2種花楸果實(shí)類胡蘿卜素成分與果色關(guān)系

于雪丹，張川紅＊，鄭勇奇，夏新合，黃 磊

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 河北省小五臺(tái)山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，河北 蔚縣 075700)

果色是果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)和影響商品價(jià)值的重要因素，是育種者和消費(fèi)者共同關(guān)注的一個(gè)重要性狀[1]；同時(shí)，對(duì)于以食果動(dòng)物為傳播媒介的植物來說，果色還是影響物種分布和演化的重要因素之一[2-4]。鑒于果色及其物質(zhì)基礎(chǔ)在植物生長發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)、膳食營養(yǎng)和疾病健康等方面的重要性，植物果色的形成機(jī)制及調(diào)控始終備受關(guān)注和重視，對(duì)植物果色性狀的改良也是育種者始終追求的目標(biāo)之一。

植物呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)是植物色素，主要包括葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜素。葉綠素的主要功能體現(xiàn)在通過光合作用促進(jìn)植物生長發(fā)育，后三者則在植物體中以次生代謝物形式存在，結(jié)構(gòu)和功能多樣[5]，其中，類胡蘿卜素是自然界廣泛存在的一類脂溶性萜類化合物，是人類和動(dòng)物食物營養(yǎng)的重要來源，是維生素A 合成的前體物質(zhì)[6-7]，其自由基清除能力和抗氧化活性有助于預(yù)防和治療各類癌癥、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和眼病等[8-10]。在植物中，類胡蘿卜素作為次生代謝物參與植物生命過程，具有重要的生物學(xué)功能[11-13]。在植物綠色組織中，類胡蘿卜素作為基礎(chǔ)性代謝物其成分和積累量相對(duì)穩(wěn)定[11]，在植物非綠色組織中，類胡蘿卜素作為特化性代謝物在物種間甚至物種內(nèi)存在巨大差異，其大量積累使許多花、果實(shí)和根呈現(xiàn)鮮艷的橙色、黃色和紅色[14]。研究表明，許多重要經(jīng)濟(jì)作物的果色形成均與類胡蘿卜素大量積累有關(guān)[5,14-17]。在過去10 年里，超過40 個(gè)涉及類胡蘿卜素生物合成的功能基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子已經(jīng)從不同的物種和組織類型中被鑒定出來[18]，但幾乎每個(gè)研究物種、每類組織類型都利用了不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)組來進(jìn)行類胡蘿卜素的生物合成[19]。

花楸屬（SorbusL.）隸屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），廣泛分布于北溫帶，全球有260 余種[20-25]，有較高的觀賞、食用和藥用價(jià)值[23,26-32]。花楸屬植物果色變異豐富，有學(xué)者認(rèn)為花楸果實(shí)顏色是最重要的形態(tài)學(xué)分類性狀[20,23]，因此，花楸屬非常適合用于研究植物果實(shí)顏色多樣性的形成機(jī)制。一些花楸屬植物及品種果實(shí)中富含大量類胡蘿卜素，主要成分為β-胡蘿卜素[33-34]，果實(shí)的著色程度通常與β-胡蘿卜素的積累量正相關(guān)[35-36]，但關(guān)于花楸果色形成機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

我國花楸屬植物有70 余種[22-23,25]，是全球該屬資源最豐富的國家之一[37-38]?；ㄩ睒洌⊿.pohuashanensis(Hance) Hedl.）和北京花楸（S.discolor(Maxim.) Maxim.）分別為花楸屬復(fù)葉組（Sect.Sorbus）百華系（Ser.PohuashanensesYü）和兩色系（Ser.DiscoloresYü）喬木，是我國北方分布范圍較廣的兩個(gè)花楸屬物種[22]，二者有重疊分布[22,39]。花楸樹是一種極具觀賞、食用及藥用等開發(fā)利用價(jià)值的鄉(xiāng)土樹種[40-41]，北京花楸則可做為改良花楸耐日灼性的優(yōu)良育種材料。筆者前期對(duì)花楸樹和北京花楸成熟果實(shí)所含營養(yǎng)物質(zhì)和藥用成分進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)果色為紅色或桔紅色的花楸樹中類胡蘿卜素積累量顯著高于果色為白色的北京花楸[41]，但對(duì)類胡蘿卜素主要成分及其積累模式與果色關(guān)系并不清楚。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）能精確定量類胡蘿卜素，被廣泛應(yīng)用于檢測植物果實(shí)類胡蘿素與植物果色形成相關(guān)性等方面的研究[16-17,42]。因此，本研究利用LC-MS/MS 的方法，對(duì)花楸樹和北京花楸果實(shí)發(fā)育不同階段的類胡蘿卜素成分進(jìn)行定性定量檢測，分析花楸樹和北京花楸果實(shí)中類胡蘿卜素積累模式差異及其與果色形成的關(guān)系，有助于揭示花楸果色形成機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇天然共同分布于河北駝梁山的花楸樹（簡稱SP）和北京花楸（簡稱SD）為研究對(duì)象。為了分析果實(shí)不同發(fā)育階段果色的變化與類胡蘿卜素積累模式的關(guān)系，需分別對(duì)類胡蘿卜素積累量的時(shí)序差異和種間差異水平進(jìn)行比較分析，具體比較分組設(shè)計(jì)為：分別對(duì)每種花楸各自果實(shí)發(fā)育3 個(gè)不同階段的樣本進(jìn)行兩兩比較分析；再分別對(duì)每個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期2 種花楸進(jìn)行種間比較分析。因此，依據(jù)果色變化，分別在2018 年9 月1、14、30 日對(duì)花楸樹和北京花楸3 個(gè)不同發(fā)育階段的果實(shí)進(jìn)行采樣，每次分別隨機(jī)選擇花楸樹和北京花楸各9 株生長良好的植株，每株樹均采集向陽面無明顯病蟲害的果實(shí)10 個(gè)，分別將每種花楸每3 個(gè)隨機(jī)組合的植株果實(shí)進(jìn)行混合作為1 個(gè)檢測樣本重復(fù)，每個(gè)階段每種花楸各3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3 個(gè)階段2 種花楸共計(jì)18 份果實(shí)供試樣本。采集的果實(shí)材料快速用無菌水清洗、擦干并立即投入液氮保存以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

采集的果實(shí)樣本果色時(shí)序變化（圖1）表明：發(fā)育階段A 的2 種花楸果實(shí)均沒有完全褪綠，花楸樹果實(shí)為黃綠色，北京花楸果實(shí)為淺白綠色；發(fā)育階段B 的2 種花楸果實(shí)均已褪綠，花楸樹果實(shí)為淺橙黃色，還未呈現(xiàn)為成熟的顏色，北京花楸果實(shí)為白色，已經(jīng)是成熟的顏色；發(fā)育階段C 的花楸樹果實(shí)基本成熟，果實(shí)為桔紅色，北京花楸果實(shí)維持白色。

圖1 花楸樹(SP)與北京花楸(SD)3 個(gè)發(fā)育階段的果實(shí)Fig.1 The fruits from S.pohuashanensis(SP) and S.discolor (SD) at three different developmental stages

1.2 類胡蘿卜素提取

采用改良Xiong 等[43]的方法提取18 個(gè)供試的花楸果實(shí)樣本及對(duì)照番茄果實(shí)樣本的類胡蘿卜素，抽提時(shí)間為20 min，重復(fù)抽提1 次，復(fù)溶后過0.22 μm 濾膜，保存于棕色進(jìn)樣瓶，用于LC-MS/MS 分析。

1.3 定性定量分析

1.3.1 色譜質(zhì)譜采集條件 采用高效液相色譜儀（HPLC, Shim-pack UFLC140 SHIMADZU CBM30A system; Shimadzu，Kyoto，Japan）串聯(lián)質(zhì)譜儀（MS,6500 Q TRAP; Applied Biosystems, Foster City，CA，USA）的方法對(duì)植物中主要的18 種類胡蘿卜素進(jìn)行定性和定量分析，其中，八氫番茄紅素和六氫番茄紅素為無色類胡蘿卜素，其余16 種為顯色類胡蘿卜素。液相色譜條件根據(jù)Geyer 等[44]的方法進(jìn)行優(yōu)化?；厥章黍?yàn)證該方法符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》和GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》。

色譜柱，YMC C30（3 μm，2 mm×100 mm）；流動(dòng)相A：甲醇和乙腈體積比3:1 加入0.01%BHT，加入0.1%甲酸；流動(dòng)相B：甲基叔丁基醚加入0.01%BHT；洗針液：甲醇；洗脫梯度：0 min 100∶0（V/V），3 min 100∶0（V/V），6 min 58∶42（V/V），8 min 20∶80（V/V），9 min 5∶95（V/V），10 min 100∶0（V/V），11 min 100∶0（V/V）；流速0.8 mL·min?1；柱溫28℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件主要為：大氣壓化學(xué)離子源（Atmospheric pressure chemical iosziaa-lion，APCI）溫度350℃，簾氣（Curtain gas，CUR）25 psi。在Q-Trap 6500 中，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（Declustering potential，DP）和碰撞能（Collision energy，CE）對(duì)每個(gè)離子對(duì)進(jìn)行掃描檢測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫 本研究采用外標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析。分別配制不同濃度的類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，BioBioPha，Sigma-Aldrich）溶液，根據(jù)1.2 色譜質(zhì)譜采集條件，獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰出峰條件和信號(hào)強(qiáng)度等信息，構(gòu)建類胡蘿卜素定性分析數(shù)據(jù)庫，繪制不同類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量分析[45]。

1.3.3 供試樣本定性定量分析 依據(jù)1.2 色譜質(zhì)譜采集條件對(duì)全部樣本進(jìn)行LC-MS/MS 分析。利用軟件Analyst 1.6.3 分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)[45]。根據(jù)類胡蘿卜素保留時(shí)間與離子對(duì)的信息，對(duì)每種類胡蘿卜素在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。通過對(duì)每個(gè)樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖進(jìn)行重疊展示分析，判斷類胡蘿卜素檢測的可重復(fù)性。

根據(jù)類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品離子對(duì)數(shù)據(jù)庫，對(duì)質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程，將類胡蘿卜素的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，得到測定樣本中類胡蘿卜素的絕對(duì)含量數(shù)據(jù)，并分析類胡蘿卜素主要成分。

1.4 類胡蘿卜素積累模式差異分析

采用差異倍數(shù)（fold change, FC）和t檢驗(yàn)結(jié)合的方法對(duì)類胡蘿卜素積累量的時(shí)序和種間差異分別進(jìn)行分析。類胡蘿卜素的差異顯著性篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC≥2 或≤0.5，并且P≤0.05[16-17,42]。當(dāng)FC>1時(shí)，表明vs 后的樣本比vs 前的樣本中類胡蘿卜素積累量增加；當(dāng)FC<1 時(shí)，表明vs 后的樣本比vs 前的樣本中類胡蘿卜素積累量減少。結(jié)合樣本果色性狀，進(jìn)一步分析類胡蘿卜素積累模式與花楸果色變化的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種花楸果實(shí)類胡蘿卜素定性比較分析

對(duì)18 種類胡蘿卜素的定性分析表明，花楸樹與北京花楸果實(shí)中類胡蘿卜素成分分別為12 種和7 種（表1），六氫番茄紅素、ε-胡蘿卜素、花藥黃質(zhì)、蝦青素、辣椒紅素以及辣椒玉紅素這6 種類胡蘿卜素在2 種花楸果實(shí)發(fā)育的3 個(gè)階段中均未檢測到。在花楸樹果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段均檢測到10 種類胡蘿卜素：八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、α-隱黃質(zhì)、葉黃素和β-阿樸胡蘿卜素醛。在北京花楸果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段均檢測到6 種類胡蘿卜素：β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、八氫番茄紅素和葉黃素。新黃質(zhì)僅在花楸樹果實(shí)發(fā)育階段A 中檢測到，番茄紅素僅在花楸樹果實(shí)發(fā)育階段C 中檢測到；γ-胡蘿卜素僅在北京花楸果實(shí)發(fā)育階段B 中檢測到。

2.2 兩種花楸果實(shí)類胡蘿卜素積累模式差異及其與果色關(guān)系分析

2.2.1 花楸樹果實(shí)類胡蘿卜素積累量時(shí)序差異 花楸樹果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段顯色的類胡蘿卜素比例較高（圖2），其中，β-胡蘿卜素在果實(shí)發(fā)育階段A、B、C 的積累量分別為33.40、51.93、81.40 mg·kg?1（表1），其比例也逐漸升高（圖2），分別為54.68%，70.97%和79.36%。FC（表2）和t檢驗(yàn)（表3）分析表明：積累量隨果實(shí)發(fā)育時(shí)序性顯著增加的β-胡蘿卜素是花楸樹果實(shí)類胡蘿卜素的主要成分，其次是β-隱黃質(zhì)，其積累量分別為1.58、6.04、8.28 mg·kg?1（表1），比例分別為2.59%、8.26%和8.07%（圖2），時(shí)序性增加顯著（表2）；葉黃素、玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)積累量（表1）和比例（圖2）時(shí)序性下降，其中葉黃素積累量從17.93 mg·kg?1下降到1.67 mg·kg?1（表1），比例從29.36%下降到1.63%（圖2），時(shí)序差異顯著（表2），對(duì)花楸樹果實(shí)發(fā)育初期果色可能有一定影響；花楸樹果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段，其它8 種類胡蘿卜素積累量和比例均較低（表1），對(duì)果色影響較小。無色的八氫番茄紅素積累量時(shí)序性顯著增加（表2），其比例先升高后降低（圖2）。因此，花楸樹果實(shí)中類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素，同時(shí)還富含β-隱黃質(zhì)，花楸樹果實(shí)顯色程度主要與β-胡蘿卜素積累模式顯著正相關(guān)。

圖2 花楸樹（SP）與北京花楸（SD）果實(shí)3 個(gè)生長階段類胡蘿卜素成分比例Fig.2 Composition ratio of carotenoids in the sampled fruits of S.pohuashanensis（SP）andS.discolor (SD) at three developmental stages

表2 花楸樹（SP）與北京花楸（SD）類胡蘿卜素積累量時(shí)序及種間差異倍數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Timing and species fold changes of carotenoid accumulation in fruits of S.pohuashanensis（SP）and S.discolor (SD)

2.2.2 北京花楸果實(shí)類胡蘿卜素積累量時(shí)序差異北京花楸果實(shí)中每一種顯色類胡蘿卜素的積累量（表1）和比例（圖2）均隨果實(shí)發(fā)育時(shí)序性顯著下降（表2），無色的八氫番茄紅素比例則逐漸升高。北京花楸果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段八氫番茄紅素積累量分別為1.34、2.32、1.52 mg·kg?1（表1），比例分別為20.26%、51.23%和56.74%；而顯色類胡蘿卜素積累量逐漸減少，比例從79.74%下降到43.26%，其中，葉黃素積累量分別為3.55、1.33、0.78 mg·kg?1，比例分別為53.62%、29.34%和29.22%，是北京花楸果實(shí)顯色類胡蘿卜素的主要成分；β-胡蘿卜素次之，積累量分別1.38、0.60、0.33 mg·kg?1，比例分別為20.81%、13.33%和12.22%。其它4 種顯色類胡蘿卜素積累量則較低。因此，北京花楸果實(shí)中類胡蘿卜素主要成分為葉黃素，而北京花楸果色褪綠后持續(xù)顯現(xiàn)為白色，可能與顯色類胡蘿卜素積累量時(shí)序性降低有關(guān)。

2.2.3 類胡蘿卜素積累量種間差異 花楸樹果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段類胡蘿卜素和顯色類胡蘿卜素積累量均高于北京花楸。隨著果實(shí)生長發(fā)育，花楸樹總類胡蘿卜素及顯色類胡蘿卜素積累量均逐漸增加，顯色類胡蘿卜素比例均較高；而北京花楸則相反，總類胡蘿卜素和顯色類胡蘿卜素積累量均逐漸減少，顯色類胡蘿卜素比例較低且逐漸降低?；ㄩ睒涔麑?shí)發(fā)育3 個(gè)階段類胡蘿卜素總積累量分別為61.08、73.67、103.82 mg·kg?1，其中，顯色的類胡蘿卜素總積累量分別為57.75、68.42、97.93 mg·kg?1，比例分別為94.55%、92.87%和94.33%。北京花楸果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段類胡蘿卜素總積累量分別為6.61、4.52、2.68 mg·kg?1，其中，顯色的類胡蘿卜素總積累量分別為5.27、2.20、1.16 mg·kg?1，比例分別為79.73%、48.67%和43.28%。花楸樹果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段類胡蘿卜素及顯色類胡蘿卜素積累量分別是北京花楸的9、16、39 倍和11、30、83 倍。FC（表2）和t檢驗(yàn)（表3）分析表明：果實(shí)發(fā)育3 個(gè)階段，花楸樹果實(shí)中的β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃素、紫黃質(zhì)以及無色的八氫番茄紅素積累量均分別顯著高于北京花楸。

表3 花楸樹（SP）與北京花楸（SD）類胡蘿卜素積累量時(shí)序及種間差異t 檢驗(yàn)（P 值）統(tǒng)計(jì)表Table 3 T testing(P value) for timing and species differences of carotenoid accumulation in fruits of S.pohuashanensis（SP）and S.discolor (SD)

3 討論

花楸樹果實(shí)中類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素，在與花楸樹親緣關(guān)系較近且果色相似的北歐花楸（S.aucuparia）中類胡蘿卜素主要成分也為β-胡蘿卜素[33-34]。花楸樹果實(shí)顯色程度與β-胡蘿卜素積累模式顯著正相關(guān)，而北京花楸果實(shí)中β-胡蘿卜素以及其他顯色類胡蘿卜素積累量顯著低于花楸樹，并隨北京花楸果實(shí)發(fā)育時(shí)序性下降。由此推測，花楸屬植物果實(shí)的著色程度主要與β-胡蘿卜素積累模式顯著正相關(guān)。該結(jié)果在Mikulic-Petkovsek等[35]和Zymone 等[36]研究中也得到了驗(yàn)證，在花楸品種‘Konzentra’（橙色）、‘Alaja krupnaja’（亮橙色）和‘Fructo Lutea’（黃色）果實(shí)中含有大量的β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素物質(zhì)，而在3 個(gè)北歐花楸與北京花楸的雜交品種‘Kirsten Pink’（粉色）、‘Red Tip’（局部淺紅）和‘White Swan’（白色）中類胡蘿卜素積累量均較低。

六氫番茄紅素和番茄紅素是類胡蘿卜素生物合成路徑上游主鏈物質(zhì)[11,14]，γ-胡蘿卜素是β-胡蘿卜素底物[11,14]，但這些物質(zhì)未被檢測到或僅在花楸樹或北京花楸果實(shí)發(fā)育某些階段檢測到少量積累，這可能與相關(guān)功能基因或調(diào)控因子表達(dá)量模式有關(guān)，因此，需從轉(zhuǎn)錄水平展開進(jìn)一步研究。

除了類胡蘿卜素, 花楸樹和北京花楸及其他花楸屬植物果實(shí)中的植物色素還包含花青苷等類黃酮物質(zhì)[35-36,41,46]，花楸屬植物果實(shí)果色形成可能同時(shí)受類胡蘿卜素和花青苷影響，因此，還應(yīng)對(duì)花楸樹和北京花楸果實(shí)中花青苷積累模式展開分析，結(jié)合本研究結(jié)果，共同闡明花楸樹和北京花楸果色形成的關(guān)鍵植物色素物質(zhì)。此外，類胡蘿卜素和花青苷等天然植物色素均屬代謝產(chǎn)物，是果實(shí)顏色表型的基礎(chǔ)和基因組下游的產(chǎn)物。目前，表型、代謝組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組、基因組的多組學(xué)研究成為基礎(chǔ)科學(xué)研究的趨勢，并已應(yīng)用于多種植物果色形成機(jī)理研究中[15-17,42]。因此，基于多組學(xué)的相關(guān)研究和聯(lián)合分析將更有助于揭示花楸屬植物果色形成機(jī)理。

4 結(jié)論

花楸樹果實(shí)中類胡蘿卜素種類和積累量均高于北京花楸。花楸樹果實(shí)中類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素，其積累量隨果實(shí)發(fā)育時(shí)序顯著增加，花楸樹果實(shí)顯色程度與其積累量的增加顯著正相關(guān)；北京花楸果實(shí)中類胡蘿卜素積累量顯著低于花楸樹，并隨果實(shí)發(fā)育時(shí)序性下降，是其果實(shí)為白色而不顯其他顏色的主要原因之一。

致謝：

本項(xiàng)研究的試驗(yàn)樣本采集得到張濤和孫佳偉的協(xié)助，在此表示感謝。