三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶基因1 的克隆及功能鑒定*

宋 柳 張 鳳 呂建建 劉 萍① 高保全 李 健

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心 上海 201306)

幾丁質(zhì)(Chitin)是昆蟲和甲殼動物外骨骼和圍食膜的主要分子成分，是由β-1,4 糖苷鍵連接的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖直鏈多聚糖，其含量僅次于纖維素，為第二大天然多糖(Zhang et al, 2013; Qiang et al,2018)。幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是廣泛存在于動物、植物、真菌、細菌和病毒中的一種能夠隨機催化幾丁質(zhì)聚合物水解的酶(Adrangi et al, 2013; Umemoto et al,2013)。在甲殼動物中，幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)類食物的消化、蛻皮和應(yīng)激反應(yīng)等生理功能中起關(guān)鍵作用(Zou et al, 2004; Merzendorfer, 2006; Gao et al, 2017)。

幾丁質(zhì)酶基因是一個具有GH18 和GH19 兩大家族的多基因家族(Gao et al, 2018; Gayathri et al,2018)，目前，在隸屬于GH18 家族的主要經(jīng)濟甲殼動物中均已開展了幾丁質(zhì)酶基因相關(guān)功能的研究，并且根據(jù)基因結(jié)構(gòu)特征將其歸為7 大類(Group1～7，其所屬的基因也大多相應(yīng)的命名為Cht1～7)，但三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幾丁質(zhì)酶基因僅發(fā)現(xiàn)了其中3 類，包括Group3(張鳳等, 2017)、Group5(宋柳等, 2019)和Group7(張鳳等, 2015)，還有很多未知的基因有待發(fā)掘。甲殼動物Group1 幾丁質(zhì)酶基因多在肝胰腺中有較高表達，而肝胰腺是消化酶分泌的重要器官，表明其發(fā)揮著消化幾丁質(zhì)類食物的功能。Salma等(2012)在日本仿長額蝦(Pandalopsis japonica)研究中發(fā)現(xiàn)，Pj-Cht1 主要在肝胰腺中表達，可能在幾丁質(zhì)類食物的消化中起作用。凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) LvChi1 基因(Huang et al, 2010; Rocha et al,2012)和擬穴青蟹(Scylla paramamosain) (Zhou et al,2018) SpCht1 基因均在肝胰腺中特異性表達，推測其參與了幾丁質(zhì)類食物的消化。類似結(jié)果在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) (Li et al, 2015)、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus) (Watanabe et al, 1996、1998)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon) (Proespraiwong et al, 2010)和中國對蝦(Fenneropenaeus chinenis)(Priya et al, 2009)等物種中也有發(fā)現(xiàn)。此外，也有研究顯示，在尾扇、眼柄、鰓等組織(Watanabe et al, 1997; Rocha et al, 2012)亦有幾丁質(zhì)酶Group1 基因的表達，暗示了其功能的多樣性，可能參與了多種生理學(xué)進程。例如，日本沼蝦(Macrobrachium nipponense) (Zhang et al,2014) MnCht1A 和MnCht1B 除了在肝胰腺中高表達外，在表皮和腸道中亦有少量分布，表明該基因可能還在腸內(nèi)圍食膜中內(nèi)源幾丁質(zhì)的降解以及幾丁質(zhì)外骨骼的分解中起作用。然而，Group1 幾丁質(zhì)酶基因的結(jié)構(gòu)及功能雖在其他蝦蟹中有較多研究，但在三疣梭子蟹中相關(guān)的內(nèi)容卻鮮有報道。

本研究中，通過RACE 克隆、生物信息學(xué)分析及qRT-PCR 等方法對三疣梭子蟹PtCht1 基因的結(jié)構(gòu)及功能進行探究，明確基因的分類，解析PtCht1 在促進消化等方面的功能，可為三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶GH18 家族Group1 基因的研究奠定基礎(chǔ)，為耐低鹽新品種的培育提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所實驗基地—山東濰坊昌邑市海豐水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖的健康三疣梭子蟹，濕重為(5.78±1.11) g。室內(nèi)養(yǎng)蟹池4 個，體積均為20 m3，每池150 只蟹，暫養(yǎng)7 d。鹽度33、pH 8.7 的自然海水養(yǎng)殖，水溫控制在(25±1)℃，保持氧氣供應(yīng)充足，每天定時更換1/3 水量，每天 18:00 定時投喂新鮮藍蛤(Potamocorbula laevis)。

1.2 全長cDNA 的克隆及測序

隨機取8 只(雌雄各4 只)暫養(yǎng)后四肢健全且充滿活力的健康三疣梭子蟹，解剖取樣，包括心臟、肝胰腺、腸、鰓、胸神經(jīng)節(jié)、肌肉、腦、眼柄、胃、表皮、精巢和卵巢，液氮冷凍后，將所有樣品的同一組織混合后進行研磨，Trizol 法提取總RNA，通過Thermo的NanoDrop 2000 核酸定量儀與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，選取高質(zhì)量的總 RNA，混勻后用SMARTTMRACE Amplification Kit 合成用于3?和5? RACE 的cDNA 模板。依據(jù)三疣梭子蟹高通量測序數(shù)據(jù)庫中 PtCht1 的已知表達序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag, EST)，運用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計3?和5?RACE 特異性引物(PtCht1 F 和PtCht1 R)、通用引物(UPM)和ORF 驗證引物(PtCht1 Fi 和PtCht1 Ri)(表1)。利用Advantage 2 PCR Kit 對3?和5?末端進行擴增。純化后的擴增產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接后轉(zhuǎn)入DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞中擴大培養(yǎng)，挑取陽性單克隆，利用DNA 測序通用引物M13-47/48 進行菌落PCR 鑒定，將目的產(chǎn)物送至睿博生物公司進行測序。利用Vector NTI 11.0 去掉測序結(jié)果中冗余序列后，拼接獲得完整的基因序列。

1.3 序列分析

利用軟件BioEdit 預(yù)測ORF 開放閱讀框，并翻譯蛋白序列；將蛋白序列提交至在線分析軟件SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，預(yù)測信號肽；利用NCBI 的保守結(jié)構(gòu)域(CDD)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)進行功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和確定；使用DNAMAN 分析軟件將三疣梭子蟹的氨基酸序列與其他物種進行多重序列比對；通過軟件MEGA 6.0 以Neighbor Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(段亞飛等, 2013)。

1.4 蛻皮周期實驗

根據(jù)甲殼硬度和游泳足趾節(jié)末端新舊表皮的變化(沈潔等, 2011)，將部分暫養(yǎng)7 d 后的健康三疣梭子蟹分成蛻皮間期(甲殼硬，無新表皮出現(xiàn))、蛻皮前期(甲殼硬，出現(xiàn)新表皮)和蛻皮后期(甲殼柔軟)，每個時期隨機取3 只，取其血細胞、第1 對鰓、第6 對鰓、胃、肝胰腺、心臟、表皮、肌肉、眼柄和腸組織于液氮速凍保存，實驗設(shè)置3 個平行。

表1 三疣梭子蟹PtCht1 基因克隆和實時熒光定量所用引物序列Tab.1 Primer sequences for cloning and qRT-PCR of PtCht1 gene in P. trituberculatus

1.5 鹽度脅迫實驗

正式實驗前，隨機挑取240 只暫養(yǎng)7 d 后充滿活力的健康三疣梭子蟹進行低鹽脅迫預(yù)實驗，實驗方法參照隋延鳴等(2012)。設(shè)置4 個鹽度梯度，分別為33(對照)、13、11 和9，每個鹽度下放置20 只蟹，設(shè)置3 個平行，統(tǒng)計24、36、48 和72 h 三疣梭子蟹死亡數(shù)，計算結(jié)果顯示，72 h 半致死鹽度為11，由此正式實驗設(shè)置2 個鹽度，即對照組(33)和低鹽組(11)。低鹽度海水由自然海水(33)與淡水調(diào)配而成，每組設(shè)3 個平行，每個平行50 只蟹。分別在脅迫后0、3、6、12、24、48 和72 h 取3 只梭子蟹的肝胰腺和鰓組織，液氮速凍保存，便于后續(xù)提取RNA。

1.6 PtCht1 基因mRNA 的實時定量PCR 檢測

將獲得的組織樣品利用Trizol 法提取總RNA，檢測方法同 1.2。選取高質(zhì)量的總 RNA 樣品，參照TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR 分析(qRT-PCR)。根據(jù)拼接獲得的PtCht1 基因cDNA 序列全長和已知的三疣梭子蟹管家基因β-actin，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量特異性引物(PtCht1 qF 和PtCht1qR)和內(nèi)參引物(β-actin-F 和β-actin-R) (表1)，通過實時定量PCR 法對PtCht1 基因在各個組織和各實驗組中的相對表達量進行檢測分析，反應(yīng)體系及程序參照TOYOBO SYBR? Green Real-time PCR Master Mix說明書進行，結(jié)果采用2–ΔΔCt方法計算，借助SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Origin Pro 和Excel 軟件將結(jié)果整理統(tǒng)計，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PtCht1 基因的cDNA 全長克隆及序列分析

以三疣梭子蟹各組織的混合cDNA 為模板進行RACE 擴增，獲得3?-981 bp 和5?-477 bp 的cDNA 片段。將擴增的片段與已知的EST 序列拼接，得到完整的幾丁質(zhì)酶 1 基因的 cDNA，命名為 PtCht1(GenBank No.: KM100752)?；蚪Y(jié)構(gòu)如圖1 所示，序列全長共2220 bp，其中，3?端及5?端非編碼區(qū)分別為324 bp 和144 bp，開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)為1752 bp，共編碼氨基酸583 個，分子量為65.68 kDa，理論等電點為5.84。通過DNAstar 7.1.0 (Lasergene)軟件包中EditSeq 蛋白統(tǒng)計程序分析一級結(jié)構(gòu)的基本性質(zhì)。結(jié)果顯示，PtCht1 基因編碼的氨基酸組成中強堿性(R 和Lys)、強酸性(D 和E)、疏水性(A、I、L、F、W 和V)和極性氨基酸(S、C、N、Q、Y 和T)殘基的數(shù)目分別為78、83、266 和141 個。此外，圖1 結(jié)合圖2 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，N 端存在22 個氨基酸的信號肽序列，46～397 個氨基酸為1 個含4 個保守基序的糖基水解酶第18 家族催化結(jié)構(gòu)域(GH18 catalytic domain)和活性位點161FDGFDL DWE169，在463～518 個氨基酸處，含6 個半胱氨酸(Cys)和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ChtBD2)。

2.2 PtCht1 的同源性分析

圖1 三疣梭子蟹PtCht1 基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of P. trituberculatus PtCht1

圖2 三疣梭子蟹PtCht1 基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域位置Fig.2 The protein domain architecture of P. trituberculatus PtCht1

將三疣梭子蟹Cht1 的氨基酸序列與其他物種進行同源性比對分析(圖3)可知，PtCht1 基因與擬穴青蟹SpCht1 的同源性最高，為92.80%，與鋸緣青蟹(Scylla serrata)、日本蟳(Charybdis japonica)、凡納濱對蝦、日本對蝦、日本沼蝦和中華絨螯蟹的同源性次之，分別為91.94%、90.85%、80.87%、76.98%、75.70%和75.00%。此外，甲殼動物幾丁質(zhì)酶GH18 催化結(jié)構(gòu)域的4 個保守基序MotifⅠ～Ⅳ和含6 個Cys 的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域ChtBD2 在上述幾個物種中均存在。系統(tǒng)進化樹圖譜顯示(圖4)，甲殼動物第18 家族幾丁質(zhì)酶主要分為7 大類，分別以Cht1、Cht2、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6 和Cht 聚類于Group 1～7。三疣梭子蟹PtCht1 基因與凡納濱對蝦、日本對蝦、斑節(jié)對蝦、鋸緣青蟹、中國對蝦、日本沼蝦和日本仿長額蝦的Cht1聚為一類，隸屬于Group1。

2.3 基因PtCht1 的組織分布特征分析

利用qRT-PCR 技術(shù)，對三疣梭子蟹PtCht1 基因進行了全組織表達分布分析。結(jié)果顯示，PtCht1 在肝胰腺、胃、腸、表皮、肌肉、眼柄、心臟、第6 對鰓、血細胞和第1 對鰓中均有表達，其中，在肝胰腺中的表達量最高，胃次之，而在其他組織中少有表達(圖5)。

圖4 三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶蛋白PtCht1 的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of chitinase PtCht1 fromP. trituberculatus

2.4 PtCht1 在蛻皮周期中的表達

PtCht1 基因在三疣梭子蟹不同蛻皮時期的肝胰腺中的表達模式顯示(圖6)，PtCht1 在蛻皮間期的肝胰腺中的表達量最高，蛻皮后期次之，在蛻皮前期最低，不同蛻皮時期之間表達量差異顯著(P＜0.05)。

2.5 PtCht1 在低鹽脅迫下的表達

圖6 PtCht1 基因在三疣梭子蟹不同蛻皮時期肝胰腺中的表達水平Fig.6 Relative mRNA expression level of P. trituberculatus PtCht1 gene in hepatopancreas during molting

三疣梭子蟹在進行72 h 低鹽度(11)脅迫后，PtCht1基因在肝胰腺及第6 對鰓中的相對表達量如圖7 所示。在肝胰腺中，相比于對照組，脅迫后的PtCht1基因的相對表達量在3 h 急劇上升，達到最大值，為對照組的2.72 倍，呈顯著上調(diào)表達(P＜0.05)，6 h 迅速降低，至24 h 均為顯著下調(diào)表達(P＜0.05)，其中，12 h 降至最小值，為對照組的0.23 倍，48 h 再次回升至對照組水平，72 h 增至上調(diào)表達(P＜0.05)。在第6 對鰓組織中，相比對照組，脅迫后的PtCht1 基因在3～6 h 呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(P＜0.05)，至6 h 達到第1 個峰值，為對照組的2.67 倍，12 h 急劇降低至最小值，為對照組的0.46 倍，呈顯著下調(diào)表達(P＜0.05)，24 h后逐漸上升，至72 h 達到最大值，為對照組的9.96倍，呈顯著上調(diào)表達(P＜0.05)。

圖7 低鹽脅迫下三疣梭子蟹PtCht1 在肝胰腺和第6 對鰓的表達水平Fig.7 Relative mRNA expression levels of P. trituberculatus PtCht1 gene in the hepatopancreas and sixth gill under low salinity stress

3 討論

三疣梭子蟹養(yǎng)殖的不同發(fā)育階段的動物性餌料多以鹵蟲、雜魚、藍蛤等為主，而這一攝食組成中含有大量的幾丁質(zhì)成分，需要幾丁質(zhì)酶進行消化分解后才能吸收(Das et al, 2018; Zhou et al, 2018)。本研究成功克隆三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶基因1 (PtCht1)，其編碼的蛋白具有含第18 家族保守基序的催化結(jié)構(gòu)域、活性位點(FDGLDLDVE)以及幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域ChtBD2 (Boot et al, 2001)，且ChtBD2 含6 個保守的半胱氨酸，可形成3 個二硫鍵，對穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)及調(diào)控幾丁質(zhì)酶的活性十分重要(Zhou et al,2017)。氨基酸比對及系統(tǒng)進化樹分析顯示，PtCht1與擬穴青蟹SsCht1 基因的同源性最高，同時，與其他甲殼動物幾丁質(zhì)酶1 緊密聚為一支。由此，根據(jù)結(jié)構(gòu)域和活性位點的高度保守性結(jié)合聚類分析，確定了PtCht1 基因為三疣梭子蟹第18 家族幾丁質(zhì)酶基因，且隸屬于Group1。

甲殼動物幾丁質(zhì)酶1 基因常高表達于肝胰腺中，而肝胰腺是分泌消化酶的主要場所，故幾丁質(zhì)酶1 基因在肝胰腺中的功能與幾丁質(zhì)類食物的消化相關(guān)(Watanabe et al, 1998)。本研究中，三疣梭子蟹PtCht1基因在肝胰腺和胃等消化器官中的表達量遠高于其他組織，表明PtCht1 亦可能發(fā)揮消化幾丁質(zhì)類食物的功能，這與Zhang 等(2010)關(guān)于中國對蝦的幾丁質(zhì)酶基因FcCht1 和FcCht3 的報道類似。此外，Zhang等(2014)發(fā)現(xiàn)，日本沼蝦MnCht1A 和MnCht1B 基因可能與可溶性幾丁質(zhì)的消化水解有關(guān)，因其具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域ChtBD2，而PtCht1 同樣具有該結(jié)構(gòu)，所以PtCht1 可能與非可溶性幾丁質(zhì)類食物的消化有關(guān)。

斑節(jié)對蝦幾丁質(zhì)酶PmCht1(Tan, 2000)與日本對蝦PjCht1(Watanabe et al, 1996)高度同源，均在肝胰腺中特異性表達，被認(rèn)為主要與幾丁質(zhì)類食物的降解有關(guān)，且在不同的蛻皮階段，肝胰腺mRNA 水平上的表達差異顯著。PtCht1 在蛻皮間期，表達量顯著升高(P＜0.05)，但在蛻皮前期和后期有所下降，可能與三疣梭子蟹的生活習(xí)性相關(guān)。一般情況下，梭子蟹在蛻皮前期和后期階段攝食停滯，而在蛻皮間期，處于快速生長階段，攝食活躍，需要更多的幾丁質(zhì)酶消化食物(周凱敏, 2017)，進一步表明PtCht1 在消化中發(fā)揮重要作用。

鹽度是影響三疣梭子蟹生長的主要環(huán)境因素之一(何鵬等, 2019)。本研究探究了低鹽脅迫對幾丁質(zhì)酶基因的表達和三疣梭子蟹生長的影響。結(jié)果顯示，低鹽度會干預(yù)PtCht1 基因的正常表達，使其在肝胰腺中呈先上調(diào)后下調(diào)再回升的表達規(guī)律，并且PtCht1基因亦能夠?qū)}度的改變做出快速應(yīng)答，在3 h 即達到峰值，而已有研究表明，低鹽度條件下，需要機體提供更多的能量來調(diào)節(jié)滲透壓(Ye et al, 2009)，由此推斷，PtCht1 可能在促進食物消化，提供機體所需的能量，進而調(diào)控三疣梭子蟹生長及機體應(yīng)對低鹽脅迫過程中具有重要作用(Nikapitiya et al, 2015; Lu et al,2019)。三疣梭子蟹主要依靠后鰓進行滲透壓的調(diào)節(jié)，PtCht1 基因在低鹽度脅迫下第6 對鰓中的表達具有顯著性差異，除12 h 外，整體為上調(diào)表達，暗示了PtCht1 基因可能參與抗低鹽脅迫的滲透壓調(diào)節(jié)過程(Lü et al, 2013)，并發(fā)揮積極作用，但詳細的調(diào)節(jié)機制尚需進一步探索。

綜上所述，本研究克隆并分析了三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶基因GH18 家族Group1 成員PtCht1 基因的結(jié)構(gòu)特征，豐富了甲殼動物幾丁質(zhì)酶基因家族。通過分析PtCht1 基因的組織表達特征，蛻皮周期及低鹽度脅迫下的表達模式，探究了基因在三疣梭子蟹消化、生長及滲透壓調(diào)節(jié)方面發(fā)揮的生理功能，可為甲殼動物幾丁質(zhì)酶基因的相關(guān)調(diào)控機理研究提供參考信息，對快速生長及耐低鹽新品種的培育提供新途徑。