一株肉葡萄球菌的降鎘特性與機制研究

董華煜,王然然,仇夢真,李國旻,徐俊南,李軍,樊明濤,魏新元

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌,712100)

社會的快速發(fā)展,加大了對于各種自然資源的開發(fā)和利用,導(dǎo)致了環(huán)境污染的不斷惡化,給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了巨大的威脅。其中鎘是一種常見的環(huán)境重金屬污染物,主要來源于礦物開采、化肥生產(chǎn)、冶煉和電鍍工業(yè)[1]。鎘即使在低濃度下也具有毒性,極易通過食物鏈在人體中積累,其誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧,可對人體肝腎、大腦功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害[2]。因此,鎘被國際癌癥研究機構(gòu)歸類為Ⅰ類致癌物。降低環(huán)境中的鎘成為了一個亟待解決的問題。

目前,處理重金屬鎘的方法主要有離子交換、電化學(xué)處理和膜過濾等物理和化學(xué)方法[3]。然而,這些方法在面對處理低濃度(<100 mg/L)的重金屬時存在著成本高,難以操作,效果不佳等問題[4]。生物修復(fù)的應(yīng)用,特別是微生物修復(fù)的應(yīng)用,有效地解決了這些問題。與物理化學(xué)方法相比,微生物法具有成本低,易操作等優(yōu)點;與其他生物修復(fù)相比,微生物具有來源廣泛,易獲得,易培養(yǎng),生長迅速和適應(yīng)性強的優(yōu)勢,引起了研究人員的廣泛關(guān)注[5]。

乳酸菌,作為普遍認(rèn)為安全的益生菌,在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。越來越多的研究表明許多乳酸菌具有良好的重金屬的耐受性和吸附特性,而且相較于其他菌株,乳酸菌更加的安全,對人體無害,因而在生物修復(fù)方面展現(xiàn)了巨大的潛力[6]。ZHAI等[7]從33株乳酸菌中篩選出了一株植物乳桿菌CCFM8610,發(fā)現(xiàn)其具有較好的鎘耐受性和鎘結(jié)合能力。KIRILLOVA等[8]測定了10株乳酸菌的降鎘能力,得到了具有降鎘能力的4株植物乳桿菌和3株發(fā)酵乳桿菌,其對培養(yǎng)基中的鎘有不同程度的降低效果(4%～16%)。陳宇凌等[9]對從四川自制泡菜汁中篩選出的高耐鎘綠色魏斯菌ZY-6的吸附特性進行了研究,發(fā)現(xiàn)其對鎘、鉛、銅和錳都有一定的吸附能力。SHU等[10]篩選出一株具有良好鎘耐受性和降鎘能力(51%)的發(fā)酵乳桿菌L19,并將其接種到果汁中,發(fā)現(xiàn)其對番茄汁和蘋果汁中的鎘具有較好的去除效果。由此可見,不同的乳酸菌菌株對于鎘的耐受能力和降低能力也有所不同。而且目前對于乳酸菌降重金屬的機理仍不完全清楚,不同的菌株降重金屬的機制存在差異;一種菌株的降重金屬過程可能涉及多種機制。因此,對于具有良好重金屬耐受性和降低能力的乳酸菌菌株的發(fā)掘和機制的研究仍有很大的前景。

前期在對本實驗室保藏的分離自市售發(fā)酵食品中的乳酸菌菌株進行耐鎘菌的篩選,得到一株在固體培養(yǎng)基上具有良好耐鎘能力(1 000 mg/L)的肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)846。肉葡萄球菌是一種食品級菌株,廣泛應(yīng)用于發(fā)酵肉制品中[11]。此次篩選出的肉葡萄球菌846分離自湖南煙熏豬肉,并已通過安全性試驗[12]。過往少有關(guān)于肉葡萄球菌降Cd2+方面的報道,在此,本研究對該株肉葡萄球菌的降鎘特性和降鎘機制進行了的探究,以期為乳酸菌處理重金屬的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)846,保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物與生物技術(shù)實驗室。

1.1.2 試驗試劑

氯化鎘(分析純),上海麥克林生化科技有限公司;MRS肉湯,北京陸橋技術(shù)股份有限公司;溴化鉀(色譜純)、25%戊二醛,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;PBS溶液,廈門海標(biāo)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NRY-2102型搖床培養(yǎng)箱,上海南榮實驗室設(shè)備有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;pH計,上海雷磁儀器廠;ZEEnit 700P原子吸收光譜儀,德國耶拿分析儀器股份公司;Nano SEM-450場發(fā)射掃描電子顯微鏡,美國FEI公司;SCIENTZ-12 N/A冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Vertex70傅里葉變換紅外光譜,德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉葡萄球菌846降鎘特性試驗

1.3.1.1 CdCl2母液的制備

準(zhǔn)確稱取1.631 g CdCl2溶于去離子水中,定容至200 mL,配制成含Cd2+質(zhì)量濃度為5 000 mg/L的母液,經(jīng)0.22 μm無菌過濾器過濾,備用。

1.3.1.2 二價鎘離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

Cd2+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考雷蕾[13]的方法,并略有改動。將CdCl2母液稀釋至50 mg/L的Cd2+溶液,然后再配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用火焰原子吸收分光光度計(波長:228.8 nm;工作電流:3 mA)分別測定其對應(yīng)吸光值A(chǔ),以Cd2+濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制Cd2+標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出吸光度值與Cd2+濃度關(guān)系的一元線性回歸方程。

1.3.1.3 肉葡萄球菌846降鎘能力的測定

將肉葡萄球菌846進行復(fù)壯、活化,擴大培養(yǎng)至對數(shù)期中后期,離心收集菌體(5 000×g,10 min,4 ℃),用PBS溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)漂洗2次,得到肉葡萄球菌菌體,然后制成10 g/L(干重)的菌懸液,備用。將Cd2+溶液母液稀釋至100 mg/L,備用。將菌懸液與Cd2+稀釋液混合于150 mL無菌錐形瓶,并調(diào)節(jié)pH,使其菌體終濃度為1 g/L(干重),Cd2+終質(zhì)量濃度為50 mg/L,pH為6.0。在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)(120 r/min,37 ℃)24 h,離心(5 000×g,10 min,4 ℃)得到上清液,去離子水稀釋40倍,使用火焰原子吸收分光光度計,采用與繪制Cd2+標(biāo)準(zhǔn)曲線相同方法測定Cd2+的濃度。Cd2+的降低率(%)和單位質(zhì)量菌體對Cd2+的降低質(zhì)量(mg/g)的計算如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:C0,Cd2+溶液初始濃度,mg/L;C1,降鎘試驗后Cd2+的濃度,mg/L;CSt,溶液中肉葡萄球菌的濃度,g/L。

1.3.1.4 不同因素對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響

a)pH值對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響:分別將菌懸液與Cd2+溶液母液混合于150 mL錐形瓶,pH分別調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,使Cd2+終質(zhì)量濃度為50 mg/L,菌體干重終濃度為1.0 g/L,37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,測定上清液中Cd2+的濃度。

b)Cd2+濃度對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響:分別將菌懸液與Cd2+溶液母液混合于150 mL錐形瓶,分別調(diào)節(jié)Cd2+終濃度為25、50、75、100、125 mg/L,pH為6.0,菌體干重終濃度為1.0 g/L,37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,測定上清液中Cd2+的濃度。

c)菌體濃度對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響:分別將菌懸液與Cd2+溶液母液混合于150 mL錐形瓶,分別調(diào)節(jié)菌體干重終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L,pH為6.0,Cd2+終質(zhì)量濃度為50 mg/L,37 ℃ 下振蕩培養(yǎng)24 h,測定上清液中Cd2+的濃度。

d)其他金屬離子對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響:分別將菌懸液與Cd2+溶液母液混合于150 mL錐形瓶,分別添加相同濃度的其他金屬離子Cr6+,Pb2+,Mg2+,Zn2+,pH調(diào)節(jié)至6.0,使Cd2+終質(zhì)量濃度為50 mg/L,菌體干重終濃度為1.0 g/L,37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h,測定上清液中Cd2+的濃度。

1.3.2 肉葡萄球菌846降鎘機制研究

1.3.2.1 掃描電鏡及能譜掃描分析

掃描電鏡及能譜掃描樣品的制備參考張利[14]的方法,略作改動。分別將鎘處理(條件同1.3.1.3)和未處理的菌體(Cd2+濃度為0,其他條件同1.3.1.3)離心(5 000×g,10 min,4 ℃),收集菌體。用PBS溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)洗滌2次,離心;隨后浸漬于2.5%戊二醛中固定,4 ℃下過夜。固定完成后用PBS溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)漂洗2次,每次10 min,然后梯度乙醇(30%,50%,70%,80%,90%,100%)脫水,每次10 min。最后得到的菌液滴于硅片,超臨界CO2干燥2 h,經(jīng)噴金后上鏡觀察,并使用能量色散X射線光譜儀(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDX)進行元素分析。

1.3.2.2 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜樣品的制備參考劉淼[15]的方法。收集鎘處理和未經(jīng)鎘處理的菌體,用PBS溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)洗滌2次,經(jīng)預(yù)凍后于冷凍干燥機中凍干(冷阱溫度為-80 ℃,24 h),得到菌粉。溴化鉀置于干燥箱中100 ℃干燥4 h。將溴化鉀和菌粉按照100∶1的質(zhì)量比混合研磨,進行傅里葉紅外光譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗均設(shè)置3組平行,設(shè)置不添加菌株的空白對照組。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,數(shù)據(jù)處理采用Minitab 18,圖形繪制采用Origin 2022。多批次試驗比較一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響

以Cd2+濃度為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制Cd2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得的線性回歸方程為:y=0.090 2x-0.000 7,擬合度R2=0.999 7。此標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的可靠性,符合原子吸收光譜對于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度的要求。

2.1.1 不同pH值對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響

肉葡萄球菌846在不同pH值條件下的降鎘能力如圖1所示。結(jié)果顯示,pH 5以下,隨著pH的升高,該菌株降Cd2+能力不斷增強,當(dāng)pH值為5時達(dá)到最大值[(28.823±0.953)%;(14.412±0.476) mg/g];當(dāng)pH>5時,菌體降Cd2+能力逐步下降。該結(jié)果與別人的研究結(jié)果相似,乳酸菌的生物吸附能力在pH 2～6時達(dá)到最大值[16]。pH是影響微生物處理重金屬的重要因素,其不僅影響金屬離子的價態(tài),也對細(xì)胞表面電荷及官能團有著一定的影響[17]。當(dāng)pH過低時,溶液中大量的H+會與Cd2+競爭結(jié)合位點,從而使部分Cd2+仍存在于溶液中;當(dāng)pH升高,H+開始減少,Cd2+有更多的機會與菌體結(jié)合,使得溶液中的Cd2+減少;而當(dāng)pH較高時,溶液中的OH-離子濃度增高,競爭性吸附了環(huán)境中陽離子,從而減少了菌體對Cd2+的吸附或吸收,從而導(dǎo)致Cd2+降低率和降低量的減少[14]。

圖1 不同pH值對肉葡萄球菌846降Cd2+能力的影響Fig.1 The effect of pH on the Cd2+-lowering capacity of Staphylococcus carnosus 846注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.2 不同Cd2+濃度對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響

當(dāng)肉葡萄球菌846面對濃度逐漸升高的Cd2+時,其降Cd2+率和降Cd2+量都出現(xiàn)了不同程度的下降,如圖2所示。在較低Cd2+濃度時,Cd2+有更多的機會與菌體結(jié)合位點結(jié)合,此時菌體可以充分地發(fā)揮其降金屬能力;而當(dāng)Cd2+逐漸增加時,對細(xì)胞的毒性傷害也越大,一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,在菌體數(shù)量不變的情況下,金屬結(jié)合位點可能會減少,進而導(dǎo)致菌體降Cd2+能力的下降。而當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度由25 mg/L上升為50 mg/L時,菌體降Cd2+量沒有顯著變化;高于50 mg/L時,降Cd2+量出現(xiàn)了顯著的降低;由此可以推測,在這種條件組合下,肉葡萄球菌846結(jié)合位點在Cd2+質(zhì)量濃度在25～50 mg/L時達(dá)到飽和或過飽和,此時降Cd2+量達(dá)到最大值(11.412±0.592) mg/g。

2.1.3 不同菌體濃度對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響

如圖3所示,隨著菌體濃度增大,肉葡萄球菌846對Cd2+的降低率顯著增加,特別是在菌體濃度從0.5 g/L增加到1.5 g/L的過程中,幾乎呈線性增加;而后隨著菌體濃度的進一步增大,Cd2+降低率的變化率逐漸減小,有著增長平緩的趨勢,在菌體濃度為2.5 g/L,對50 mg/L質(zhì)量濃度Cd2+的降低率達(dá)到了(43.870±2.400)%。然而,在整個過程中,肉葡萄球菌846對Cd2+的降低量呈現(xiàn)出了不同的變化:降Cd2+量隨菌體濃度的增加而上升,于1 g/L菌體濃度下達(dá)到了最大值(11.412±0.592) mg/g,隨后在菌體濃度提高為1.5 g/L時,菌體降Cd2+量沒有顯著增加;當(dāng)菌體濃度大于1.5 g/L時,降Cd2+量出現(xiàn)了顯著性的下降。這些現(xiàn)象可能是因為,隨著菌體濃度的增加,與Cd2+結(jié)合位點的數(shù)量也隨之增多,進而表現(xiàn)出了Cd2+降低率和降低量的上升[18];而在菌體濃度進一步加大時,菌體出現(xiàn)吸附聚集,這在一定程度上減少了結(jié)合位點,可利用位點達(dá)到飽和甚至過飽和,Cd2+降低量開始下降;由于總體菌體數(shù)量的增加,Cd2+降低率仍呈現(xiàn)變化幅度減小的上升。

圖2 不同Cd2+濃度對肉葡萄球菌846降Cd2+能力的影響Fig.2 The effect of Cd2+concentration on the Cd2+-lowering capacity of Staphylococcus carnosus 846

圖3 不同菌體濃度對肉葡萄球菌846降Cd2+能力的影響Fig.3 The effect of cell concentration on the Cd2+-lowering capacity of Staphylococcus carnosus 846

2.1.4 其他金屬離子對肉葡萄球菌846降鎘能力的影響

在實際環(huán)境中,工業(yè)廢水中往往含有2種或多種金屬離子,并且成分復(fù)雜。因此測定不同金屬離子對菌體降Cd2+能力的影響是有意義的。本試驗分別對比了Cr6+、Zn2+、Pb2+和Mg2+4種金屬離子對肉葡萄球菌846降Cd2+能力的影響(圖4)。除Cr6+外,其余金屬離子均對菌體降Cd2+率有著不同程度的負(fù)面影響。其中,Pb2+對菌體降Cd2+能力的影響最大,使其降Cd2+率顯著降至為(13.350±2.320)%,相較只有Cd2+存在時降低了41.509%;而Mg2+雖然對其影響沒有顯著性差異,但仍下降了9.188%;Zn2+使其下降了16.285%。這可能是因為Zn2+、Pb2+和Mg2+等金屬離子與Cd2+在與菌體結(jié)合位點結(jié)合時形成了競爭關(guān)系[19],并且金屬離子的結(jié)合是有選擇性和優(yōu)先性的[20]。其他金屬離子的存在會干擾菌體對特定金屬離子的降低效果,這與之前的研究是一致的。YIN等[21]的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8661在單一金屬離子體系下的降Pb2+效果要好于二元金屬離子體系,并且Fe3+、Ca2+和Mn2+的存在顯著降低了菌株降Pb2+能力。然而,在本次試驗中,Cr6+的存在卻顯著地提高了肉葡萄球菌846的降Cd2+能力,使其增加了61.102%。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于Cr6+的強氧化性,再加上與Cd2+的協(xié)同毒性,使細(xì)胞死亡,細(xì)胞膜通透性改變,使得Cd2+進入細(xì)胞內(nèi),溶液中Cd2+濃度減小。

圖4 不同金屬離子對肉葡萄球菌846降Cd2+能力的影響Fig.4 The effect of other metal ions on the Cd2+-lowering capacity of Staphylococcus carnosus 846

2.2 掃描電鏡及能譜掃描分析

通過掃描電鏡可以直觀地看出重金屬離子對細(xì)胞形態(tài)的影響,而能譜可以了解菌體表面和內(nèi)部的元素分布情況。未經(jīng)鎘處理的肉葡萄球菌846細(xì)胞呈桿狀,表面光滑,細(xì)胞之間較為分散(圖5-a);能譜色散檢測出了一些構(gòu)成細(xì)胞的元素(圖5-b)。而經(jīng)過降Cd2+試驗的細(xì)胞表面發(fā)生褶皺,變得粗糙,細(xì)胞變形,甚至有些細(xì)胞發(fā)生破裂;細(xì)胞表面有顆粒狀附著物,并且細(xì)胞大量聚集(圖5-c);其能譜色散檢測出了鎘元素的存在(圖5-d),這證實了肉葡萄球菌846有著降Cd2+的能力。細(xì)胞在受到重金屬的壓迫時,其形態(tài)發(fā)生改變,表面變得粗糙,與HUANG等[22]對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母3種菌株在鎘暴露下的試驗結(jié)果相似,這可能與鎘的毒性有關(guān);重金屬會改變細(xì)胞表面的疏水性和電荷,進而引發(fā)結(jié)構(gòu)的改變[23]。而細(xì)胞的大量聚集可能是細(xì)胞的一種自我保護的機制,減小與重金屬的接觸面積。細(xì)胞表面的顆粒物可能與某些胞外分泌物與鎘的結(jié)合有關(guān)[24]。

a-肉葡萄球菌846對照組SEM;b-肉葡萄球菌846對照組EDS; c-肉葡萄球菌846鎘處理組SEM;d-肉葡萄球菌846鎘處理組EDS圖5 Cd2+對肉葡萄球菌846作用的掃描電鏡圖及能譜圖Fig.5 SEM and EDS of Staphylococcus carnosus 846 faced with Cd2+

2.3 傅里葉紅外光譜分析

a-對照組;b:處理組圖6 Cd2+處理的肉葡萄球菌846傅里葉光譜圖Fig.6 FTIR spectra of Staphylococcus carnosus 846 with Cd2+

3 結(jié)論