福建柏實時熒光定量PCR內參基因的選擇

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(1. 福建農林大學園林學院，福建 福州 350002；2. 福建農林大學林學院，福建 福州 350002)

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）指在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，具有準確性高、特異性好、試驗過程簡便等特點[1-2]。熒光定量試驗結果的準確性和可靠性取決于特定引物的擴增效率、cDNA的純度以及內參基因的穩(wěn)定性等，穩(wěn)定的內參基因能夠使目的基因的定量分析結果準確、特異性好[3-4]。在不同植物間或同一植物不同組織部位間內參基因的表達穩(wěn)定性有一定差異，通常會選擇在植物生命活動全過程或外界環(huán)境變化時都能表達相對穩(wěn)定、受環(huán)境影響較小的管家基因(Housekeeper gene)，如肌動蛋白(Actin)、泛素蛋白(Ubiquitin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等[5-6]。

福建柏（Fokienia hodginsii（Dunn）Henry et Thomas）為柏科福建柏屬，為我國特有種屬，分布在福建、廣東、云南、廣西等我國南部省份[7]；其樹干通直、樹型優(yōu)美、四季常青、適應性強、抗性較好、材性穩(wěn)定、結構細膩，是我國優(yōu)良的材用-景觀兩用型樹種之一。不僅如此，福建柏精油中含有多種藥用、化工價值的成分，開發(fā)利用價值高[8]。但福建柏的研究集中于混交造林、成分分析等方面，隨著研究的深入，分子生物學研究必不可少，如功能基因、轉錄因子的表達分析等研究，均涉及到使用熒光定量PCR 技術檢測目的基因的相對表達情況。本研究從福建柏轉錄組中選擇了8 個管家基因作為候選內參基因，包括肌動蛋白-7（Actin-7，ACT7）、泛素蛋白（Ubiquitin，UBQ）、延長因子-2（Elongation factor-2，EF2）、氯氰菊酯配合物（Clathrin adaptor complexes，CACs）、類Tip41 家族蛋白（Tip41-like family protein，TIP41）、泛素結合酶E2（Ubiquitin-conjugating enzyme E2，UBC2b）、讀框螺旋酶-8（READ box helicase 8，RH8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。通過qRT-PCR試驗并結合geNorm、Normfinder 和Bestkeeper 軟件進行分析，篩選出穩(wěn)定性強的內參基因。選擇4 個福建柏萜類合成酶基因（FhTPS）作為目的基因，萜類化合物作為福建柏精油及揮發(fā)性氣體中的主要成分之一，而萜類合成酶基因為萜類合成途徑中的關鍵酶基因，具有重要的研究意義[9]。利用目的基因在福建柏不同組織部位的相對表達水平及模式來驗證篩選出的內參基因的穩(wěn)定性，為后續(xù)福建柏RT-qPCR 試驗的準確性、科學性提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為20 年生生長良好、無病蟲害的福建柏鱗葉、樹皮和根，于2019 年8 月采集于福建省福州市永泰縣大湖國有林場的福建柏天然林，使用無菌水把材料清洗干凈并用無菌濾紙擦干后，用錫箔紙包裹立即放進干冰中，帶回實驗室置于?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ谕粎^(qū)塊內取3 棵樹齡相近、長勢一致的福建柏的鱗葉、樹皮和根分別設置3 個生物學重復用于總RNA 提取、定量分析等試驗。針對轉錄組測序，按以上方式單獨采集了植物各部位材料的3 次生物學重復用于測序。

1.2 主要試劑與儀器

總RNA 提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒、TB Green Premix Ex TaqII 購于TaKaRa 公司；qRT-PCR 儀為Applied BiosystemsTM7500；分光光度儀為NanoDrop 2000。

1.3 方法

1.3.1 轉錄組測序、總RNA 的提取與cDNA 第一條鏈的合成 將采集回來的福建柏根、皮和鱗葉3 個組織部位的植物材料立即送往武漢邁特維爾生物科技有限公司進行無參轉錄組測序。按照總RNA提取試劑盒說明書和反轉錄試劑盒說明書的操作步驟分別提取福建柏3 個組織部位的總RNA，并進行濃度測定和瓊脂糖凝膠電泳檢測。后反轉錄合成cDNA 第一條鏈。

1.3.2 引物設計與特異性檢測 從福建柏轉錄組數(shù)據(jù)篩選出表達量高、表達穩(wěn)定的TPS基因部分片段，經過NCBI-Blast 比對后將匹配的TPS基因用Primer Premier 5.0 軟件設計4 個FhTPS基因的RTqPCR 引物，同時篩選并設計福建柏8 個候選內參基因（ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH）的引物（表1），引物由福州鉑尚測序公司提供。將設計好的引物用TB Green 試劑盒進行RT-qPCR 檢測特異性（即是否產生二聚體），檢測中模板用ddH2O 代替，分析各引物的溶解曲線和高表達擴增情況。

表1 福建柏內參基因及TPS 基因引物Table 1 Primer of reference genes and TPS genes of Fokienia hodginsii

1.3.3 內參基因篩選和FhTPS基因定量表達分析將福建柏根、樹皮和鱗葉反轉錄得到cDNA 稀釋至200 ng·μL?1，設置5 個質量濃度梯度，以5倍濃度稀釋，得到200、40、8、1.6、0.32 ng·μL?15 個質量濃度的cDNA 樣品。把各質量濃度3 個組織部位稀釋好的cDNA 混合至一個離心管中，充分混勻后以此為模板。將8 個候選基因4 個FhTPS基因用TB Green 試劑盒進行RT-qPCR 實驗，反應體系TB Green Premix Ex Taq 10 μL，正反引物各0.8 μL，RoxII 0.4 μL，ddH2O 6 μL。在內參基因篩選中按照5 個質量濃度梯度作為cDNA 的質量濃度，在FhTPS基因進行驗證定量分析中按照TB Green試劑盒說明書要求以100 ng·μL?1作為cDNA 的質量濃度。擴增程序：95℃反應30 s；95℃反應5 s，60℃反應34 s，共40 個循環(huán)；溶解曲線：95℃反應15 s，60℃反應1 min，95℃反應15 s。每個候選內參基因在不同部位和不同濃度均設置4 個重復，后用Ct(2?ΔΔCT)法計算8 個候選內參基因和4 個FhTPS基因在福建柏根、皮和鱗葉中的相對表達量。1.3.4 數(shù)據(jù)處理 利用3 個內參基因穩(wěn)定性評價軟件geNorm[10]、Normfinder[11]和BestKeeper[12]，對8 個候選內參基因的穩(wěn)定性進行統(tǒng)計分析，篩選出適合于福建柏各組織的穩(wěn)定內參基因及組合。

2 結果與分析

2.1 轉錄本的拼接和總RNA 的提取

由測序得到的福建柏轉錄組數(shù)據(jù)中，通過拼接得到330 521 條轉錄本序列，平均長度為721 bp，可用于后續(xù)分析使用。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質量，檢測結果條帶清晰，28S rRNA比18S rRNA 條帶更亮。同時利用分光光度儀進行純度檢測，結果顯示：A260/A280比值均在1.8～2.0之間。因此，可以說明RNA 無降解、完整性良好（圖1）。

2.2 引物驗證

通過RT-qPCR 的擴增，結果顯示：8 個候選內參基因的擴增效率為98.32%～104.79%，相關系數(shù)R2為0.973～0.999，符合內參基因的初步要求,可進行進一步反應；而且8 個候選內參基因擴增產物的溶解曲線均為單一峰, 特異性較好, 熔解溫度(Tm)均在80～90℃之間, 可用于進一步分析（圖2）。

2.3 候選內參基因Ct 值分析

從RT-qPCR 實驗獲得的各候選內參基因Ct值與其表達豐度成反比，Ct值越大，基因表達量越低[13]。結果（圖3）顯示：從5 個質量濃度的Ct值綜合分析，所選擇的8 個候選內參基因的平均值最低的為UBC2b（24.40），平均值最高的為UBQ（31.25）。從各質量濃度單獨分析，從高濃度至低濃度過渡時，Ct值均逐漸增大，符合表達規(guī)律。而且5 個質量濃度梯度下各候選內參基因的平均Ct值大小規(guī)律一致，說明試驗誤差較小。UBQ在各質量濃度下Ct值明顯高于其他7 個候選內參基因，不適合作為內參基因來檢測高豐度基因的表達情況。

圖1 總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Total RNA agarose gel electrophoresis

2.4 內參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm 軟件分析 geNorm 軟件是通過計算候選內參基因的平均穩(wěn)定指數(shù)M 值來對比候選內參基因的穩(wěn)定性，M = 1.5 為穩(wěn)定性分界線，當M 值低于1.5 時，可判定該候選內參基因較穩(wěn)定，且M 值越低，該內參基因的穩(wěn)定性越高[14]。軟件分析結果表明：在各處理中，8 個候選內參基因M 值均低于1.5，說明候選內參基因的表達均較穩(wěn)定。表2 可知：在5 個質量濃度下，M 值最小的均為ACT7。在質量濃度為8、200 ng·μL?1時，RH8的M 值最大；在質量濃度為1.6、40 ng·μL?1時，DAPDH的M 值最大；在質量濃度為0.32 ng·μL?1時，TIP41的M 值最大。說明ACT7在geNorm 軟件分析下的穩(wěn)定性最好，而RH8和DAPDH的穩(wěn)定性較差。

在geNorm 軟件分析中，標準化因子的配對差異分析（Vn/Vn+1）是對候選內參基因最佳配對數(shù)目的衡量。當Vn/Vn+1=0.15 為分界值，若Vn/Vn+1小于該數(shù)值說明n個內參基因可以實現(xiàn)穩(wěn)定歸一化[10]。結果（圖4）表明：V2/V3、V3/V4、V4/V5、V6/V7均小于0.15，說明在n=2 時已經能夠實現(xiàn)穩(wěn)定歸一化，即2 個穩(wěn)定內參基因的組合可以使定量結果更準確、可靠。

圖2 候選內參基因溶解曲線Fig.2 Melting curves of the candidate reference genes

圖3 5 個質量濃度梯度福建柏組織混樣的cDNA 下候選基因Ct 值Fig.3 The cycle threshold values of candidate reference genes in 5 mass concentrations of cDNA mixture

2.4.2 Normfinder 軟件分析 利用Normfinder 軟件分析8 個候選內參基因得到候選內參基因的M值，根據(jù)M 值越低基因表達越穩(wěn)定的原則對候選內參基因進行比較。軟件分析結果（表3）表明：8 個候選內參基因的穩(wěn)定性排序在5 個質量濃度下各有不同，在質量濃度為0.32 ng·μL?1時，表達穩(wěn)定性較好的是RH8、CACs和ACT7，穩(wěn)定性較差的是TIP41；在質量濃度為1.6、8 ng·μL?1時，表達穩(wěn)定性較好的均為ACT7、UBC2b，穩(wěn)定性較差的分別是DAPDH和RH8；在質量濃度為40 ng·μL?1時，表達穩(wěn)定性較好的是EF2和UBC2b，穩(wěn)定性較差的是DAPDH；在質量濃度為200 ng·μL?1時表達穩(wěn)定性較好的是TIP41和ACT7，穩(wěn)定性較差的是RH8。

2.4.3 BestKeeper 軟件分析 BestKeeper 軟件可以通過計算每個基因直接產生配對的標準偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）和相關系數(shù)變量（r）來評價內參基因的穩(wěn)定性。表達穩(wěn)定性好的基因一般呈現(xiàn)較高的r值、較小的SD和CV[14]。此外，當SD值大于1 時則表明基因的表達不穩(wěn)定[13]。結果（表4）顯示：在5 個質量濃度梯度下，SD值和CV值較小的均為UBC2b、EF2和ACT7，其中，3 個候選內參基因的SD值均小于0.1，CV值均小于0.4；而5 個質量濃度梯度下的r值排序差異較大，其中，r值較大的為TIP41和ACT7，較小的為UBC2b。將5 個質量濃度下的SD、CV和r進行綜合排序，穩(wěn)定性較好的為UBC2b、ACT7和EF2，穩(wěn)定性較差的為DAPDH和RH8。

表2 geNorm 軟件分析不同cDNA 質量濃度下候選內參基因穩(wěn)定性Table 2 Stability analysis of candidate reference genes of in different mass concentrations of cDNA by geNorm

圖4 geNorm 軟件分析內參基因最適數(shù)目Fig.4 Analysis of optial number of reference genes for normalization by geNorm

2.5 內參基因穩(wěn)定性驗證

根據(jù)3 個分析軟件得出的結果，選擇穩(wěn)定性較好的2 個基因（ACT7和UBC2b）進行驗證，以穩(wěn)定性較差的RH8基因作為對照，同時利用4 個FhTPS基因驗證內參基因在福建柏根、樹皮、鱗葉3 個不同組織中的表達穩(wěn)定性。結果（圖5）顯示：4 個FhTPS基因在福建柏的根、樹皮、鱗葉3 個不同組織的相對表達量趨勢一致，符合轉錄組數(shù)據(jù)中FPKM（Reads Per Kilobase per Million）值中的變化規(guī)律，從而驗證了FhTPS基因能夠在福建柏3 個組織部位中穩(wěn)定表達。4 個基因在以ACT7和UBC2b作為內參基因時，表達趨勢一致且穩(wěn)定，驗證了ACT7和UBC2b有較好的穩(wěn)定性，2 個作為組合進行基因表達量分析時能夠相互印證，增加定量結果的準確性。以RH8為內參基因時，4 個基因的表達趨勢波動較大，驗證了RH8穩(wěn)定性較差。

3 討論

實時熒光定量PCR 是基因表達分析研究中的重要技術之一，分析結果的準確性和重復性會受試驗中各因素影響，其中，一個重要因素是內參基因的穩(wěn)定性，較為穩(wěn)定的內參基因，才能確保分析結果的準確性[15]；而內參基因的穩(wěn)定性是相對的，不

表3 Normfinder 軟件分析不同cDNA 質量濃度下候選內參基因穩(wěn)定性Table 3 Stability analysis of candidate reference genes of in different mass concentrations of cDNA by Normfinder

同植物、不同組織部位、不同生長時期和不同試驗條件均會影響內參基因的穩(wěn)定性[16]。如Actin基因在核桃[17]中為理想的內參基因，而在劍麻[18]中表現(xiàn)不穩(wěn)定；在多花蘭的花器官中的理想內參基因為GAPDH，營養(yǎng)器官中則為28SrRNA[19]；在川續(xù)斷根的不同生長時期，篩選出的理想內參基因均不相同[20]；玉米在多種非生物脅迫和不同激素處理下的理想內參基因均有所差異[21]。由此可知，在進行熒光定量PCR 實驗前，針對不同試驗材料、試驗條件等因素進行內參基因的篩選是有必要的。

表4 BestKeeper 軟件分析不同cDNA 質量濃度下候選內參基因穩(wěn)定性Table 4 Stability analysis of candidate reference genesin different mass concentrations of cDNA by BestKeeper

理想的內參基因在同一植物所有組織中均表達相對穩(wěn)定且受內外因素影響較小，一般為細胞骨架的基本組成或參與生物體基本代謝調控過程的管家基因，如編碼細胞骨架結構蛋白的Actin、TUB和TUA等基因[22]；編碼糖酵解、糖異生及光合作用碳固定循環(huán)過程中的關鍵酶GAPDH基因[23]；標記待分解蛋白、跨膜蛋白的泛素UBC、UBQ基因等等[24]。本研究根據(jù)前人研究報道的常用內參基因，在福建柏轉錄組數(shù)據(jù)庫中選擇8 個候選內參基因，（ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH），利用GeNorm、Normfinder 和BestKeeper軟件對這些基因在福建柏不同組織（根、皮和鱗葉）混合樣品中的qPCR 試驗結果進行綜合分析。3 個軟件對內參基因穩(wěn)定性評價的一個重要指標為Ct值，理想的內參基因平均Ct值通常在15～30之間[13]。通過比較8 個候選內參基因的Ct值，發(fā)現(xiàn)除UBQ以外，其它7 個候選內參基因的Ct值均在該范圍之內，同時在軟件分析中UBQ穩(wěn)定性也較差。

圖5 候選內參基因作為試驗內參基因分析目的基因的表達Fig.5 The candidate reference genes as test reference gene in the analysis of target gene expression

geNorm 和Normfinder 軟件均是根據(jù)M 值來評價分析，2 個軟件分析結果中最穩(wěn)定的均為ACT7，BestKeeper 則顯示UBC2b最穩(wěn)定，說明不同軟件分析得到的最穩(wěn)定內參基因有一定差異。Fan 等研究結果也驗證了這一結論，其分析毛竹不同組織部位的穩(wěn)定內參基因，在3 個軟件中候選內參基因的排名均有所不同[25]。在5 個質量濃度（0.32、1.6、8、40 和200 ng·μL?1）的不同組織cDNA 混合樣品中，geNorm 和BestKeeper 結果顯示5 個質量濃度中最穩(wěn)定的均為ACT7，Normfinder 結果顯示5 個質量濃度中最穩(wěn)定基因各有差異，推測可能是cDNA 混合樣品中不同組織存在一定表達差異造成的，但綜合其他2 個軟件分析結果，3 個軟件的總體結果仍趨于穩(wěn)定的內參基因不會受到cDNA 質量濃度變化的影響，ACT7為最穩(wěn)定的內參基因。但單個內參基因往往會產生一些試驗誤差，2 個及以上內參基因的組合可以減少誤差，提高準確性[26]。如Xiao 等以不同時期杜鵑花的不同組織為材料，分析單個內參基因和2 個內參基因組合對目的基因的相對表達量進行分析，結果顯示2 個內參基因組合比單個內參基因的結果差異較小[27]。因此，geNorm軟件分析中標準化因子的配對差異分析（Vn/Vn+1）有一定價值，其對候選內參基因最佳配對數(shù)目的衡量，判斷內參基因能夠實現(xiàn)穩(wěn)定歸一化的數(shù)量。geNorm 結果顯示V2/V3值小于0.15，說明2 個內參基因的組合就能實現(xiàn)穩(wěn)定歸一化，即選擇穩(wěn)定性最好的ACT7和UBC2b組合。

利用軟件分析并不能保證一個內參基因有準確的結果，還需在利用相關目的基因在特定試驗條件下驗證篩選出的內參基因的表達穩(wěn)定性，才能得出真實可靠的定量數(shù)據(jù)[28]。因此，本研究選擇4 個FhTPS基因作為目的基因，以ACT7和UBC2b組合作為內參基因，穩(wěn)定性最差的RH8基因作為對照，分析了目的基因在福建柏根、皮和鱗葉中的表達。定量分析結果驗證了篩選出的ACT7和UBC2b能夠使目的基因有較為穩(wěn)定的相對表達水平且表達趨勢一致，RH8穩(wěn)定性差不適合作為內參基因，該結果與geNorm 和BestKeeper 軟件分析結果一致，與Normfinder 軟件的結果有一定差異，但與3 個軟件的綜合分析結果一致。因此，通過對目的基因的定量分析對篩選出的內參基因進行驗證能夠對軟件分析的結果進行佐證，使內參基因篩選結果更具科學性。

4 結論

本研究通過對比分析ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH共 8 個候選內參基因在福建柏不同質量濃度的各組織cDNA 混合樣品中RT-qPCR 分析中的表達穩(wěn)定性，利用3 個分析軟件綜合分析并篩選獲得了穩(wěn)定表達的內參基因ACT7與UBC2b，且ACT7和UBC2b組合能夠實現(xiàn)穩(wěn)定均一化，使定量結果更可靠；RH8表達不穩(wěn)定，不適合作為內參基因。經過4 個FhTPS目的基因的驗證，確定了2 個基因的穩(wěn)定性。這對今后福建柏的基因定量表達研究有重要意義。