5-磷酸二酯酶抑制劑對慶大霉素所致豚鼠耳毒性影響的研究*

梁媛 張淑君 李慶紅 黃躍雁 馬桂琴 曹靜 張潔 劉春麗 袁玉潔 李俊鵬

藥物性聾是感音神經(jīng)性聾的常見病因之一，其中以氨基糖苷類抗生素所致的感音性聾較為多見，慶大霉素是氨基糖苷類抗生素中較重要的一員，過去近半個世紀(jì)里，國內(nèi)外學(xué)者對慶大霉素耳毒性機(jī)制及其防治進(jìn)行了大量的研究工作，盡管找尋對抗慶大霉素耳毒性藥物已取得一定成績，但并不盡人意。5-磷酸二酯酶(PDE5)是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平的一種蛋白質(zhì)，其參與了哺乳動物許多正常生理過程，如：通過下調(diào)平滑肌細(xì)胞中的環(huán)磷酸鳥苷表達(dá)水平來維持血管、腸管以及陰莖等器官的功能，同時(shí)還可調(diào)節(jié)哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞的生成與凋亡[1]。目前，PDE5抑制劑通過改變NO/cGMP代謝途徑已經(jīng)在性功能障礙、心血管系統(tǒng)、肺動脈等方面取得了公認(rèn)肯定的療效。Jaumann等[2]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在耳蝸中內(nèi)、外毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元里均有PDE5蛋白的表達(dá)，并與部分環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶-1(Prkg1)共定位，提出在這些細(xì)胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1信號傳導(dǎo)，且這種信號傳導(dǎo)可能參與了耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞功能的損傷過程。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2]也顯示，PDE5抑制劑可以在一定程度上減輕豚鼠噪聲性聽損傷[3]。為此，本研究擬通過制造慶大霉素耳毒性豚鼠模型，并給予選擇性PDE5抑制劑他達(dá)那非作為拮抗藥物，探討PDE5抑制劑是否能夠減輕慶大霉素對豚鼠耳蝸功能的損傷，為氨基糖苷類抗生素所致感音性聾的臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 選擇耳廓反射靈敏的2月齡健康雜色雄性豚鼠36只(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),體重240～305 g，隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、慶大霉素組和PDE5抑制劑組，每組12只。各組豚鼠在經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉及無菌條件下于顱頂部雙側(cè)皮層聽區(qū)硬膜外手術(shù)埋植不銹鋼絲慢性電極(記錄電極)，牙科水泥固定，穩(wěn)定1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1各組動物給藥方法 正常對照組未給予特殊處理，慶大霉素組和PDE5抑制劑組豚鼠均給予腹腔注射硫酸慶大霉素(80 毫克/支，華北制藥集團(tuán)制劑有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020452)120 mg·kg-1·d-1，連續(xù)3周；建立慶大霉素耳毒性動物模型。然后，慶大霉素組豚鼠給予腹腔注射生理鹽水(4 ml·kg-1·d-1)，PDE5抑制劑組豚鼠腹腔注射他達(dá)那非(美國禮來制藥廠，批號:C090487)2 mg·kg-1·d-1(將他達(dá)那非用生理鹽水稀釋，4 ml/kg，每日1次)，均連續(xù)給藥4周。

1.2.2聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 建模前1天、慶大霉素給藥3周后及PDE與抑制劑組他達(dá)那非給藥1、2、4周時(shí)分別對慶大霉素組和PDE5抑制劑組進(jìn)行ABR測試；對照組在相同時(shí)間點(diǎn)測試。測試方法：測試儀器為Keyponit型4通道聽覺腦干誘發(fā)電位儀(Dantec，丹麥)，先給予豚鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉使其進(jìn)入睡眠狀態(tài)，將其固定在測試籠中，置于隔聲電屏蔽室內(nèi)。將針形記錄電極置于顱頂正中皮下, 參考電極和接地電極分別置于同側(cè)和對側(cè)乳突, 極間電阻小于或等于 5 kΩ。 雙耳交替給聲, 揚(yáng)聲器放在豚鼠頭前45°方向，同時(shí)距離測量耳道大約2厘米處，采用短聲刺激, 刺激速率為20次/秒，帶通濾波30～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描時(shí)間15 ms，刺激聲極性為交替波。刺激聲強(qiáng)度從80 dB SPL 開始, 以5 dB為步距將刺激聲逐漸下降到10 dB SPL，以引出波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為ABR閾值。同時(shí)記錄刺激聲強(qiáng)為80 dB SPL時(shí)波Ⅰ潛伏期。

1.2.3耳蝸電鏡標(biāo)本制作 從三組中各任意選取6只豚鼠,取其右耳耳蝸?zhàn)鳛閽呙桦婄R觀察對象。豚鼠完成最后給藥(分別應(yīng)用他達(dá)那非、生理鹽水4周)及ABR測試后斷頭處死,取出顳骨，在解剖顯微鏡下打開聽泡，蝸尖鉆孔及鐙骨脫位，2.5%戊二醛前固定，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中漂洗3次，每次10 min，1%鋨酸固定1 h,再經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗、乙醇梯度脫水和干燥，金屬鍍膜，在掃描電鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中豚鼠無死亡，未發(fā)現(xiàn)中耳感染、行走不穩(wěn)等跡象，給藥后均未出現(xiàn)明顯的藥物不良反應(yīng)。

2.1實(shí)驗(yàn)前后三組豚鼠ABR反應(yīng)閾比較 組內(nèi)比較：實(shí)驗(yàn)前后空白對照組豚鼠ABR反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；慶大霉素組和PDE5抑制劑組豚鼠在慶大霉素注射后均表現(xiàn)為ABR反應(yīng)閾升高，且均明顯高于同組建模前，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予他達(dá)那非后，PDE5抑制劑組ABR反應(yīng)閾呈下降趨勢，用藥4周后ABR閾值明顯低于用藥前水平，但仍明顯高于建模前水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；慶大霉素組用生理鹽水后ABR反應(yīng)閾仍呈上升趨勢，用藥4周后與用藥第1周相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

組間比較：三組豚鼠在建模前ABR閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在慶大毒素注射三周后及繼續(xù)用藥1周、2周及4周后，慶大霉素組與PDE5抑制劑組ABR閾值均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PDE5抑制劑組與慶大霉素組相比，除建模前和慶大霉素注射后這兩個時(shí)間點(diǎn)以外，用他達(dá)那非后各時(shí)間點(diǎn)ABR閾值均較慶大霉素組低(均為P<0.05)。經(jīng)重復(fù)測量方差分析，三組在組間、不同時(shí)點(diǎn)間、組間與不同時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 三組豚鼠建模前、慶大霉素注射3周后及繼續(xù)用藥1、2、4周的ABR反應(yīng)閾比較

2.2三組豚鼠波ABR波Ⅰ潛伏期比較 組內(nèi)比較：實(shí)驗(yàn)前后空白對照組豚鼠ABR波Ⅰ潛伏期無明顯變化(P>0.05)。慶大霉素組建模后波Ⅰ潛伏期持續(xù)性延長，建模后各個時(shí)間點(diǎn)波Ⅰ潛伏期相較建模前延長(P<0.05)。PDE5抑制劑組豚鼠在用他達(dá)那非藥后1、2、4周波Ⅰ潛伏期持續(xù)下降，均低于慶大霉素組，且與建模前和慶大霉素注射后相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

組間比較：在慶大霉素注射后，慶大霉素組和PDE5抑制劑組與對照組相比較，其潛伏期均有所延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PDE抑制劑組與慶大霉素組相比較，除慶大霉素注射3周這一時(shí)間點(diǎn)以外，繼續(xù)用藥1、2、4周后波Ⅰ潛伏期均有顯著性差異(P<0.05)。三組在組間、不同時(shí)點(diǎn)間、組間與不同時(shí)點(diǎn)間交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 三組豚鼠建模前、慶大霉素注射3周后及繼續(xù)用藥1、2、4周時(shí)ABR波Ⅰ潛伏期比較

2.3三組豚鼠耳蝸掃描電鏡觀察 空白對照組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，界限清楚(圖1a)。慶大霉素組外毛細(xì)胞損傷明顯，主要表現(xiàn)為聽毛紊亂、融合及缺失(圖1b)。PDE5抑制劑組豚鼠耳蝸損傷相對較輕，外毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，與空白對照動物相比差異不大，外毛細(xì)胞聽毛僅有輕微傾倒融合現(xiàn)象(圖1c)。

3 討論

目前研究[4～6]認(rèn)為，氨基糖苷類抗生素所導(dǎo)致的耳毒性與毛細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有著密切的關(guān)系。氨基糖苷類抗生素進(jìn)入內(nèi)耳后，可被內(nèi)耳中毛細(xì)胞吸收，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+表達(dá)水平異常增加，影響腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的合成，從而引起毛細(xì)胞凋亡，造成不可逆性的聽損傷。一方面，內(nèi)耳中存在著NO/cGMP路徑，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來維持正常生理功能，尤其是在聽覺傳導(dǎo)、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境以及改善內(nèi)耳循環(huán)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中，耳蝸中的Hensen細(xì)胞在整個聽覺傳導(dǎo)中有著重要地位，其細(xì)胞間存在豐富的縫隙連接，氨基糖苷類抗生素進(jìn)入內(nèi)耳之后，Hensen細(xì)胞中ATP異常升高，可阻斷細(xì)胞間縫隙連接，從而改變正常的耳蝸功能[7]。與此同時(shí)，外毛細(xì)胞的低滲應(yīng)激也能夠增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，同時(shí)促進(jìn)NO產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，在外毛細(xì)胞的相同亞細(xì)胞區(qū)域中，可以檢測到PDE5和Prkg1非常接近，說明外毛細(xì)胞中可能存在cGMP信號傳導(dǎo)復(fù)合物[8]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，NO/cGMP途徑可以減少在離體狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的Ca2+升高幅度[9]，從而改善由ATP引起Hensen細(xì)胞之間縫隙連接通訊的抑制，有利于維持耳蝸正常的功能。另一方面，ATP通過P2γ受體引起血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮舒張因子，從而引起血管擴(kuò)張，而后者證明就是NO。已證實(shí)NO是聽覺系統(tǒng)的一種重要生物活性物質(zhì)，參與耳蝸的生理及病理變化過程，它具有雙重作用：體外研究表明[10]，生理劑量的NO對耳蝸有保護(hù)作用，可通過抑制毛細(xì)胞內(nèi)過量的鈣負(fù)荷，即抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載來發(fā)揮作用；而過量的NO可導(dǎo)致毛細(xì)胞的缺失，甚至還可以作為凋亡的啟動子誘導(dǎo)毛細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等發(fā)生凋亡。說明ATP與Ca2+互相作用且可能通過NO/cGMP途徑影響耳蝸的生理功能[11]。

他達(dá)那非作為一種選擇性PDE5抑制劑，能夠通過抑制海綿體內(nèi)分解cGMP 的PDE5來增強(qiáng)NO并調(diào)節(jié)Ca2+濃度來發(fā)揮作用。cGMP作用于包括cGMP依賴性蛋白激酶(Prkg)在內(nèi)的特異性受體蛋白，表達(dá)Prkg神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞，如：豚鼠耳蝸支持細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SGNs)[12]，通過PDE水解第二信使分子cGMP終止信號。研究表明，PDE5-Prkg1-cGMP-PARP信號肽存在于耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)，PARP1是一種表達(dá)廣泛的DNA缺口末端傳感器，以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為底物催化PAR加入受體蛋白，特別是組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)本身[13]，后者因DNA斷裂被激活，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和DNA堿基切除修復(fù)[14]。矛盾的是，NO的毒性作用，又與DNA損傷、PARP1的過度激活有關(guān)，并且伴隨NAD+耗盡或ATP耗盡導(dǎo)致細(xì)胞死亡；在這種情況下，PDE5抑制劑既可以增強(qiáng)cGMP信號傳導(dǎo)的保護(hù)作用又不會因NO過多而增加破壞作用，特別是因?yàn)镻ARP活化也可能由cGMP直接引起[15，16]。本研究結(jié)果顯示，在慶大霉素致豚鼠耳毒性造模成功后，PDE5抑制劑組應(yīng)用他達(dá)那非4周，慶大霉素組應(yīng)用生理鹽水4周，慶大霉素組ABR平均閾值仍然高達(dá)49 dB SPL以上，波Ⅰ平均潛伏期達(dá)1.98 ms，可以認(rèn)為該組動物已有永久性閾移；而PDE5抑制劑組豚鼠在應(yīng)用他達(dá)那非1、2周， ABR閾移及波Ⅰ潛伏期延長的幅度均明顯低于同期慶大霉素組,在用藥4周后,ABR閾值明顯低于同期慶大霉素組及應(yīng)用他達(dá)那非前水平；提示他達(dá)那非對慶大霉素所致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷具有一定的減輕作用。本研究通過電鏡觀察還發(fā)現(xiàn)，慶大霉素組耳蝸外毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重，PDE5抑制劑組外毛細(xì)胞損傷明顯輕于前者。由此推論腹腔內(nèi)注射一定劑量的他達(dá)那非，可以減輕慶大霉素對豚鼠聽功能的損害，對耳蝸毛細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，PDE5抑制劑他達(dá)那非對慶大霉素所致豚鼠聽功能及毛細(xì)胞損傷有一定的拮抗作用，但其作用機(jī)制及是否是通過迷路屏障到達(dá)內(nèi)耳微環(huán)境起作用尚需進(jìn)一步研究，能否使用PDE5抑制劑作為感音神經(jīng)性聾的治療方法有待深入研究及論證。