杉木林下套種闊葉樹對(duì)土壤生態(tài)酶活性及其化學(xué)計(jì)量比的影響

孫思怡，盧勝旭，陸宇明，許恩蘭，吳東梅，劉春華，蔣宗塏，郭劍芬＊

(1.福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院 福建 福州 350007；2.濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 福建 福州 350007；3.福建農(nóng)林大學(xué)莘口教學(xué)林場 福建 三明 365000)

土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的主要參與者[1]。土壤酶作為微生物代謝的指標(biāo)，推動(dòng)著土壤微生物分解有機(jī)質(zhì)，在土壤碳、氮、磷循環(huán)過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。Sinsabaugh 等研究認(rèn)為，水解酶的活性可以作為微生物營養(yǎng)需求的指標(biāo)，而且在C、N 和P 周轉(zhuǎn)相關(guān)的酶活性之間也存在化學(xué)計(jì)量關(guān)系[3]。相關(guān)研究將微生物用于獲取碳、氮、磷養(yǎng)分的主要水解酶的比值 (βG∶NAG∶AP)，稱為生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比，能夠反映土壤微生物群落的養(yǎng)分需求和利用能力，并與土壤養(yǎng)分循環(huán)、轉(zhuǎn)化及其有效性聯(lián)系起來，可用來衡量土壤微生物能量和養(yǎng)分資源的限制狀況[3-5]。已有的研究表明生態(tài)酶活性及其計(jì)量比受到溫度、水分、pH 值、養(yǎng)分有效性、微生物生物量以及植被特征等因素的影響[6-10]，而將土壤-微生物生物量-酶化學(xué)計(jì)量比結(jié)合起來的研究鮮有報(bào)道。

杉木 (Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.)為我國南方主要造林樹種，栽培面積大[11]。近幾十年來，由于杉木林長期單一的純林經(jīng)營，造成連栽杉木人工林的土壤肥力退化、生產(chǎn)力下降等問題[12-15]。已有研究表明，對(duì)杉木人工林進(jìn)行間伐、套種等改造，能夠改善林分質(zhì)量，豐富生物多樣性[16]；杉木純林在套種改造后形成混交林的土壤微生物生物量[17]、土壤肥力和土壤酶活性[18]也得到提高。但過去關(guān)于杉木林下套種闊葉樹的研究更多地僅關(guān)注套種后土壤理化性質(zhì)及養(yǎng)分的變化，從土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量比角度的研究較少。為此，本研究在三明格氏栲自然保護(hù)區(qū)建立杉木林下套種闊葉樹試驗(yàn)，研究套種后土壤酶活性及生態(tài)酶計(jì)量比的特征，以探討杉木林下套種闊葉樹對(duì)提高土壤肥力、促進(jìn)土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的效果。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)區(qū)位于福建省三明市格氏栲自然保護(hù)區(qū)(117°28′ E，26°11′ N) 內(nèi)，該區(qū)屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候，夏熱冬冷且雨熱同季，年均溫19～20 ℃，年降水量達(dá)1 740 mm。保護(hù)區(qū)內(nèi)平均海拔300～350 m，以低山丘陵為主，植物群落種類豐富且分層明顯。土壤主要以紅壤和黃壤為主，多呈酸性，土壤厚度超過1 m。

自2014 年4 月開始，在三明格氏栲自然保護(hù)區(qū)建立杉木林下套種闊葉樹的杉木林試驗(yàn)區(qū)。套種前先對(duì)林地進(jìn)行疏伐、清除林下雜草、穴狀整地，每個(gè)處理的立地條件、坡向、坡位等條件基本一致，明穴規(guī)格為40 cm × 30 cm × 30 cm，林分株行距為2 m × 3 m。設(shè)置3 種套種處理，分別為杉木成熟林套種闊葉樹 (套種成熟林)、杉木幼林套種闊葉樹(套種幼林)和杉木純林(對(duì)照)，每種處理設(shè)置20 m × 20 m 的標(biāo)準(zhǔn)樣地5 個(gè)。套種闊葉樹種的杉木林齡分別為51 年生和4 年生，杉木純林的林齡為4 年生。林下套種的種植密度以各闊葉樹種生長后能覆蓋地表為宜，套種的闊葉樹均為3 年生，包括馬褂木 (Liriodendron chinense(Hemsl.) Sarg.)、火力楠(Michelia macclureiDandy)和樂昌含笑(Michelia chapensisDandy)，三者比例為1∶1∶1。栽植后于當(dāng)年8—9 月?lián)嵊? 次，次年8—9 月進(jìn)行第二次撫育，撫育內(nèi)容主要包括松土、清除林地雜草等，以促進(jìn)幼林良好地生長[19]。

1.2 試驗(yàn)研究方法

1.2.1 土壤樣品采集 2018 年10 月，在套種的每個(gè)樣地內(nèi)按“S”型選5 個(gè)點(diǎn)，用土鉆取表層土壤(0～10 cm)，將土壤分別充分混合均勻并去除可見的細(xì)根和石礫等，再將土樣過2 mm 篩裝入自封袋。一部分存在 4℃冰箱中，用于測(cè)定土壤含水量、微生物生物量、碳、氮、磷 (MBC、MBN、MBP)含量、土壤酶活性等，另外一部分自然風(fēng)干，主要用來測(cè)定土壤pH 值和土壤全碳 (TC)、全氮 (TN)、全磷 (TP) 含量等。

1.2.2 土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定 土壤含水量運(yùn)用鋁盒烘干衡定法測(cè)定，采用ElementarVario MAX 碳氮元素分析儀 (GmbH，Hanau，Germany) 測(cè)定土壤TC 和TN 含量；土壤TP 含量的測(cè)定則加入濃硫酸-高氯酸消煮后提取待測(cè)溶液，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (Skalar san++，Skalar，荷蘭) 測(cè)定。

1.2.3 土壤微生物生物量碳、氮、磷測(cè)定 土壤微生物量運(yùn)用氯仿熏蒸-浸提法，每個(gè)鮮土樣各稱取5 份(5 × 5 g)，兩組土樣放到50 mL 小燒杯中做熏蒸處理，另兩組土樣放到離心管中，放不含氯仿的干燥器中做未熏蒸處理，剩余一組加入62.5 μL 的1 000 mg· kg?1磷標(biāo)液，放置24 h 進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。24 h 后，將燒杯中的熏蒸土樣取出，土壤微生物生物量碳和氮 (MBC、MBN) 用2 mL 0.5 mol·L?1K2SO4洗至離心管中，土壤微生物生物量磷 (MBP)用20 mL 0.5 mol·L?1NaHCO3洗至離心管中。未熏蒸的土樣則分別直接加入20 mL 0.5 mol·L?1K2SO4和20 mL 0.5 mol·L?1NaHCO3。MBC 含量用總有機(jī)碳分析儀 (TOC-VCPH/CPN，Shimadzu，日本)測(cè)定，MBN、MBP 含量用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (San++，Skalar，荷蘭)測(cè)定。

1.2.4 土壤酶活性測(cè)定 土壤酶活性測(cè)定參考Saiya-Cork 等[20-21]的方法，各樣品分別稱取 1 g 土壤加入125 mL 50 mmol·L?1且pH 值為5.0 的醋酸緩沖液中，制成懸浮液，靜置30 min 取上清液200 μL 加入96 孔微孔板中。每個(gè)樣品有16 個(gè)重復(fù) (200 μL 樣品溶液+50 μL 200 μmol·L–1底物溶液)，8 個(gè)陰性對(duì)照 (200 μL 醋酸緩沖溶液+50 μL 底物溶液)、8 個(gè)空白 (200 μL 樣品溶液+50 μL 緩沖溶液) 和8 個(gè)淬火標(biāo)準(zhǔn)液 (200 μL 樣品溶液+50 μL 標(biāo)準(zhǔn)液) 及淬火標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液(200 μL 緩沖液+50 μL 標(biāo)準(zhǔn)液)進(jìn)行校正。再將微孔板置于20℃黑暗培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4 h 后取出，加入1 mol·L–1NaOH 至每個(gè)微孔井使其終止反應(yīng)。最后采用Synergy H4多功能酶標(biāo)儀 (Molecular Devices,San Jose,USA)檢測(cè)熒光度，酶活性以每小時(shí)每克干物質(zhì)產(chǎn)生底物的摩爾數(shù) (nmol·g–1·h–1) 來表達(dá)。各種土壤酶的名稱、縮寫、類型及所用標(biāo)定底物詳細(xì)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2019 軟件處理后，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，通過單因素方差分析(One-way ANOVA) 檢驗(yàn)不同套種處理下土壤理化性質(zhì)、土壤微生物生物量、生態(tài)酶活性及其化學(xué)計(jì)量比的差異顯著性，并用Pearson 相關(guān)分析法分析土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量比與土壤理化性質(zhì)和微生物生物量碳氮等指標(biāo)的相關(guān)性。使用Canoco Software5.0 軟件對(duì)生態(tài)酶活性及其化學(xué)計(jì)量與土壤理化因子和微生物生物量的關(guān)系進(jìn)行冗余分析（RDA）。

表1 土壤酶的種類、縮寫、類型和所用底物Table 1 The abbreviations,type and substrates of soil enzyme

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

如表2 所示，杉木成熟林套種后土壤pH 值、TC、TN 含量顯著高于套種幼林以及杉木純林，而后兩者之間無顯著差異。不同的套種處理對(duì)土壤TP 的含量無顯著影響。不同處理之間土壤C:N、C:P、N:P 差異顯著，其中C:N 的范圍為13.31～9.36，變化趨勢(shì)是套種成熟林 >套種幼林 >杉木純林，C:P 和N:P 的范圍分別是260.67～103.38 和19.74～9.94，變化趨勢(shì)則是套種成熟林的比值顯著高于套種幼林和杉木純林，而套種幼林與杉木純林之間無顯著差異。

2.2 土壤微生物生物量碳、氮、磷

土壤微生物生物量碳、氮、磷在不同套種處理間變化顯著 (表3)。套種成熟林的微生物生物量碳（MBC）含量分別比套種幼林和杉木純林高8.07%和14.90%。套種成熟林的微生物生物量磷（MBP）含量分別比套種幼林和杉木純林高15.54%和36.75%。但是微生物生物量氮（MBN）含量在三者之間沒有顯著差異。杉木純林土壤的MBN:MBP 明顯高于套種幼林，而與套種成熟林差異不顯著。MBC:MBN 以及MBC:MBP 在不同套種處理之間的差異均不顯著。

表2 不同套種處理土壤理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of soil under different interplanting treatments

表3 不同套種處理下微生物生物量及其計(jì)量比Table 3 Microbial biomass and its metering ratio under different interplanting treatments

2.3 土壤酶活性及其計(jì)量比

不同的套種處理顯著影響土壤酸性磷酸酶(AP)、β-葡萄糖苷酶(βG)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)這3 種土壤水解酶活性 (圖1)，其變化范圍分別為93.29～60.81、0.70～0.22、0.96～0.71 nmol·g?1·h?1。其中AP 酶活性在不同處理間的變化趨勢(shì)是套種成熟林 >套種幼林 >杉木純林；杉木純林的βG 酶活性顯著高于套種成熟林和套種幼林，而套種成熟林和套種幼林之間沒有顯著差異性；套種成熟林的NAG 酶活性最高且與套種幼林差異顯著，而杉木純林與其他兩個(gè)處理間沒有顯著差異。如圖2 所示，杉木純林βG:NAG 和βG:AP顯著高于套種成熟林和套種幼林，但βG:NAG和βG:AP 在套種成熟林和套種幼林之間差異不顯著。NAG:AP 在各個(gè)處理之間的差異均不顯著。

圖1 套種處理對(duì)土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of different interplanting treatments on soil enzyme activities

圖2 套種處理對(duì)土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比的影響Fig.2 Effects of different intercropping treatments on soil ecological enzyme stoichiometry

2.4 土壤生態(tài)酶活性及化學(xué)計(jì)量比與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析(表4)表明土壤AP、NAG酶活性分別與土壤pH、TC、TN、MBP 含量以及C:N、C:P、N:P 和MBN:MBP 顯著正相關(guān)。其中土壤AP 酶活性與土壤pH、TC、TN、MBP 含量以及C:N、C:P 和N:P 呈極顯著正相關(guān) (P<0.01)，土壤NAG 酶活性與pH 值以及MBN:MBP 呈顯著正相關(guān)。而土壤生態(tài)酶計(jì)量比中NAG:AP 與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性不顯著，βG:NAG 與MBP 呈顯著負(fù)相關(guān)、與MBN:MBP 呈顯著正相關(guān)，βG:AP 與pH 值和C:N 呈顯著負(fù)相關(guān)，與MBP 呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與MBN:MBP 呈顯著正相關(guān)。冗余分析表明土壤生態(tài)酶活性及其計(jì)量比與土壤C:N 和MBC:MBN 顯著相關(guān)。如圖3 所示，第一軸解釋了變量的98.72%，第二軸解釋了變量的0.03%，其中土壤C:N、MBC:MBN 和C:P 分別解釋土壤酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比變化的92.3%、4.4%和1.6%。此外，土壤生態(tài)酶活性及其化學(xué)計(jì)量比可以將3 種處理明顯地區(qū)分開。

表4 土壤酶活性、酶化學(xué)計(jì)量比與理化性質(zhì)及土壤化學(xué)計(jì)量相關(guān)性Table 4 Correlation between soil enzyme activity,enzyme stoichiometry and physicochemical properties and soil stoichiometry

圖3 土壤酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比與土壤理化因子的冗余分析Fig.3 Redundant analysis of soil enzyme activity and ecological enzyme stoichiometry and soil physical and chemical factors

3 討論

3.1 不同套種處理對(duì)土壤養(yǎng)分、土壤微生物生物量及其化學(xué)計(jì)量的影響

研究表明，林分的改變會(huì)引起凋落物數(shù)量和質(zhì)量、生物量、土壤結(jié)構(gòu)等變化，從而影響土壤碳、氮、磷含量及微生物生物量[22-24]。本研究中，杉木在套種闊葉樹后土壤TC、TN、MBC、MBN 含量顯著增加，因?yàn)樯寄镜娜~片多為厚革質(zhì)，富含大量的木質(zhì)素、纖維素等難分解物質(zhì)，其凋落物不易淋溶或被土壤動(dòng)物機(jī)械破壞，微生物難以分解利用，而闊葉樹種凋落物反之，更易于微生物的分解[25-27]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)凋落物的基質(zhì)質(zhì)量可以解釋分解速率變異的21.7%[26]，杉木林下套種闊葉林后，闊葉樹比例增大，凋落物質(zhì)量的改變，加速了凋落物分解，進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率和土壤微生物生物量[28]。本研究結(jié)果表明，套種成熟林的土壤TC、TN、MBC、MBN 含量高于套種幼林，這可能與不同林齡的凋落物產(chǎn)量和分解速率不同有關(guān)[29-30]。凋落物數(shù)量和質(zhì)量隨林齡增加而改變，使得土壤TC和TN 含量升高，提供了更為充足的土壤微生物所需養(yǎng)分，從而提高了土壤微生物生物量。

土壤C:N:P 化學(xué)計(jì)量比是衡量土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分狀況的指示器，隨植被類型和養(yǎng)分輸入狀況的變化而改變[31-33]。本研究中杉木林在套種闊葉樹之后C:N 小于杉木幼林，表明套種闊葉樹可能增強(qiáng)了土壤微生物同化作用，使得土壤養(yǎng)分從無機(jī)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)態(tài)，增加土壤肥力，進(jìn)一步優(yōu)化土壤質(zhì)量。土壤C:P 和N:P 是P 有效性和養(yǎng)分診斷的指標(biāo)。全球森林土壤C:P 為81.9，N:P 為6.6，然而本研究中3 種處理的C:P 分別為103.38、260.367、133.34，N:P 分別為9.94、19.74、13.20，均高于全球平均值，這表明本區(qū)域森林土壤受到P 素的限制。

3.2 不同套種處理對(duì)土壤酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的影響

βG 酶作為土壤有機(jī)碳變化的指標(biāo)之一，會(huì)影響碳素的獲得[34]，土壤中的幾丁質(zhì)分解、氮素的獲取受NAG 酶活性的影響，AP 酶則影響土壤有機(jī)磷礦化以及磷素的獲得[35]。本研究中，杉木林下套種闊葉樹使得βG 酶活性顯著降低，而土壤TC 和MBC 含量（圖2，3）在套種處理后總體呈上升趨勢(shì)，表明在碳供應(yīng)充足的情況下，βG 酶活性可能受其他非生物因子的影響更大。套種成熟林NAG 酶活性高于套種幼林，說明隨著林齡的增加，土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分狀況改變，影響凋落物的數(shù)量和基質(zhì)質(zhì)量、林下生物量而改變土壤微生物生物量，進(jìn)而影響相關(guān)土壤酶活性。這與喬航等[36]關(guān)于不同林齡油茶人工林土壤酶活性的研究結(jié)果基本一致。此外，套種闊葉樹之后AP 酶活性顯著提高，這可能與套種后土壤微生物生物量磷含量提高有關(guān)。

土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比能夠有效地衡量微生物對(duì) C、N、P 養(yǎng)分的需求[34]，并且在一定程度上反映了土壤微生物生物量和土壤有機(jī)質(zhì)之間的平衡狀況、土壤微生物的養(yǎng)分吸收速率和生長效率[37]。全球尺度上，βG:AP 和NAG:AP 的平均值分別為0.62 和0.44[38]，本研究βG:AP 和NAG:AP 的平均值分別為0.006 4 和0.011 3，該研究結(jié)果遠(yuǎn)低于全球平均水平，說明該區(qū)域森林生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)受P 限制，這是因?yàn)楫?dāng)微生物受磷限制時(shí)，相應(yīng)地會(huì)分泌更多的磷酸酶促進(jìn)土壤有機(jī)磷礦化，增加磷素的供應(yīng)來緩解磷限制。磷酸酶分泌量的增多，土壤中βG:AP、NAG:AP 值則降低[39]，這也與大多數(shù)研究結(jié)果一致[12,40]。另外，套種之后土壤碳氮含量增加，C:P、N:P 和MBC:MBP、MBN:MBP 減小也有可能進(jìn)一步造成βG:AP 和NAG:AP 減小。βG:AP和βG:NAG 的值均在套種處理之后顯著降低，這可能主要與AP 酶和NAG 酶的活性提高以及βG酶活性降低有關(guān)。

3.3 土壤酶活性及生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量特征變化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子

冗余分析結(jié)果表明，土壤C:N、MBC:MBN和C:P 分別解釋土壤酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比的92.3%、4.4%和1.6%。其中C:N 與NAG 成正相關(guān)，與βG、βG:NAG、NAG 成負(fù)相關(guān)；MBC:MBN與NAG、βG:NAG、βG 成負(fù)相關(guān)；C:P 與AP、βG成正相關(guān)，與βG:AP 成負(fù)相關(guān)。由于土壤酶主要來源于土壤微生物以及凋落物降解的產(chǎn)物等，凋落物等養(yǎng)分輸入改變會(huì)造成土壤養(yǎng)分計(jì)量比以及微生物生物量的改變，因而導(dǎo)致土壤酶化學(xué)計(jì)量比亦受土壤養(yǎng)分化學(xué)計(jì)量比以及微生物生物量計(jì)量比的影響[41]。本研究中，相關(guān)性分析表明：βG:AP 與土壤C:N 呈顯著負(fù)相關(guān)，βG:NAG 與土壤 C:N 以及MBC:MBN 均無顯著相關(guān)性，說明土壤酶化學(xué)計(jì)量與土壤養(yǎng)分計(jì)量以及微生物生物量并未存在嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明土壤酶化學(xué)計(jì)量關(guān)系是涉及多方面因素的復(fù)雜問題。這可能是由于土壤養(yǎng)分的計(jì)量比不能表征有效態(tài)養(yǎng)分的計(jì)量比[42-43]，此外土壤酶活性可能更多地受到水分、溫度等的間接影響。

4 結(jié)論

杉木套種闊葉樹明顯改變了土壤養(yǎng)分、微生物生物量、生態(tài)酶活性以及生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比。杉木林下套種闊葉樹對(duì)土壤養(yǎng)分含量和相應(yīng)的微生物生物量產(chǎn)生影響，從而使得套種處理后βG 酶活性顯著降低，土壤AP 酶活性顯著提高，進(jìn)而導(dǎo)致βG:NAG、βG:AP、NAG:AP 均降低。本研究結(jié)果還表明土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比不能夠很好的反映土壤養(yǎng)分元素的比例組成，生態(tài)酶的活性可能更多地與有效態(tài)養(yǎng)分組成以及水分、溫度等非生物因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。