表2 NSCLC患者預(yù)后影響因素多元COX 逐步回歸分析結(jié)果

通過(guò)分析LINC01614 的表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，TNM 分期越高、組織分化程度越低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，LINC01614相對(duì)表達(dá)量越高。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)LINC01614的高表達(dá)與NSCLC患者生存時(shí)間顯著相關(guān)，預(yù)后多因素分析顯示LINC01614高表達(dá)為非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素，上述數(shù)據(jù)表明，LINC01614有潛力成為NSCLC 的預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，ROC 分析表明，LINC01614可以為從正常組織中篩查NSCLC組織提供有效的方法。許多NSCLC患者是經(jīng)皮經(jīng)胸針穿刺活檢或支氣管鏡活檢確診，但這些方法獲得的腫瘤組織相對(duì)較少，且可能破壞腫瘤細(xì)胞。因此，腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)改變可能是不典型且難以識(shí)別的[11]，檢測(cè)組織中的LINC01614表達(dá)水平可能有助于確定病變的性質(zhì)。

有研究表明，在癌癥患者的血漿織中可以檢測(cè)到游離的DNA、micro RNA、l nc RNA。更重要的是，即使在極端p H 和RNase A 消化等惡劣條件下，l nc RNA 也能在血液中保持穩(wěn)定[12]。而非編碼RNA 的釋放進(jìn)入血液被認(rèn)為是與腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死有關(guān)，也是分泌的結(jié)果[13]。因此，可以認(rèn)為腫瘤組織中l(wèi)nc RNA 的含量水平與患者血液中的含量是平行的。這些特征使得l nc RNA 有可能成為理想的癌癥診斷和預(yù)后的非侵入性生物標(biāo)志物。如血漿中l(wèi) nc RNA POU3F3 可作為食管鱗癌診斷的生物標(biāo)志物[14]。同時(shí)，有研究報(bào)道了在血漿中檢測(cè)l nc RNA H19 可以用于胃癌的檢測(cè)[15]。雖然LINC01614在NSCLC組織中表現(xiàn)出了良好的診斷效果，但是接下來(lái)我們將進(jìn)一步驗(yàn)證LINC01614在NSCLC患者血液中的良好診斷效果。

綜上所述，通過(guò)l nc RNA 微陣列對(duì)l nc RNA 在NSCLC中的表達(dá)譜進(jìn)行分析和RT-PCR 檢測(cè)，證實(shí)了LINC01614 在NSCLC 組織中高表達(dá)，并與NSCLC 的 惡 性 程 度 有 關(guān)。 此 外， 組 織 中LINC01614水平升高可能對(duì)NSCLC患者的預(yù)后有很大的提示作用。然而，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)LINC01614 表達(dá)失調(diào)對(duì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突