蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在婦科疾病研究中的應(yīng)用

黃原昕，賴東梅

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院上海市胚胎源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200030

蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白與蛋白相互作用等［1］，由此獲得蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的認(rèn)識。蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較正常人與患者生物樣本之間蛋白質(zhì)種類、表達(dá)量、修飾狀態(tài)的差異，可由此篩選出與疾病診斷治療相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物或潛在治療靶點(diǎn)，闡明疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制或發(fā)展新的治療技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在婦科疾病中的研究應(yīng)用逐步展開，本文對此進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

1.1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究目前廣泛應(yīng)用的是“自下而上”的策略。傳統(tǒng)的鳥槍法策略最初基于蛋白質(zhì)分離技術(shù)——雙向凝膠電泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE），而液相色譜（liquid chromatography，LC）的引入讓蛋白質(zhì)定量分析變得更為準(zhǔn)確。其基本流程為蛋白質(zhì)樣本經(jīng)過蛋白酶消化后由LC 分離，再進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索。由此開發(fā)出脫離凝膠的定量方法，包括同位素標(biāo)簽定量法和非標(biāo)記定量法。同位素標(biāo)簽定量法中，肽與各種同位素標(biāo)簽相連，其中離子信號對應(yīng)樣本中的相對肽豐度。最常見的同位素標(biāo)簽法包括：細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）、同位素編碼親和標(biāo)簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）、相對和絕對定量的同位素標(biāo)簽（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ） 和串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽法（tandem mass tags，TMT）。與之相對，非標(biāo)記定量法基于前體信號強(qiáng)度或光譜計數(shù)，樣本制備更簡便，可檢測范圍更大，技術(shù)進(jìn)步得益于高分辨率質(zhì)譜儀的發(fā)展［2］。

1.2 數(shù)據(jù)采集方式

經(jīng)典的鳥槍法屬于數(shù)據(jù)依賴采集模式（datadependent acquisition，DDA），可以一次性分析大量蛋白質(zhì)，但可重復(fù)性較低。靶向質(zhì)譜技術(shù)，主要基于選擇/多重/平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（selected-/multiple-/parallel reaction monitoring，SRM/MRM/PRM），可以提供目標(biāo)蛋白精確的絕對定量結(jié)果，是質(zhì)譜絕對定量的金標(biāo)準(zhǔn)，但有低通量的缺點(diǎn)。數(shù)據(jù)非依賴采集模式（data independent analysis，DIA），融合了上述兩者的特點(diǎn)，已成為生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的常規(guī)方法［3］。DIA 代表性的技術(shù)為全碎片離子順序窗口化獲取質(zhì)譜（sequential window acquisition of all theoretical mass spectra，SWATH），能將質(zhì)譜掃描范圍分為若干窗口，高速、循環(huán)地分析每個窗口中的離子。

1.3 翻譯后修飾

蛋白質(zhì)組分析的另一項(xiàng)挑戰(zhàn)是翻譯后修飾，如糖基化、泛素化、磷酸化、甲基化等。利用蛋白質(zhì)發(fā)生修飾后的質(zhì)量偏移可以實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定；同時，由于翻譯后修飾的蛋白質(zhì)在樣本中含量低且動態(tài)范圍廣，質(zhì)譜檢測前通常需要對發(fā)生修飾的蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行富集［4］。

1.4 蛋白質(zhì)和肽組織成像

血漿是復(fù)雜的生物樣本，所含蛋白質(zhì)的豐度差異極大，使得生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)變得復(fù)雜。人體組織樣本蛋白質(zhì)的種類雖然少，卻富含與疾病相關(guān)的特定分子，因此直接分析組織樣本，尤其是對于腫瘤的研究，是一種很有前景的方法。基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜成像技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight imaging mass spectrometry， MALDI-TOF-IMS）不僅能直接分析腫瘤組織中的蛋白質(zhì)組，更能提供有關(guān)脂質(zhì)和代謝物等相關(guān)物質(zhì)的空間分布信息［5］。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在婦科疾病研究中的應(yīng)用

2.1 多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是以稀發(fā)排卵或無排卵、高雄激素或胰島素抵抗、多囊卵巢為特征的內(nèi)分泌紊亂的癥候群［6］。PCOS病理生理機(jī)制尚不明確，可能涉及的機(jī)制有下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamus-pituitary-ovarian axis，HPA axis） 功 能 異常、胰島素抵抗和高胰島素血癥以及腎上腺內(nèi)分泌異常。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為研究PCOS發(fā)病內(nèi)在機(jī)制提供了進(jìn)一步探索的方向，其中一些代表性研究發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物見表1。

2.1.1 卵泡 卵泡液構(gòu)成卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境，卵巢病理過程常常涉及卵泡液的變化。Ambekar 等［7］的研究中，對接受輔助生殖技術(shù)的健康女性和PCOS患者的卵泡液取樣后用液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）進(jìn)行分析，鑒定出186 種表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)，這些蛋白表達(dá)水平變化引起了酶活性、氧化應(yīng)激、基底膜成分、血卵屏障、卵泡血管生成、卵丘復(fù)合體的異常，在一定程度上解釋了PCOS患者卵泡發(fā)育停滯或異常的原因。Patil 等［8］的研究則利用3種凝集素對卵泡液中的糖蛋白富集后進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)10 種差異表達(dá)蛋白，經(jīng)過驗(yàn)證，α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin，SERPINA1）上調(diào)和α-胰蛋白酶抑制劑 重 鏈4 （inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4，ITIH4）下調(diào)，這些蛋白質(zhì)在血管生成和維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定方面發(fā)揮作用，對卵泡成熟至關(guān)重要。

卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育過程中的重要參與者。Lan等［9］研究比較了PCOS患者與正常對照組的卵巢顆粒細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，其中差異表達(dá)的基因涉及氨基酸代謝、細(xì)胞增殖、生殖系統(tǒng)發(fā)育等過程，并發(fā)現(xiàn)參與構(gòu)成促分裂原活化的蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogenactivated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）信號通路的促分裂原活化的蛋白激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MAPKK4）和磷酸細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（phospho-ERK1/2）可能是影響PCOS 患者卵巢顆粒細(xì)胞功能的關(guān)鍵蛋白。關(guān)于PCOS 患者不易受孕的原因，除了卵巢功能異常之外，Amjadi 等［10］的研究發(fā)現(xiàn)其可能還與PCOS 患者子宮內(nèi)膜組織中凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)異常有關(guān)。

2.1.2 血漿 血液樣本的檢測雖然干擾因素較多，但能對全身疾病狀態(tài)有宏觀了解。分析患有胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和無胰島素抵抗（NIR）的PCOS患者血清樣本，可以發(fā)現(xiàn)IR 組血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、尿酸（uric acid，UA）水平高于NIR 組，發(fā)現(xiàn)4 種蛋白表達(dá)升高——α-白蛋白（alpha albumin/Afamin， AFM）、 血 清 轉(zhuǎn) 鐵 蛋 白（serotransferrin）、補(bǔ)體C3 和載脂蛋白C3（apolipoprotein C3，APOC3）。其中APOC3 的升高經(jīng)過酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 證實(shí)［11］。另 外，F(xiàn)azilat 等［12］發(fā) 現(xiàn) 在 排 卵 型PCOS 患 者（ovulatory PCOS，OPCOS）的血清中促分裂原活化的蛋白 激 酶4 （mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）表達(dá)下降，可能增高了患高脂血癥、高雄激素血癥和代謝綜合征的風(fēng)險。Arffman 等［13］比較了是否患有PCOS的晚期妊娠孕婦的血漿，預(yù)測PCOS與妊娠期不良事件發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)35 種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，涉及免疫應(yīng)答、心血管疾病發(fā)生和細(xì)胞增殖等過程，其中P 因子（properdin）和胰島素樣生長因子Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ）增高幅度最大。

表1 PCOS相關(guān)生物標(biāo)志物Tab 1 Biomarkers of PCOS

3 早發(fā)性卵巢功能不全

早發(fā)性卵巢功能不全 （premature ovarian insufficiency，POI），是指在40 歲之前出現(xiàn)超過4 個月以上閉經(jīng)，并且連續(xù)2 次間隔4 周以上的血清促性腺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平>25 IU/L。卵巢功能早衰可導(dǎo)致女性不孕，并提前出現(xiàn)衰老，且長時間的低雌激素水平將增加女性罹患骨質(zhì)疏松、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、認(rèn)知功能障礙等疾病的風(fēng)險。90%以上的POI 為特發(fā)性，無明確病因，可能與遺傳因素、免疫因素、酶或受體缺陷、物理化學(xué)因素等有關(guān)［14］，主要包括3 種發(fā)生機(jī)制，即卵母細(xì)胞池減少、卵泡發(fā)育障礙、卵泡閉鎖加速。

3.1 卵泡

最近，超重被認(rèn)為是卵母細(xì)胞發(fā)育停滯的影響因素。對正常體質(zhì)量和超重女性的卵泡液進(jìn)行基于iTRAQ 技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)22 種蛋白表達(dá)上調(diào)和21 種蛋白表達(dá)下調(diào)， 經(jīng)ELISA 驗(yàn)證人附睪蛋白4 （human epididymis protein 4，HE4/WFDC2）可能提示超重女性卵母細(xì)胞異常發(fā)育的情況［15］。Xu 等［16］發(fā)現(xiàn)始基卵泡形成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白1 （reticulocalbin-1/-3，RCN1/RCN3）、核內(nèi)不均一核糖核蛋白K （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K， HNRNPK）、 肌 動 蛋 白（actin） 等有關(guān)，而向初級卵泡過渡與穹窿體主蛋白（major vault protein，MVP）等有關(guān)。

3.2 血漿

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于POI 診斷及治療的研究并不多。Lee 等［17］利用LC-MS/MS 鑒定了POI 患者血清中差異表達(dá)的11 種蛋白質(zhì)，其中5 種與生殖系統(tǒng)相關(guān)，包 括 血 漿 銅 藍(lán) 蛋 白 （ceruloplasmin）、 補(bǔ) 體 C3（complement C3）、纖維素原α 和β（fibrinogen α/β）、性激 素 結(jié) 合 球 蛋 白 （sex hormone-binding globulin，SHBG），均是潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，見表2。

研究影響卵泡發(fā)育的因素，引起卵泡凋亡加速的機(jī)制，對早期發(fā)現(xiàn)POI、延緩卵巢功能衰退、預(yù)防POI遠(yuǎn)期并發(fā)癥，都具有重要的臨床價值。

4 上皮性卵巢癌

上皮性卵巢癌是常見的女性生殖器官惡性腫瘤之一，發(fā)病率次于宮頸癌（cervical cancer，CC）和子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC），病死率卻位于生殖器官惡性腫瘤之首。上皮性卵巢癌患者的預(yù)后差，目前仍缺乏有效的治療手段。將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于卵巢癌發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特性的研究，并尋找高靈敏度和高特異度的生物標(biāo)志物，有望幫助早期診斷、早期治療和個性化治療，從而改善患者預(yù)后。

對卵巢腫瘤蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面檢測，并結(jié)合基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)其中的關(guān)聯(lián)。基因片段拷貝數(shù)的變化將同時引起蛋白質(zhì)組的變化；反之蛋白質(zhì)參與的信號通路也影響基因的表達(dá)，尤其是與短期整體生存最相關(guān)的信號通路集合，可用來預(yù)測疾病的臨床轉(zhuǎn)歸［18］。

表2 POI相關(guān)生物標(biāo)志物Tab 2 Biomarkers of POI

4.1 血漿

血漿所含蛋白質(zhì)的豐度差異極大，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)比較復(fù)雜，近年來SRM/MRM為代表的靶向質(zhì)譜技術(shù)能較好地克服定量檢測中遇到的障礙。Hüttenhain等［19］提出基于SRM 的用于尋找血漿中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的策略，先通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選出候選標(biāo)志物，再通過SRM對樣本中的候選標(biāo)志物進(jìn)行定量檢測，其中5種聯(lián)合糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）檢測能提高卵巢癌的診斷率。不同類型上皮性卵巢癌的蛋白質(zhì)組有所差異，這些差異蛋白可輔助進(jìn)行分型。Dieters-Castator等［20］應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)8種蛋白質(zhì)，組合后能鑒別子宮內(nèi)膜樣卵巢癌和高級別漿液性卵巢癌，將鑒別診斷準(zhǔn)確率提高至99.2%。

4.2 腫瘤組織與腫瘤細(xì)胞

4.2.1 腫瘤轉(zhuǎn)移 腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移需要腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)的相互作用。Curtis 等［21］使用SILAC 以及無標(biāo)簽定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）之間的雙向信號通路，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中糖原動員依賴于后者中的p38α MAPK 活化，通過減少p38α 及抑制糖原磷酸化酶1（phosphoglucomutase 1， PGM1） 能 減 少 腫 瘤 轉(zhuǎn) 移。Eckert 等［22］改進(jìn)了一套非標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究流程，并對卵巢癌細(xì)胞及腫瘤基質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤蛋白質(zhì)組從原位癌到轉(zhuǎn)移的過程是穩(wěn)定的，而腫瘤基質(zhì)內(nèi)煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide N-methyltransferase，NNMT）以及其調(diào)節(jié)的幾個蛋白質(zhì)的表達(dá)量異常，NNMT的增加使組蛋白甲基化減少，促進(jìn)CAF表達(dá)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。許多研究已表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展伴隨糖基化的異常。Everest-Dass 等［23］在福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）切片上特定的組織區(qū)域使用N-酶苷酶F 預(yù)處理，再用多孔石墨化碳液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜（porous graphitized carbon liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，PGLC-ESI-MS/MS）和MALDI-MSI 可以分別得到經(jīng)過N-糖基化加工的蛋白質(zhì)的豐度和空間分布信息，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞表面和分泌蛋白中含有復(fù)雜的多聚甘露糖結(jié)構(gòu)，同時許多患者血清中也發(fā)現(xiàn)了抗多聚甘露糖結(jié)構(gòu)的抗體。

4.2.2 耐藥性 上皮性卵巢癌對化學(xué)治療（化療）比較敏感，多采用鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方法，但大多數(shù)高級別漿液性卵巢癌患者對鉑類會產(chǎn)生抗藥性并出現(xiàn)復(fù)發(fā)，僅約15%的患者能保持10 年以上不出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。Coscia 等［24］采用質(zhì)譜定量分析了對鉑敏感及對鉑耐藥患者的腫瘤組織蛋白質(zhì)，并通過對蛋白質(zhì)磷酸化和相互作用的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤-睪丸抗原45（cancer/testis antigen 45，CT45）能調(diào)節(jié)磷酸化酶4的活性，增加DNA損傷和對鉑的敏感性，CT45 衍生的人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）肽段還能使腫瘤細(xì)胞被T 細(xì)胞識別并殺滅。Zhang 等［25］發(fā)現(xiàn)含硫氧還原蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白 17 （thioredoxin domain-containing protein 17，TXNDC17）的高表達(dá)與紫杉醇耐藥性有關(guān)，可以增加卵巢癌細(xì)胞自噬體形成從而使紫杉醇的殺傷力降低。上述腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物見表3。

表3 卵巢癌相關(guān)生物標(biāo)志物Tab 3 Biomarkers of ovarian cancer

5 EC

全世界每年約7.6 萬女性因EC 而死亡，病死率及新增病例的不斷增加使其成為影響女性健康的重要疾病。子宮體腫瘤絕大部分是EC，起源于子宮內(nèi)膜腺上皮。EC的發(fā)生發(fā)展過程主要為：正?；蛭s的子宮內(nèi)膜腺上皮在雌激素作用下過度增生，隨著異性細(xì)胞不斷積累而出現(xiàn)不典型增生，最后發(fā)展為低級別或高級別EC。后期如發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），會進(jìn)一步發(fā)生轉(zhuǎn)移。早期EC 的存活率較高，因此早期診斷和早期治療可以極大改善EC 患者的預(yù)后。

5.1 血漿

近年來，針對外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循 環(huán) 腫 瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA）、蛋白質(zhì)及細(xì)胞外泌體等腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的研究較多。因樣本容易獲得，外周血中的生物標(biāo)志物檢測在EC 早期診斷中被寄予厚望。目前發(fā)現(xiàn)的潛在血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物包括：①內(nèi)分泌激素：催乳素（prolactin，PRL）、 促 卵 泡 生 成 素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）。②補(bǔ)體：補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4A。③癌相關(guān)抗原：CA125。④血漿脂蛋白：載脂蛋白A（apolipoprotein A，ApoA）。 ⑤酶 類： 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶 （matrix metalloproteinases， MMP）。 ⑥酶 抑 制 劑： HE4、SERPINA1等。需要注意其中有些蛋白，如脂蛋白，可能與EC 風(fēng)險因素之一的肥胖相關(guān)，但用于診斷還需進(jìn)一步驗(yàn)證［26］。HE4 和CA125 已經(jīng)多次被驗(yàn)證在EC 患者血清中含量增加，其中HE4 對EC 檢測的靈敏度為31.5%～78.8%，特異度為65.5%～100%，兩者組合并不顯著提高HE4 的靈敏度［27］。在未來研究中，采取多種預(yù)測潛力較大的蛋白組合建立診斷模型，能進(jìn)一步提高癌癥高風(fēng)險人群中篩查效率及準(zhǔn)確性。一項(xiàng)以前列腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌篩查試驗(yàn)為基礎(chǔ)設(shè)計的巢式病例對照研究，從納入篩查試驗(yàn)的人群中篩選出112 例患EC 的絕經(jīng)后女性作為病例組并匹配出112例對照組，通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析診斷前的血清樣本，初步篩選出病例組及對照組有差異的蛋白質(zhì)，通過回歸分析找到6種有潛在高預(yù)測能力的蛋白質(zhì)，并根據(jù)抽血與確診EC的時間來綜合評價其預(yù)測能力［28］。

5.2 尿液

尿液標(biāo)本以其非侵入性、價格低廉、易獲取的優(yōu)點(diǎn)，很適合作為檢測樣本。尿液中含量異常的蛋白質(zhì)，如鈣黏 著 蛋 白-1 （cadherin-1， CDH1）、 玻 連 蛋 白（vitronectin， VTN） 和硫酸乙酰肝素蛋白多糖2（heparan sulphate proteoglycan 2，HSPG2）有希望成為潛在的生物標(biāo)志物［29］。Mu 等［30］通過表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（surface-enhanced laser desorption ionization time of flight，SELDI-TOF）檢測到質(zhì)荷比為1 201和1 449的肽段，其鑒別EC、卵巢癌、CC的靈敏度和特異度均為100%。但尿液中的蛋白質(zhì)濃度變化大，依賴腎臟代謝，且存在易被陰道分泌物污染等因素，作為生物標(biāo)志物仍有局限性。

5.3 內(nèi)膜組織

90%的EC 患者有異常子宮出血（abnormal uterine bleeding，AUB）的癥狀，有AUB癥狀的患者僅5%～10%患有EC，這表明大量患有良性疾病的女性需要排除EC。目前較常規(guī)的方法是陰道超聲和診斷性刮宮術(shù)。宮腔吸片通過塑料管吸取宮腔內(nèi)的脫落細(xì)胞來篩查EC，與診斷性刮宮術(shù)相比，患者痛苦小且易于接受，但取材不夠全面，活檢結(jié)果與最終子宮切除標(biāo)本病理結(jié)果差異較大。Martinez-Garcia 等［31］通過對宮腔吸片中的液體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，在患者中找到連環(huán)素β1 （catenin beta 1，CTNB1）等3種蛋白質(zhì)的表達(dá)增高，并證明這3種蛋白組合可以提高宮腔吸片對EC 組織類型和等級的診斷，以及術(shù)前評估的準(zhǔn)確性。

子宮內(nèi)膜組織樣本的蛋白質(zhì)組檢測能有助于研究EC的發(fā)生發(fā)展過程并找到潛在的治療靶點(diǎn)。一項(xiàng)研究［32］對正常子宮內(nèi)膜、復(fù)雜性子宮內(nèi)膜增生、非典型性子宮內(nèi)膜增生以及EC 的組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CAH1）和肽基脯氨酰異構(gòu)酶B（peptidylprolyl isomerase B，PPIB）在疾病進(jìn)展中的含量遞增，說明這些蛋白可能與子宮內(nèi)膜病變進(jìn)展有關(guān)。通過多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在高復(fù)發(fā)風(fēng)險EC 患者中，循環(huán)中細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）與微環(huán)境作用形成轉(zhuǎn)移灶的過程中，可溶性半乳糖凝素3 結(jié)合蛋白（lectin galactoside-binding soluble 3 binding protein，LGALS3BP）含量明顯增高。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，有臨床應(yīng)用潛力的EC 生物標(biāo)志物逐漸被發(fā)現(xiàn)，EC的生物標(biāo)志物如表4所示。

6 CC

CC 是婦科最常見的惡性腫瘤，由宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）進(jìn)展而來。大多數(shù)CC 與 人 乳 頭 瘤 病 毒HPV （human papilloma virus，HPV）感染有關(guān)，其中70%由HPV16 和HPV18 引起。CIN 分為3 級，反映CIN 發(fā)生發(fā)展的連續(xù)病理過程。在細(xì)胞學(xué)篩查分類中，CINⅠ對應(yīng)低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL），高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）包括CINⅡ、CINⅢ和原位癌。

表4 EC相關(guān)生物標(biāo)志物Tab 4 Biomarkers of EC

20 世紀(jì)50 年代以來，子宮頸細(xì)胞學(xué)篩查和HPV DNA檢測的普遍應(yīng)用，使CC和CIN患者得到早期發(fā)現(xiàn)和治療，CC 的發(fā)病率及病死率有了明顯下降；并且隨著HPV 疫苗的逐步推廣，CC 可望成為一種可以預(yù)防的腫瘤。但是，CIN 發(fā)病率的降低，會導(dǎo)致LSIL、HSIL 及惡性病變細(xì)胞學(xué)篩查的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值下降，未來可能不適合早期CC 的篩查［33］。在發(fā)展中國家和地區(qū)，宮頸細(xì)胞學(xué)篩查存在普及率低、費(fèi)用高、病理診斷主觀因素大等問題。

6.1 宮頸陰道液

宮頸陰道液（cervical vaginal fluid，CVF）與癌組織或癌前組織直接接觸，許多重要的CC 生物標(biāo)志物濃度在CVF 中會很高，且CVF 不接觸其他組織，是較為理想的樣本來源。通過棉簽、刷子等工具自行采集CVF，再進(jìn)行后續(xù)的DNA 基因分型、免疫組化等檢測，能更方便女性參與CC 篩查。Arbyn 等［34］進(jìn)行的meta 分析驗(yàn)證了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的HPV 自檢測的可行性。但由于HPV 檢測需要專業(yè)技術(shù)和設(shè)備，因此推廣受限。在對健康女性和高危型、低危型HPV 感染者的CVF 樣本檢測中，其中α-輔肌動蛋白4（actinin alpha 4，ACTN4）是最有希望的CC 癌前狀態(tài)的潛在標(biāo)志物。ACTN4 被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中過度表達(dá)，主要起到促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，還參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色質(zhì)重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄。有研究以基于LC-MS/MS 的非標(biāo)記定量法對CC 不同階段患者的蛋白質(zhì)組進(jìn)行檢測，來反映CIN 的疾病進(jìn)展程度，并建立相應(yīng)的統(tǒng)計模型，分別將HSIL 患者和CC 患者，正常對照及LSIL 患者進(jìn)行鑒別診斷，靈敏度為77%～100%，特異度為94%～100%［35］。

6.2 血漿

有研究［36］將CC 發(fā)生過程中各個病變階段的血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較尋找表達(dá)差異的蛋白質(zhì)。同時對健康對照、LSIL、HSIL、CC 患者治療前后的血漿樣本進(jìn)行分析，包含類黏蛋白2（orosomucoid 2，ORM2）在內(nèi)的5種蛋白質(zhì)標(biāo)志物在LSIL 和HSIL 組表現(xiàn)出明顯的差異表達(dá)，可作為CC 進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物。與治療前相比，治療后患者的補(bǔ)體因子I（complement factor I，CFI）蛋白水平明顯下降，表明其對療效具有預(yù)測價值。所有這些不同表達(dá)的蛋白質(zhì)都與補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血級聯(lián)系統(tǒng)相關(guān)。另一項(xiàng)研究［37］通過比較健康對照、LSIL、HSIL、CC 患者血液中絲氨酸殘基的磷酸化修飾特征，發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾蛋白隨著疾病進(jìn)展而呈現(xiàn)遞增趨勢，提示異常磷酸化可能參與CC的病變過程。CC生物標(biāo)志物見表5。

表5 CC相關(guān)生物標(biāo)志物Tab 5 Biomarkers of CC

7 展望

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，蛋白質(zhì)組學(xué)被應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，成為尋找疾病分子標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一。然而，盡管已發(fā)現(xiàn)許多在疾病發(fā)展過程中可能產(chǎn)生作用的分子，但是其確切的功能及應(yīng)用價值仍然需要進(jìn)一步研究。此外，由于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法不同、樣本差異等原因往往導(dǎo)致研究可重復(fù)性較低。

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法眾多，各有優(yōu)勢和局限，需重視各種方法間的整合和互補(bǔ)，以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的特征［2］，其與基因組學(xué)、生物信息學(xué)交叉的研究模式成為未來發(fā)展的方向。

綜上所述，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，讓許多婦科疾病的研究取得新的進(jìn)展，并找到許多潛在生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有望實(shí)現(xiàn)腫瘤篩查的自檢，也有可能發(fā)展出基于人體蛋白質(zhì)組信息的精準(zhǔn)醫(yī)療模式。