地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚生長、腸道消化酶、血清非特異性免疫及抗病力的影響*

樊 英 王曉璐 于曉清 劉洪軍 葉海斌王淑嫻 刁 菁 胡發(fā)文 菅玉霞

(山東省海洋生物研究院 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島 266104)

近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模迅速發(fā)展、集約化程度不斷提升，養(yǎng)殖動物疾病頻發(fā)，而為控制病害暴發(fā)濫用各種藥物，不僅破壞了養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，也帶來了養(yǎng)殖產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題。然而，益生菌制劑在保證生態(tài)環(huán)境平衡、食品安全的前提下，因其具有促生長、提免疫、保健康的良好優(yōu)勢，已成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的熱點。研究表明，益生菌的應(yīng)用可明顯促進(jìn)養(yǎng)殖動物的生長(Madani et al, 2018; Azarin et al, 2015)，提高溶菌酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及蛋白酶的活性，間接提升機(jī)體免疫力(劉淑蘭等, 2017;Abarike et al, 2018)，或調(diào)控養(yǎng)殖動物機(jī)體內(nèi)免疫球蛋白、熱休克蛋白等重要基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)防御能力(Huang et al, 2015)。在眾多已批準(zhǔn)的飼料添加劑中，芽孢桿菌(Bacillus)是被研究最多的菌種之一，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)等。本研究選用地衣芽孢桿菌，屬于孢子形成菌，加工過程能夠抵抗飼料顆?；臒岫?，被攝食后在養(yǎng)殖動物體內(nèi)能夠存活，增殖過程中能夠分泌各種酶類，提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)(El-Haroun et al,2006)，對動物機(jī)體無明顯的毒副作用，具有高效、綠色和安全等特點，市場發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用大瀧六線魚來自青島魯海水產(chǎn)技術(shù)發(fā)展公司，游動活潑，體色光亮正常，食欲旺盛，未發(fā)現(xiàn)病癥，初始平均體重為(22.0±2.0) g。地衣芽孢桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，通過營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基活化，–80℃保存?zhèn)溆谩９ザ舅脷Ⅴq氣單胞菌為本實驗室保存?；A(chǔ)配合飼料來自北京漢業(yè)科技有限公司，其營養(yǎng)水平為粗蛋白質(zhì)471 g/kg、粗脂肪174 g/kg、粗灰分96 g/kg、可溶性膳食纖維5.91 g/kg、水解氨基酸之和404.4 g/kg、Ca 1.52×104mg/kg、Fe 808 mg/kg、Zn 137 mg/kg、水分75.3 g/kg。

地衣芽孢桿菌通過大豆蛋白胨肉湯培養(yǎng)基30℃過夜培養(yǎng)，濃度達(dá)1010CFU/ml。按照0.5%和1.0%比例將活化的菌液均勻噴灑到基礎(chǔ)飼料上，攪拌均勻，陰涼處晾干，再在其表面直接包裹一層雞蛋稀蛋白液(水分為85.5%，蛋白質(zhì)為2.8%，脂肪為0.25%，碳水化合物為0.77%)，陰干后4℃保存?zhèn)溆?活菌數(shù)分別為5×107和1×108CFU/g)。對照組基礎(chǔ)飼料同樣包裹蛋白液，陰干后4℃保存?zhèn)溆?。每次制備實驗飼料保存期限? d。

1.2 實驗設(shè)計及飼養(yǎng)條件

養(yǎng)殖實驗于2018 年11 月15 日～2019 年1 月25日在山東省海洋生物研究院養(yǎng)殖實驗室進(jìn)行。選取大小均勻、健康正常的大瀧六線魚隨機(jī)分成3 組，每組3 個平行，每個平行30 尾，放養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(500 L)中，實驗前用基礎(chǔ)配合飼料暫養(yǎng)10 d。對照組(Control)投喂僅有蛋白液包裹的基礎(chǔ)配合飼料；實驗組(B. licheniformis)分別投喂添加0.5%和1.0%地衣芽孢桿菌的實驗飼料。

實驗過程中每天排污、吸除殘餌，每天分別在10:00 和18:00 投喂2 次，日投喂量為魚體重的2%，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整投喂量，達(dá)到飽食投喂，無殘餌剩余，飼喂餌料在1 h 內(nèi)攝食完。實驗期間水溫為(11.5±1.0)℃，溶氧為(7.0±0.5) mg/L，pH 為7.2±0.3，氨氮和亞硝酸氮含量＜0.1 mg/L。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長指標(biāo)檢測 喂養(yǎng)實驗結(jié)束后，將魚饑餓24 h，對每個平行組中的魚進(jìn)行計數(shù)和稱重(終末體重)，計算成活率(Survival rate, SR)和特定生長率(Specific growth rate, SGR)。計算公式為：

SR=(終末活魚尾數(shù)/初始活魚尾數(shù))×100%

SGR=(ln 末均重–ln 初均重)/實驗天數(shù)×100%

1.3.2 血清樣品采集及免疫相關(guān)酶指標(biāo)檢測 喂養(yǎng)實驗過程中，每10 d 隨機(jī)從每個平行組中抽取3 尾實驗魚，用無菌注射器從尾靜脈處采血，將血液迅速置入離心管后于4℃下靜置6 h，以3000 r/min離心10 min，取血清迅速置于液氮中，–80℃超低溫保存、備測。

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Microscale malondialdehyde, MDA)、總抗氧化能力(Total antioxidant, T-AOC)以及過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，反映機(jī)體抗氧化能力的變化。

谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)和己糖激酶(Hexokinase, HK)活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒的操作方法測定，反映機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)代謝能力的變化。

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、腺苷脫氨酶(ADA)和膽堿酯酶(CHE)活性均按照南京建成生物工程研究所試劑盒微板法測定，從肝功能相關(guān)指標(biāo)的變化間接反映機(jī)體免疫力。

1.3.3 腸道樣品采集及消化酶活性檢測 實驗過程每10 d 分別從每個平行組取3 尾實驗魚，冰上無菌操作取前中腸腸道樣品，按1∶9 (m/v)比例加入預(yù)冷的0.85%生理鹽水，冰浴勻漿后2500 r/min 離心10 min，取上清液備測。胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定。

1.4 血清免疫指標(biāo)間的相關(guān)性研究

經(jīng)SPSS 19.0 進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，確定雙側(cè)檢驗顯著性(P＜0.01 或P＜0.05)。

1.5 攻毒感染實驗

本實驗室保存的殺鮭氣單胞菌經(jīng)腦心浸液培養(yǎng)基(Brian Heart Infusion, BHI) 28℃培養(yǎng)24 h，預(yù)實驗確定半致死濃度(LD50)，用無菌生理鹽水調(diào)整濃度為108CFU/ml。芽孢桿菌喂養(yǎng)實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)取15 尾魚進(jìn)行攻毒實驗，經(jīng)肌肉注射100 μl 殺鮭氣單胞菌稀釋液，對照組注射相同劑量的生理鹽水。實驗期間觀察感染后大瀧六線魚的表征并及時記錄日死亡情況，及時取出死亡魚體，14 d 后結(jié)束感染實驗并統(tǒng)計其累積死亡率。計算公式如下：

累積死亡率(Cumulative mortality rate, %)=累積死亡數(shù)量/初始數(shù)量×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE, n=3)，通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和柱狀圖繪制，同時通過Tukey?s檢驗方法對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，當(dāng)P＜0.05 時，表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚生長性能的影響

含地衣芽孢桿菌實驗飼料喂養(yǎng)大瀧六線魚50 d后，稱重并統(tǒng)計各組實驗魚的存活率和SGR。從表1中可見，地衣芽孢桿菌可顯著提高大瀧六線魚終末體重和 SGR(P＜0.05)，但兩實驗組之間無顯著差異(P＞0.05)，對照組和實驗組魚的存活率均為100%。

表1 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚生長性能的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 Effect of B. licheniformis on growth performance of H. otakii (Mean±SE)

2.2 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚血清中抗氧化指標(biāo)的影響

含地衣芽孢桿菌實驗飼料喂養(yǎng)大瀧六線魚50 d后，各實驗組和對照組大瀧六線魚血清的抗氧化相關(guān)酶活力測定結(jié)果見圖1。與對照組比較，飼料中添加0.5%和1.0%地衣芽孢桿菌均可提高大瀧六線魚血清中SOD、CAT 和T-AOC 活性，降低MDA 含量。GSH-Px 活性在1.0%實驗組較對照組下降，而0.5%實驗組較對照組提高，且第50 天最高，但與對照組差異不顯著(P＞0.05)，與 1.0%實驗組差異顯著(P＜0.05)。SOD 和CAT 活性在第40 天較高，兩實驗組差異不顯著(P＞0.05)；MDA 含量第40 天最低，兩實驗組差異不顯著(P＞0.05)；T-AOC 活性在第50 天最高，兩實驗組差異顯著(P＜0.05)。

2.3 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚血清中代謝相關(guān)酶的影響

含地衣芽孢桿菌實驗飼料喂養(yǎng)大瀧六線魚50 d后，各實驗組和對照組大瀧六線魚血清中代謝相關(guān)酶活力的測定結(jié)果見圖2。與對照組相比，1.0%地衣芽孢桿菌組的魚血清中代謝相關(guān)酶GS、MDH 活性第40 天最高(P＜0.05)，0.5%實驗組第50 天最高(P＜0.05)，且1.0%實驗組高于0.5%實驗組。HK 活性第40 天最高，0.5%實驗組高于1.0%實驗組，兩實驗組之間無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚血清中抗氧化指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of B. licheniformis on antioxidant indicators in serum of H. otakii

圖2 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚血清中代謝相關(guān)酶的影響Fig.2 Effect of B. licheniformis on metabolic enzymes in serum of H. otakii

2.4 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚血清中肝功能相關(guān)酶的影響

含地衣芽孢桿菌實驗飼料喂養(yǎng)大瀧六線魚50 d后，各實驗組和對照組大瀧六線魚血清中肝功能相關(guān)酶活力測定結(jié)果見圖3。與對照組比較，地衣芽孢桿菌實驗組魚血清中AST 活性降低，且幅度較大，第50 天最低，兩實驗組間差異顯著(P<0.05)。ALT 活性在0.5%實驗組持續(xù)降低，第40 天最低，兩實驗組差異顯著(P＜0.05)，而1.0%實驗組變化起伏，第20 天和第50 天活性較低。1.0%實驗組CHE 和ADA 活性均比對照組有提高(P＜0.05)，CHE 活性在第30 天最高，與0.5%實驗組差異不顯著(P＞0.05)，而ADA 活性在第 40 天最高，與 0.5%實驗組差異不顯著(P＞0.05)。

2.5 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚腸道消化酶活性的影響

圖3 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚血清中肝功能相關(guān)酶的影響Fig.3 Effect of B. licheniformis on liver enzymes in serum of H. otakii

圖4 地衣芽孢桿菌對大瀧六線魚腸道消化酶活性的影響Fig.4 Effect of B. licheniformis on activities of intestinal digestive enzymes in H. otakii

含地衣芽孢桿菌實驗飼料喂養(yǎng)大瀧六線魚50 d后，各實驗組和對照組大瀧六線魚腸道消化酶活性變化見圖4。與對照組比較，兩實驗組胰蛋白酶活性隨時間延長呈遞增趨勢，第40 天1.0%實驗組酶活性達(dá)到最高，且兩實驗組之間差異顯著(P＜0.05)，第50 天變化平穩(wěn)。1.0%實驗組第40 天腸道淀粉酶活性達(dá)最高(P＜0.05)，比對照組提高近3 倍，兩實驗組之間無顯著差異(P＞0.05)。脂肪酶活性在實驗第30 天以1.0%實驗組最高(P＜0.05)，而0.5%實驗組在第40 天最高(P＜0.05)，與1.0%實驗組無顯著差異(P＞0.05)。

2.6 大瀧六線魚血清非特異性免疫指標(biāo)相關(guān)性分析

相關(guān)性是一種動態(tài)化的特征，它表示各個因素在某個特定的時間點上的分析，本研究是通過第50 天各免疫指標(biāo)的活性值進(jìn)行分析，不同指標(biāo)之間交互檢驗雙側(cè)顯著性系數(shù)不同。如表2 所示，GSH-Px 和GS相關(guān)性極顯著，達(dá)到P＜0.01 顯著水平，說明二者之間密切程度較高；T-AOC 和GSH-Px、T-AOC 和MDA、MDA 和GS、GSH-Px 和MDH 之間存在一定的聯(lián)系和概率，達(dá)到P＜0.05 顯著水平。

2.7 攻毒感染實驗

含地衣芽孢桿菌實驗飼料喂養(yǎng)大瀧六線魚50 d后，進(jìn)行殺鮭氣單胞菌注射感染實驗，感染期間各組累積死亡率的統(tǒng)計結(jié)果見圖5。對照組感染后，第2天即出現(xiàn)死亡情況，6 d 內(nèi)死亡率急劇增加，第8 天減緩，第10 天達(dá)到平穩(wěn)期，14 d 內(nèi)的累積死亡率達(dá)75.55%；而實驗組在第4 天出現(xiàn)死亡，與對照組差異性顯著(P＜0.05)；1.0%實驗組第8 天達(dá)到平穩(wěn)期，14 d內(nèi)的累積死亡率僅有35.55% (P＜0.05)，而0.5%實驗組第 10 天達(dá)到平穩(wěn)期，累積死亡率為 53.33%(P＜0.05)。

表2 雙變量方差分析大瀧六線魚血清非特異性免疫因子的相關(guān)性Tab.2 Two-way ANOVA correction analysis of non-specific immune in serum of H. otakii

圖5 殺鮭氣單胞菌感染14 d 內(nèi)大瀧六線魚累積死亡率Fig.5 Cumulative mortality rate of H. otakii challenged with A. salraonicida in 14 days

3 討論

益生菌是一類對養(yǎng)殖動物機(jī)體有益的活性微生物，可通過不同的作用機(jī)制為動物提供良好的營養(yǎng)和環(huán)境，提高養(yǎng)殖動物的生長和存活率，提高動物機(jī)體免疫力和抗病力等(韓卓然等, 2016; 何偉聰?shù)? 2015;葉海斌等, 2018)。地衣芽孢桿菌是國家批準(zhǔn)使用的一種益生菌添加劑。Abarike 等(2018)研究含有地衣芽孢桿菌的商業(yè)益生菌制劑對羅非魚(Oreochromis niloticus)的生長、免疫及抗病力的影響，不同劑量的益生菌制劑可提高魚體重、SGR 和飼料利用效率，提高免疫酶活性和基因表達(dá)量，間接提高機(jī)體抵抗致病菌乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的能力。Gao 等(2018)研究表明，105CFU/ml 地衣芽孢菌的攝入可提高鮑魚(Haliotis discus hannai Ino)的攝食性、生長能力和免疫功能，提高對副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的抵抗力。潘雷等(2012)研究也表明，地衣芽孢桿菌或含有地衣芽孢桿菌的復(fù)合益生菌均可降低大菱鲆(Scophthalmus maximus)腸道弧菌數(shù)量，提高血清免疫酶活性。彭樹鋒等(2007)研究表明，向養(yǎng)殖水體中加入地衣芽孢桿菌可以有效改善養(yǎng)殖水環(huán)境，減少弧菌量，且提高石斑魚(Epinephelus sp.)的攝食性和存活率。本研究也獲得相似的結(jié)果，地衣芽孢桿菌可有效促進(jìn)大瀧六線魚機(jī)體SGR，可能原因是地衣芽孢桿菌在魚體內(nèi)繁殖代謝產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高消化酶活性，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的降解、吸收、利用，最終發(fā)揮促生長的效果。有研究報道，外源營養(yǎng)物質(zhì)對腸道消化酶活性可產(chǎn)生積極或消極的影響，消化酶活性變化與投喂飼料有直接的相關(guān)性(潘雷等, 2013; 陳飛等,2016a)。而且，地衣芽孢桿菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等具有較強(qiáng)活性的酶類(Nazmi et al, 2008)，間接促進(jìn)魚機(jī)體的健康和抗病力。本研究中，實驗組消化酶活性與對照組相比均有提高，地衣芽孢桿菌的添加影響了魚對蛋白質(zhì)的消化吸收效率，從而提高胰蛋白酶活性；通過改變腸道內(nèi)碳水化合物、脂類和糖類物質(zhì)的含量，影響脂肪酶和淀粉酶活性的變化。因此，飼料中添加地衣芽孢桿菌能夠適應(yīng)大瀧六線魚機(jī)體的消化能力，從而提高魚腸道消化功能。然而，消化酶活性與養(yǎng)殖動物種類差異、飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)方式等都存在相關(guān)性(劉穎等, 2009;劉洋等, 2011; 陳飛等, 2016b)，具體實驗在進(jìn)一步研究中。

在魚類防御體系中抗氧化系統(tǒng)起到重要作用，其動態(tài)平衡是確保動物健康的重要因素之一。GSH-Px參與血清過氧化物的分解，可將有害的過氧化物還原成羥基化合物(李國明等, 2019)。本研究中，1.0%實驗組魚血清中GSH-Px 活性較對照組降低，可能是由血清中該酶的作用底物谷胱甘肽的變化引起的，其具體原因有待進(jìn)一步探究。然而，催化體內(nèi)H2O2轉(zhuǎn)化成無害的H2O 和O2就由CAT 完成，即1.0%實驗組呈現(xiàn)出較高的活性。SOD 可把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT 即會將其分解為完全無害的H2O，二者的協(xié)同作用保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧自由基的損傷(Cavaletto et al, 2002)。本研究中，SOD 和CAT 2 種酶活性的變化相似，均在實驗第40 天活性達(dá)最高，SOD 活性升高導(dǎo)致H2O2濃度增加，而后，高活性的CAT 便會及時將其清除，減少其對機(jī)體產(chǎn)生的傷害，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，這與孫金輝等(2017)對鯉(Cyprinus carpio)幼魚的研究結(jié)果一致。Kucukbay 等(2009)研究表明，當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧自由基ROS 過量且未及時清除時，將對細(xì)胞產(chǎn)生損傷并促進(jìn)脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化物MDA 的濃度不僅可直接反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度，而且可間接反映抗氧化能力的強(qiáng)弱，MDA 水平升高，SOD 活性降低，即可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。本研究結(jié)果顯示，MDA 含量隨SOD 活性的提高有所降低，且第50 天又呈現(xiàn)升高，這可能是因為抗氧化系統(tǒng)酶SOD 和CAT 消除活性氧自由基的能力降低，刺激到脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致魚體內(nèi)MDA含量增加，吳慶元等(2014)對鯔魚(Mugil cephalus)幼魚的研究也呈現(xiàn)類似結(jié)果。T-AOC 是反映血清中總抗氧化能力的重要指標(biāo)，亦是評價益生菌應(yīng)用效果的主要指標(biāo)(Castex et al,2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，T-AOC 的活性在實驗第50 天達(dá)到最高，雖然達(dá)到最高活性的時間不同于SOD 等其他酶，但發(fā)生趨勢相似，然而，第30 天活性下降，可能是由于環(huán)境差異或人為操作差異造成。這些結(jié)果均表明，地衣芽孢桿菌可有效提高大瀧六線魚機(jī)體的抗氧化防御能力，各種指標(biāo)協(xié)同作用，進(jìn)而提高魚機(jī)體抗病力。

GSase 積極參與機(jī)體細(xì)胞氮原代謝以及谷氨酞胺合成，在養(yǎng)殖動物維持機(jī)體平衡中起到重要作用。孫武衛(wèi)等(2012)研究GSase 在對蝦非特異性免疫方面的重要作用，Tok 等(2009)研究了低氧環(huán)境下GSase在調(diào)控機(jī)體平衡中的作用。本研究中，地衣芽孢桿菌的添加同樣對大瀧六線魚血清GSase 活性產(chǎn)生了增強(qiáng)作用，推測地衣芽孢桿菌在增殖過程中分泌較強(qiáng)的蛋白酶活性，促進(jìn)魚機(jī)體對蛋白質(zhì)的代謝利用，從而提升GSase 活性。HK 是參與糖代謝的關(guān)鍵酶之一，其活性大小與底物糖的種類和含量均有直接的關(guān)系(楊品賢等, 2019)。本研究中，地衣芽孢桿菌組HK 活性比對照組明顯提高，由于地衣芽孢桿菌在增殖代謝過程中促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的降解，增加分泌代謝物中底物糖的種類和含量，從而促進(jìn)酶活性的提高。MDH 是參與脂肪代謝的重要標(biāo)志酶之一(魏勝娟等, 2011)，本研究中，地衣芽孢桿菌分泌的高消化酶活性使得魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率提高，誘導(dǎo)增強(qiáng)脂肪合成力，促進(jìn)脂肪代謝過程，提高了血清中MDH 活性。

評價肝臟功能常用的血清轉(zhuǎn)氨酶有 ALT 和AST，是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶(王成強(qiáng)等, 2019)。當(dāng)肝臟受到刺激損傷時，細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶便進(jìn)入血液，血清中的酶活性會有不同程度的增加，因此推測，檢測ALT 和AST 活性可揭示添加地衣芽孢桿菌是否對大瀧六線魚肝臟造成負(fù)擔(dān)或損傷。ADA 是一種核酸代謝酶，與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系，可作為反映外界刺激對肝損傷的敏感指標(biāo)。CHE 是一種水解酶，作用于乙酰膽堿，其活性與肝損傷呈負(fù)相關(guān)，若外界刺激對肝臟造成負(fù)擔(dān)或損傷，CHE 活性即會下降(Anderson et al, 2000; 樊英等, 2019)。本研究中，AST 活性在實驗過程中呈持續(xù)下降狀態(tài)，說明飼料中地衣芽孢桿菌對魚機(jī)體肝功能未造成負(fù)擔(dān)或明顯的損傷，而是起到一定的保護(hù)作用；ALT 活性變化與對照組相比時高時低，這可能表明開始給予地衣芽孢桿菌時對魚機(jī)體的適應(yīng)水平產(chǎn)生了壓力，然而，在代謝過程中機(jī)體通過自我調(diào)節(jié)實現(xiàn)壓力能量的轉(zhuǎn)換，未發(fā)生明顯的損傷，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。CHE 和ADA 活性在實驗過程中逐漸升高，分別在第30 天和第40 天達(dá)到最高，隨著時間的延長，酶活性在正常范圍內(nèi)發(fā)生浮動，但比對照組活性仍有所提升。故認(rèn)為，本研究中地衣芽孢桿菌的添加對大瀧六線魚肝功能未造成明顯的負(fù)影響，間接對機(jī)體非特異性免疫功能產(chǎn)生積極的作用。而且，適量的添加才會對養(yǎng)殖動物的肝臟起到保護(hù)作用，同時提高肝臟抵抗外界刺激的能力，過量或不正確的添加將會產(chǎn)生一定程度的損傷(何遠(yuǎn)法等,2016; 王成強(qiáng)等, 2019)，機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

在魚類機(jī)體整個免疫防御體系中，血清抗氧化功能指標(biāo)的變化與代謝功能、肝臟功能指標(biāo)的變化之間存在著不可分割的聯(lián)系，其中，血清轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝和蛋白質(zhì)、脂肪和糖三者相互轉(zhuǎn)化的過程中起著重要作用，氧自由基含量直接影響著整個非特異性免疫及其代謝能力，三大營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)化和機(jī)體器官的健康水平也存在著重要聯(lián)系。魚類消化酶活性的強(qiáng)弱也可影響著蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等物質(zhì)的消化、吸收，進(jìn)而影響魚機(jī)體生長發(fā)育等生命活動，魚體的健康水平又直接體現(xiàn)其抵抗病害的能力(劉波等, 2006; 劉淑蘭等, 2017; 孫金輝等, 2017; 李國明等, 2019; 王成強(qiáng)等, 2019)，這些聯(lián)系和相關(guān)性在本研究中均得到了體現(xiàn)。攻毒感染方式是檢驗養(yǎng)殖動物抗病力和免疫功能的一種常用方法，殺鮭氣單胞菌是冷水魚細(xì)菌性疾病的代表性致病菌之一(刁菁等, 2018)。本研究中，地衣芽孢桿菌延長了實驗魚出現(xiàn)死亡的時間，14 d 累積死亡率比對照組降低了一倍多，可能因為地衣芽孢桿菌獨特的生物奪氧機(jī)制抑制了致病菌的生長繁殖，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，結(jié)合非特異性免疫功能的增強(qiáng)，刺激體內(nèi)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，進(jìn)而降低大瀧六線魚的累積死亡率。