基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠的構(gòu)建及其特征研究

蔡傳棟，王 非，崔文國，范存義，劉 珅

1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科，上海200233；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院骨科，上海市傷骨科研究所，上海市中西醫(yī)結(jié)合防治骨與關(guān)節(jié)病損重點(diǎn)實驗室，上海200025

肌腱粘連是肌腱損傷及其修復(fù)術(shù)后的常見并發(fā)癥，發(fā)病率可達(dá)60%，嚴(yán)重影響患者的肢體活動［1］。目前，肌腱粘連的治療常常需要通過手術(shù)松解、切除粘連組織，但是術(shù)后仍有再次粘連的可能，進(jìn)而形成“粘連-松解-再粘連”的惡性循環(huán)［2］。在松解治療過程中，應(yīng)用生物材料制成的防粘連膜包裹手術(shù)修復(fù)的肌腱，可以起到物理阻隔的作用，防治肌腱粘連；但是目前的生物材料防粘連膜作用單一、療效較差且易引發(fā)炎癥，限制其臨床應(yīng)用［3-4］。

非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）可以通過抑制環(huán)氧合酶的活性，減少前列腺素2的合成，從而抑制局部白細(xì)胞的聚集，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到抑制肌腱粘連的效果［5］。與羅非考昔等選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑相比，作為NSAIDs之一的布洛芬（ibuprofen，IBU）能同時抑制環(huán)氧合酶-1 和環(huán)氧合酶-2，因而具有更好的抑制粘連的作用［6］。然而，肌腱損傷部位血供受到破壞，限制了IBU的全身用藥；因此，局部使用IBU來減輕過度炎癥反應(yīng)，是防治肌腱粘連的一個重要方法。本課題組在前期研究中構(gòu)建了載IBU防粘連膜，該膜能夠減輕肌腱損傷修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng)，提高防粘連效果［7］。但是該膜的IBU釋放屬于被動釋放，不能按需精確釋放藥物；此外，IBU在水中的溶解度很低，限制了其在體液中的擴(kuò)散，不利于IBU進(jìn)入細(xì)胞［8］。因此，制備能夠按需釋放藥物的防粘連膜，并提高IBU的溶解度，對于更好地發(fā)揮IBU抗炎、防粘連的作用尤為重要。

在防粘連膜的生物材料中，水凝膠可以有效地阻隔粘連組織，并可作為藥物緩釋的良好載體。水凝膠的微孔結(jié)構(gòu)允許肌腱內(nèi)外側(cè)的營養(yǎng)物質(zhì)交換，從而促進(jìn)肌腱的內(nèi)源性愈合［9］。近年來，生物敏感性可降解水凝膠作為一類既可用于生物治療（載DNA、siRNA、蛋白質(zhì)和多肽），又可用于藥物釋放的生物醫(yī)用材料，日益受到人們的重視［10］。在肌腱粘連形成過程中，炎癥階段往往伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）含量的上調(diào)［11］，使得MMP 可以成為一個合適的引發(fā)藥物響應(yīng)釋放的“觸發(fā)器”。明膠（gelatin，Gel）是一類生物相容性較好的天然高分子［12］，分子鏈上有可被MMP水解的位點(diǎn)［13］；利用Gel 構(gòu)建水凝膠材料可實現(xiàn)對疾病微環(huán)境響應(yīng)性降解?；诖?，本研究將IBU與第4代樹枝狀大分子聚酰胺-胺（generation 4 polyamindoamine，G4 PAMAM）結(jié)合后形成復(fù)合物（G4 PAMAM-IBU），包載于具有MMP 響應(yīng)性的甲基丙烯酸酯明膠（methacrylate gelatin，GelMA）水凝膠中，從而形成按需給藥的“疾病觸發(fā)-藥物釋放-治療疾病”的循環(huán)體系，然后研究該水凝膠對成纖維細(xì)胞增殖的影響，驗證其防粘連作用，為防止肌腱粘連、控制炎癥及促進(jìn)患肢功能康復(fù)提供新的治療方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

IBU（CAS 15687-27-1）、Gel（CAS 9000-70-8）、甲基丙烯酸酐［methacrylic anhydride（MA），CAS 760-93-0］、苯基-2，4，6-三甲基苯甲?；鶃喠姿徜圎}［lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate （LAP），CAS 85073-19-4］購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，G4 PAMAM購自威海晨源分子材料有限公司，透析袋（截留相對分子質(zhì)量為1 000或3 500）購自上海源葉生物科技有限公司，MMP2（SRP3118）購自上海希格瑪高技術(shù)有限公司，大鼠成纖維細(xì)胞208F購自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清（C0227）、CCK-8 試劑盒（C0037）購自上海碧云天生物技術(shù)公司，活/死細(xì)胞染色試劑盒（40747ES76/80）購自上海翊圣生物科技有限公司。紫外分光度光度計（Biospectrophotometer，AG6135）購自德國Eppendorf 公司，掃描電子顯微鏡（簡稱掃描電鏡，Sirion 200）購自美國FEI公司，倒置熒光顯微鏡（TI2-U）購自日本Nikon公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 G4 PAMAM-IBU的制備與藥物釋放檢測

準(zhǔn)確稱量2 mg IBU 粉末，溶解于1 mL G4 PAMAM溶液（2 mg/mL） 中，密封后超聲振蕩8 h 使IBU 與G4 PAMAM 形成G4 PAMAM-IBU。將所得溶液用蒸餾水將IBU稀釋至3、6、9、12、18、24、30 μg/mL的濃度梯度。以紫外分光光度計檢測其紫外吸收光譜并繪制G4 PAMAM-IBU 濃度- 吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將G4 PAMAM 配成不同濃度的水溶液，分別加入足夠量的IBU，密封后超聲振蕩8 h，將所得溶液于4 ℃高速冷凍離心機(jī)中離心5 min（5 000×g），取上清液并再次離心5 min（5 000×g），此時上清液即為相應(yīng)濃度G4 PAMAM的IBU 飽和溶液。以紫外分光光度計測定其吸光度值并用G4 PAMAM-IBU標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IBU的飽和濃度。

將含IBU 2 mg/mL 的G4 PAMAM-IBU 溶液稀釋至200 μg/mL，取稀釋后溶液100 μL 加入透析袋（截留相對分子質(zhì)量為1 000），之后將透析袋密封，置于20 mL去離子水中，于不同時間點(diǎn)取透析袋外液1 mL 測定紫外吸光度值，并重新補(bǔ)充1 mL 去離子水。根據(jù)所測得紫外吸光度值計算G4 PAMAM-IBU 的IBU 釋放質(zhì)量以及累計釋放率。

1.3 G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠的制備與特征檢測

通過Gel 與MA 的加成反應(yīng)合成甲基丙烯酸酯明膠（methacrylate gelatin，GelMA）。簡言之，將10 g Gel 以10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，緩慢加入5 mL MA，于60 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h，期間保持溫度不變。待反應(yīng)結(jié)束后，過濾溶液并放入透析袋（截留相對分子質(zhì)量為3 500）中透析3 d。透析完成后冷凍干燥即可得到白色泡沫狀的GelMA固體，將產(chǎn)物置于-20 ℃恒溫冰箱中保存。

使用生物相容性較好的LAP 作為光引發(fā)劑。將GelMA、LAP 及G4 PAMAM-IBU 分 別 以5%、0.3% 及0.15%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶解于去離子水中得到GelMA 預(yù)凝膠溶液，將此溶液暴露于365 nm 紫外光下15 s 即可得到載G4 PAMAM-IBU的GelMA水凝膠。

將所得100 μL 的水凝膠浸泡于0.1 μg/mL MMP2 溶液中48 h后取出，并與新制備的G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠進(jìn)行冷凍干燥。將凍干的水凝膠噴金后用加速電壓5 kV 的掃描電鏡觀察被MMP 降解前后的G4 PAMAMIBU/GelMA水凝膠的內(nèi)部微觀形態(tài)。

1.4 G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠的藥物釋放檢測

取200 μL GelMA 預(yù)凝膠溶液，經(jīng)紫外光交聯(lián)后成膠。將所得水凝膠置入含2 mL 去離子水的透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為1 000），密封透析袋后放入18 mL 含0.1 μg/mL 的MMP2 溶液中，3 d 內(nèi)于不同時間點(diǎn)取透析袋外液1 mL測定紫外吸光度值，并重新補(bǔ)充1 mL 0.1 μg/mL 的MMP2 溶液。根據(jù)所測得紫外吸光度值和IBU 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠中的IBU釋放質(zhì)量以及累計釋放率。

1.5 細(xì)胞實驗

1.5.1 G4 PAMAM-IBU 對細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度的空白G4 PAMAM 培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞增殖的影響，并選擇合適的濃度以排除其干擾作用。使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基預(yù)先于96孔板中培養(yǎng)208F 細(xì)胞（2 000 個/孔），待細(xì)胞貼壁后更換為含不同濃度G4 PAMAM 的DMEM 培養(yǎng)基，并以繼續(xù)使用DMEM培養(yǎng)的208F 細(xì)胞作為空白對照組。培養(yǎng)48 h 后，使用CCK-8試劑盒檢測208F細(xì)胞的活力，操作按說明書進(jìn)行。

選擇合適的G4 PAMAM 濃度，制備G4 PAMAMIBU。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將G4 PAMAMIBU 按IBU 濃 度 分 別 配 置 為100、150、200、250、300 μg/mL 的含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)已貼壁的208F 細(xì)胞；同時以含相同濃度IBU（以1%二甲基亞砜溶解）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞作為對照。培養(yǎng)48 h 后，使用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞的活力。

1.5.2 G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠對細(xì)胞增殖的影響 將208F 細(xì)胞（10 000 個/孔）接種于24 孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板下層，以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞充分貼壁后，在Transwell 培養(yǎng)板上層放入200 μL 空白GelMA 水凝膠、載G4 PAMAM-IBU（G4 PAMAM 為1 mg/mL，IBU 為500 μg/mL） 或 單 獨(dú)IBU（IBU 為500 μg/mL）的GelMA 水凝膠；并將3 種水凝膠分別浸于含0.1 μg/mL MMP2 的培養(yǎng)基（GelMA+MMP組、G4 PAMAM-IBU/GelMA+MMP 組和IBU/GelMA+MMP 組） 與不含MMP2 的培養(yǎng)基中（GelMA 組、G4 PAMAM-IBU/GelMA 組和IBU/GelMA 組）。將Transwell培養(yǎng)板上層沒有水凝膠的細(xì)胞組設(shè)為對照組。

將 GelMA 組、 IBU/GelMA、 G4 PAMAM-IBU/GelMA 組、G4 PAMAM-IBU/GelMA+MMP 組 細(xì) 胞 于Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)48 h 后，移除上層小室，用PBS 充分洗滌細(xì)胞2 次，將配置好的活/死細(xì)胞染色溶液（將20 μL 鈣黃綠素和40 μL 碘化丙啶加入10 mL PBS中并充分混勻） 250 μL 加入各孔中，室溫避光孵育30 min 后吸除染色液并用PBS 洗滌細(xì)胞，通過倒置熒光顯微鏡觀察。

將7 組細(xì)胞于Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)24 h 和72 h 后，移除上層小室，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入500 μL培養(yǎng)基和50 μL CCK-8試劑，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h。隨后用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 下各孔的吸光度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計，定量資料以x±s 表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IBU與G4 PAMAM的結(jié)合與解離特征

G4 PAMAM 表面的樹枝狀氨基可以與IBU 相結(jié)合（圖1A）。通過紫外分光光度計測量純IBU 在水中的溶解度以及IBU 與G4 PAMAM 結(jié)合后在水中的溶解度。室溫下IBU 溶解度約為85 μg/mL；IBU 與G4 PAMAM 結(jié)合后，隨著G4 PAMAM 濃度的增加，IBU 溶解度也隨之增加，其中當(dāng)G4 PAMAM 濃度為5 mg/mL 時，IBU 溶解度達(dá)到3 942 μg/mL，說明G4 PAMAM 與IBU 結(jié)合可提高IBU在水中的溶解度（圖1B）。

通過透析袋釋放試驗對G4 PAMAM-IBU 的藥物釋放速度進(jìn)行研究。分子量較小的IBU 可以通過透析袋進(jìn)入外液，而分子量較大的G4 PAMAM 則被截留于袋中。在12 h 內(nèi)，超過80%的IBU 與G4 PAMAM 解離，表明IBU與G4 PAMAM 結(jié)合后，由于IBU 的溶解度提高且被包裹在G4 PAMAM 內(nèi)，可以逐漸釋放至溶液中，較單純?nèi)芙獾腎BU相比，可以發(fā)揮緩釋作用（圖1C）。

圖1 IBU與G4 PAMAM的結(jié)合與解離表征Fig 1 Characterization of combination and dissociation of G4 PAMAM-IBU

2.2 MMP 響應(yīng)性G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠的特征

GelMA 分子鏈上含有可被MMP 特異性水解的位點(diǎn)，因此被MMP處理后，GelMA水凝膠結(jié)構(gòu)會逐漸降解（圖2A）。G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠與GelMA 水凝膠冷凍干燥后經(jīng)掃描電鏡觀察，2種水凝膠在微觀結(jié)構(gòu)上沒有明顯差別；經(jīng)MMP 處理后，2 種水凝膠孔隙均增大，表明水凝膠在MMP的作用下發(fā)生了降解（圖2B）。

為了研究MMP 是否可以加速G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠中IBU 的釋放，我們對該水凝膠的藥物釋放行為進(jìn)行了觀察。將該水凝膠置于透析袋中，所釋放的IBU 通過透析袋進(jìn)入外液，未被釋放的G4 PAMAMIBU 仍在袋內(nèi)的水凝膠中。與未添加MMP 相比，添加MMP 可以明顯加速水凝膠中IBU 的釋放，在72 h 內(nèi)即可完成超過70% 的藥物釋放， 說明MMP 可加速G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠中IBU的釋放（圖2C）。

2.3 G4 PAMAM-IBU對成纖維細(xì)胞增殖的影響

圖2 MMP所致GelMA水凝膠的降解及G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠中IBU的響應(yīng)性釋放Fig 2 MMP-induced GelMA hydrogel degradation and MMP-responsive IBU release from G4 PAMAM-IBU/GelMA hydrogel

要研究G4 PAMAM-IBU 對細(xì)胞增殖的抑制能力，首先要排除G4 PAMAM 對細(xì)胞增殖的干擾。采用不同濃度的G4 PAMAM孵育細(xì)胞48 h后，隨著G4 PAMAM濃度的增加，其對細(xì)胞抑制增殖效果也隨之上升。當(dāng)G4 PAMAM 濃度為100 和200 μg/mL 時，其抑制增殖效果與對照組（0 μg/mL）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到300 μg/mL 以上，G4 PAMAM 開始顯現(xiàn)抑制增殖的作用（均P<0.05）（圖3A）。因此選用200 μg/mL G4 PAMAM進(jìn)行后續(xù)實驗。

與相同濃度的IBU 相比，與G4 PAMAM 結(jié)合的IBU抑制細(xì)胞增殖的作用顯著提高。與空白對照組相比，單純的IBU濃度需達(dá)到300 μg/mL才具有抑制細(xì)胞增殖的能力，而G4 PAMAM-IBU 中IBU 的濃度為100 μg/mL 時就可明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖（圖3B）。

圖3 G4 PAMAM與G4 PAMAM-IBU對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 3 Inhibitory effects of G4 PAMAM and G4 PAMAM-IBU on cell proliferation

2.4 G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠對成纖維細(xì)胞增殖的影響

水凝膠與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后，GelMA 組細(xì)胞情況良好，活細(xì)胞多，幾乎未見死細(xì)胞，說明GelMA 水凝膠的生物相容性較好。與IBU/GelMA 組相比，G4 PAMAM-IBU/GelMA 組活細(xì)胞數(shù)量減少，死細(xì)胞數(shù)量增多；G4 PAMAM-IBU/GelMA 組添加MMP 后，活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，死細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多（圖4A），說明G4 PAMAM-IBU 的抑制細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于單純IBU，且加入MMP 會促進(jìn)G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠釋放G4 PAMAM-IBU，從而更好地發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

使用CCK-8試劑盒定量檢測G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠在共培養(yǎng)24 h 與72 h 時抑制成纖維細(xì)胞增殖的能力，GelMA 組與GelMA+MMP 組抑制效果與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。當(dāng)水凝膠載IBU 或G4 PAMAM-IBU 后，開始顯現(xiàn)其抑制增殖的能力，且添加MMP 后，由于水凝膠內(nèi)含藥物釋放加快，抑制效果增強(qiáng)。與IBU/GelMA 組相比，G4 PAMAM-IBU/GelMA 組抑制成纖維細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng)（圖4B）。

圖4 MMP響應(yīng)性G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝膠對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 4 Inhibitory effect of MMP-responsive G4 PAMAM-IBU/GelMA hydrogel on cell proliferation

3 討論

肌腱損傷后，為抑制肌腱周圍粘連組織生成，使用IBU 來減輕過度的炎癥反應(yīng)是一項重要的治療方法［14］。然而，IBU為脂溶性藥物，在體液中擴(kuò)散較慢，局部使用效果不佳。使用藥物載體增加藥物的溶解性可有效地避免此類問題。其中，樹枝狀大分子可將藥物包裹在其內(nèi)部的孔隙中，并與藥物形成納米粒子，從而顯著提高藥物的溶解性［15-16］。

本研究將IBU 包裹于樹枝狀大分子G4 PAMAM 內(nèi)構(gòu)成G4 PAMAM-IBU，使IBU 的溶解度顯著提高；且IBU在12 h 內(nèi)逐漸解離，與單純的IBU 相比，有利于IBU 在局部緩慢釋放，發(fā)揮長效作用。體外實驗證明，G4 PAMAM 不僅可以提高IBU 的溶解度，還有利于IBU發(fā)揮其抑制成纖維細(xì)胞增殖的作用。當(dāng)IBU 的濃度相同時，G4 PAMAM-IBU 的抑制增殖效果更強(qiáng)，這可能是由于G4 PAMAM 表面的氨基正電荷可與帶負(fù)電的細(xì)胞膜加強(qiáng)接觸，促進(jìn)G4 PAMAM-IBU 復(fù)合物入胞并釋放其包含的IBU 發(fā)揮藥理作用［17］；此外，有研究［18］表明，該類樹枝狀大分子可以降低藥物的細(xì)胞內(nèi)清除率，延長藥物的作用時間，進(jìn)一步證實了G4 PAMAM 作為藥物載體的優(yōu)越性。

為實現(xiàn)IBU 在局部的按需釋放，增加IBU 局部的緩釋效果，我們將G4 PAMAM-IBU 包載于具有MMP 響應(yīng)性的GelMA 水凝膠中。 在MMP 存在的條件下，G4 PAMAM-IBU可在72 h從水凝膠體系內(nèi)釋放超過70%；因此該制劑有望實現(xiàn)在肌腱損傷的早期炎癥期（高M(jìn)MP）釋放IBU 來發(fā)揮作用。之后，我們對G4 PAMAM本身的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行研究，將安全濃度的G4 PAMAM 與IBU 結(jié)合，裝載至GelMA 水凝膠中。體外實驗證實，G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝膠可以有效地抑制成纖維細(xì)胞的增殖。同時，相同IBU 濃度的情況下，與IBU/GelMA組相比，G4 PAMAM-IBU/GelMA組抑制細(xì)胞增殖作用更強(qiáng)，印證了之前的實驗結(jié)論。此外，培養(yǎng)基中添加MMP 后，由于GelMA 水凝膠發(fā)生降解，所載藥物釋放加快，從而增強(qiáng)了IBU抑制增殖的效果。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種載G4 PAMAM-IBU 的GelMA 水凝膠并觀察了其體外抑制成纖維細(xì)胞增殖的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該水凝膠可在模擬體內(nèi)炎癥條件下釋放IBU，發(fā)揮其抑制成纖維細(xì)胞增殖的作用，在防治肌腱粘連方面具有一定的應(yīng)用前景。