云南省3個(gè)民族人群乙醇代謝相關(guān)基因多態(tài)性及其與飲酒行為關(guān)系

趙 瑛 陳 波 冉凌云 何建輝 蔡 樂(lè)

乙醇是一種常見(jiàn)的成癮性物質(zhì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2016年有300多萬(wàn)人因有害使用乙醇而死亡[1]。世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)早已將乙醇和其代謝產(chǎn)物乙醛列為人類(lèi)一類(lèi)致癌物質(zhì)[2]。遺傳因素在乙醇消耗和成癮過(guò)程中起重要作用。研究較為廣泛并且已證實(shí)與飲酒行為相關(guān)的是ADH2和ALDH2。有研究表示，細(xì)胞色素 P450 2E1(CYP2E1)的c2等位基因、五羥色胺1B(5HT1B)受體基因以及脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)C385A位點(diǎn)基因與飲酒行為及乙醇依賴有關(guān)[3～5]。本研究選取了上述5種乙醇代謝相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為研究目標(biāo)基因，旨在了解乙醇代謝基因在云南省哈尼族、彝族和漢族人群中的分布情況，以及探討不同民族人群之間的乙醇代謝基因遺傳差異與飲酒行為的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：分別于2016年11月和2019年7月開(kāi)展兩次調(diào)查，抽取居住在云南省無(wú)直接血緣關(guān)系的哈尼族個(gè)體268例(男性104例，女性164例)、彝族個(gè)體287例(男性176例，女性111例)和漢族個(gè)體88例(男性39例，女性49例)，年齡15～87歲，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.樣本DNA提?。涸谌〉谜{(diào)查對(duì)象知情同意的前提下，抽取其靜脈血5ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝。基因組DNA采用北京工程技術(shù)天根有限公司合成的血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒提取。

3.位點(diǎn)信息及引物序列：引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 位點(diǎn)信息及引物序列

4.多重PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化：將合成好的引物用1×TE溶解到濃度為10pmol/μl，將同一種基因的引物加到一起，混勻，離心。配制PCR體系：DNA 1-2μl，2×PCR mix 7.5μl，混合引物2μl，H2O補(bǔ)至15μl；將配制的PCR總管分裝到96孔PCR板中，離心，每孔加入2μl DNA樣品，離心，上PCR儀。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min，35個(gè)循環(huán)(94℃15s，55℃15s，72℃30s)，72℃延伸3min。為了去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物和脫氧核糖核苷三磷酸，PCR擴(kuò)增后取3μl PCR產(chǎn)物用ExoⅠ和FastAP純化。PCR產(chǎn)物3μl，ExoⅠ 0.2μl，F(xiàn)astAP 0.8μl，ExoⅠ buffer 0.7μl，H2O補(bǔ)至7μl。37℃ 15min，80℃ 15min，純化好后進(jìn)行延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物。延伸體系為PCR產(chǎn)物2μl，Snapshot Mix試劑1μl，延伸引物，1μl，水補(bǔ)至6μl，取1μl延伸產(chǎn)物，加10μl上樣Hidi，95℃變性3min，立即冰水浴，上測(cè)序儀。

5.相關(guān)定義：飲酒：指曾喝過(guò)高度白酒(≥42°，一般55°)超過(guò)25ml，或低度白酒(<42°，一般38°)超過(guò)35ml，或葡萄酒超過(guò)100ml，或米酒(13°左右)超過(guò)100ml，或啤酒(一般3.3°)超過(guò)400ml。飲酒程度：飲酒程度按照世界衛(wèi)生組織《國(guó)際酒精消費(fèi)及危害監(jiān)測(cè)指南》進(jìn)行分類(lèi)[6]：低水平飲酒：男性每天平均飲酒量<41g，女性每天平均飲酒量<21g；危險(xiǎn)飲酒：男性每天平均飲酒量≥41g且<61g，女性每天平均飲酒量≥21g且<41g；有害飲酒：男性每天平均飲酒量≥61g，女性每天平均飲酒量≥41g。飲酒障礙篩查量表(alcohol use disorders identification test，AUDIT)評(píng)分：得分≥8分為有害飲酒，女性及年齡>65歲人群≥7分為有害飲酒。臉紅反應(yīng)評(píng)分：臉紅反應(yīng)是指飲酒者飲酒后臉上或身上皮膚發(fā)紅或者起疹子。臉紅反應(yīng)評(píng)分包括以下4個(gè)維度(飲酒后出現(xiàn)臉紅反應(yīng)的頻率)：從未或很少(0分)、有時(shí)(1分)、大部分時(shí)候(2分)、總是(3分)。ADH2-rs1229984等位基因T和C文中分別用ADH2*1、ADH2*2表示。ALDH2-rs671等位基因G和A文中分別用ALDH2*1、ALDH2*2表示。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)比較不同特征人群的基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較不同基因型的臉紅反應(yīng)得分，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)：5種乙醇代謝基因的觀察值和理論值吻合程度較好，符合Hardy-Weinberg平衡定律(哈尼族：ADH2χ2=2.739、ALDH2χ2=0.434、CYP2E1χ2=1.281、5HT1Bχ2=11.069、FAAHχ2=0.869；彝族：ADH2χ2=0.218、ALDH2χ2=2.414、CYP2E1χ2=0.853、5HT1Bχ2=0.883、FAAHχ2=0.076；漢族：ADH2χ2=0.148、ALDH2χ2=1.145、CYP2E1χ2=0.731、5HT1Bχ2=0.012、FAAHχ2=0.642；P均>0.05)，樣本具有群體代表性。

2.哈尼族、彝族和漢族5種乙醇代謝基因型及等位基因分布情況：ADH2和ALDH2基因型頻率和等位基因頻率在3個(gè)民族間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。CYP2E1、5HT1B和FAAH基因型和等位基因在3個(gè)民族間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 哈尼族、彝族、漢族人群ADH2和ALDH2基因型頻率與等位基因頻率

3.哈尼族、彝族和漢族飲酒者與非飲酒者之間5種乙醇代謝基因型及等位基因分布情況：哈尼族人群中飲酒組與不飲酒組的ADH2基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ADH2*1/*2基因型在哈尼族飲酒者中的比例大于不飲酒者。彝族和漢族人群中飲酒組與不飲酒組的ALDH2基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，彝族和漢族飲酒者中都以ALDH2*1/*1基因型為主(P<0.05，表3)。CYP2E1、5HT1B和FAAH基因型和等位基因在飲酒組和不飲酒組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 ADH2和ALDH2基因型頻率和等位基因頻率與云南省哈尼族、彝族、漢族人群飲酒的關(guān)系

4.調(diào)查對(duì)象飲酒程度與基因型關(guān)系：調(diào)查對(duì)象不同飲酒程度的ALDH2基因型頻率和等位基因頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2在不飲酒者中的比例大于其他飲酒水平(表4)。其他4種基因型及等位基因在不同飲酒程度間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 調(diào)查對(duì)象飲酒程度與ALDH2基因型關(guān)系

5.調(diào)查對(duì)象飲酒障礙情況與基因型關(guān)系：調(diào)查對(duì)象不同飲酒障礙情況的ALDH2基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ALDH2*1/*1在有害飲酒者中的比例大于非有害飲酒者(表5)。

表5 調(diào)查對(duì)象飲酒障礙情況與基因型關(guān)系

6.飲酒者ALDH2基因型與臉紅反應(yīng)關(guān)系：在飲酒者中未檢測(cè)到ALDH2*2/*2基因型個(gè)體。秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示攜帶ALDH2*1/*1基因型的個(gè)體平均秩次為147.71，攜帶ALDH2*1/*2基因型的個(gè)體平均秩次為254.81，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，攜帶ALDH2*1/*2基因型的個(gè)體飲酒后臉紅反應(yīng)頻率更高(表6)。

表6 飲酒者ALDH2基因型與臉紅反應(yīng)關(guān)系

討 論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)研究者對(duì)不同地區(qū)人群的乙醇代謝基因分布情況做了廣泛研究，但研究對(duì)象以漢族居多，少數(shù)民族的研究較少。研究較多的漢族ALDH2*1/*1基因型頻率在我國(guó)地域分布上總體趨勢(shì)呈現(xiàn)出北高南低[7, 8]。云南省地處中國(guó)西南部，本次調(diào)查的漢族ALDH2*1/*1基因型頻率(68.2%)也低于我國(guó)北部地區(qū)如山西省(77%)、湖北省(78.1%)等地，體現(xiàn)出地域差異性。李金華等[9]開(kāi)展的有關(guān)彝族酒依賴與ALDH2關(guān)系的研究顯示，彝族人群中只檢測(cè)到野生型ALDH2*1/*1，而筆者研究發(fā)現(xiàn)在云南省彝族人群中出現(xiàn)了ALDH2*1/*2基因型。而有關(guān)哈尼族的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

乙醇代謝的中間產(chǎn)物乙醛若在體內(nèi)蓄積會(huì)產(chǎn)生毒性，使部分人群產(chǎn)生臉紅反應(yīng)，這種對(duì)身體產(chǎn)生的不良反應(yīng)在一定程度起到限制飲酒的作用[10]。攜帶等位基因ADH2*1和ALDH2*1的個(gè)體飲酒后體內(nèi)乙醛迅速被轉(zhuǎn)化為乙酸，在血液中不易滯留，使飲酒者出現(xiàn)飲酒量和飲酒頻率增高的表現(xiàn)，從而容易發(fā)生酒依賴和乙醇中毒。本研究結(jié)果顯示，哈尼族和彝族人群主要以ADH2*1/*2和ALDH2*1/*1基因型為主，且在飲酒者中分布顯著。這可能是由于云南省獨(dú)特的酒文化傳承，使得哈尼族和彝族人群好喝酒且多數(shù)是自家釀制的高度白酒。另外，筆者發(fā)現(xiàn)部分?jǐn)y帶ALDH2*1/*2的個(gè)體仍然存在飲酒行為甚至為危險(xiǎn)飲酒或是有害飲酒，這部分人群由于攜帶等位基因ALDH2*2，若不控制飲酒量，可能增加飲酒所導(dǎo)致的乙醛蓄積從而增加相關(guān)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[11,12]。遺傳變異對(duì)乙醇依賴風(fēng)險(xiǎn)增加是顯著的，尤其是ADH2和ALDH2基因[13]。筆者發(fā)現(xiàn)，ALDH2*1/*1在有害飲酒者中的比重大于非有害飲酒者，一定程度上提示攜帶ALDH2*1/*1的個(gè)體更容易過(guò)量飲酒，增加其發(fā)生乙醇依賴的風(fēng)險(xiǎn)。這與以往的研究結(jié)論是一致的[14,15]。

如今雖然基因檢測(cè)是判定個(gè)體基因型的金標(biāo)準(zhǔn)，但是基因檢測(cè)費(fèi)用較高，難以普及。從以往的驗(yàn)證研究顯示，臉紅反應(yīng)問(wèn)卷是一種比較合理的成本較低的能夠初步篩選飲酒者ALDH2缺陷型基因的方法，可以通過(guò)是否出現(xiàn)臉紅反應(yīng)來(lái)估計(jì)個(gè)體為何種基因型[16]。若飲酒者飲酒后出現(xiàn)臉紅反應(yīng)的頻率較高，則在一定程度上可評(píng)估其ALDH2基因型為缺陷型基因(ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2)。公共衛(wèi)生教育工作者在對(duì)人群做飲酒教育時(shí)不僅要強(qiáng)調(diào)飲酒的危害，還應(yīng)該從基因的角度解釋臉紅與飲酒行為間的關(guān)系，特別是飲酒會(huì)臉紅的基因缺陷型人群，改變臉紅也能喝酒的觀點(diǎn)。

本研究中并未發(fā)現(xiàn)其他3種基因在不同民族間分布存在差異，也沒(méi)發(fā)現(xiàn)這些基因與人群飲酒行為間有直接聯(lián)系。這與很多研究得出的結(jié)論相一致[17～19]。當(dāng)然也與部分研究者的研究結(jié)果不盡相同[4,15,20]。筆者分析原因如下：首先，這可能是由于研究人群樣本量不足，研究對(duì)象所處的地區(qū)比較集中，無(wú)法凸顯遺傳因素而導(dǎo)致的飲酒行為差異。其次，國(guó)外很多研究所報(bào)道的都是不同種族間比較有差異，而筆者所研究的對(duì)象是同一種族，這3種基因在同種族不同民族或不同地區(qū)間是否有差異還需要進(jìn)一步探討，即本研究的陰性結(jié)果在一定程度上提供了人群樣本多樣性，為后續(xù)的研究提供參考。這些基因與乙醇成癮的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系還需要在多個(gè)民族人群中做進(jìn)一步研究。

綜上所述，不同民族人群之間的ADH2和ALDH2基因遺傳多態(tài)性存在差異性，人群飲酒行為特征也凸顯了其差異的合理性。乙醇代謝基因多態(tài)性的研究對(duì)篩選乙醇易感人群至關(guān)重要，并在此基礎(chǔ)上能夠科學(xué)、有效地實(shí)施健康宣傳教育和行為干預(yù)。