肝細(xì)胞癌相關(guān)差異表達(dá)基因和藥物預(yù)測(cè)的生物信息學(xué)分析

張 依 張玉峰 牛文輝 戚亞婷 趙永華 樊亞芳

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，每年全球約有84萬(wàn)例新增HCC患者，因HCC死亡人數(shù)高達(dá)78萬(wàn)[1]。并且HCC患者的5年生存率仍不盡如人意(約為12.1%)，發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。研究顯示，中醫(yī)藥治療肝癌時(shí)，能夠降低肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者生存質(zhì)量，并能夠減少肝癌細(xì)胞增殖和新生血管形成，促進(jìn)其凋亡[3]。因此，研究HCC的分子機(jī)制和具有潛在治療作用的中藥或有效成分顯得尤為重要。

近年來(lái)，生物信息學(xué)方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是探索和預(yù)測(cè)疾病發(fā)病機(jī)制的重要手段。因此，本研究選取了HCC相關(guān)基因芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選HCC相關(guān)DEGs，并挖掘DEGs的生物學(xué)功能和通路，探討HCC潛在的分子機(jī)制。并篩選核心基因和具有潛在治療作用的中藥有效成分，旨在為診斷、治療和機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料:在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nil.nih.gov/geo/)中根據(jù)以下條件進(jìn)行篩選基因芯片：①樣本組織為HCC和癌旁或正常肝組織；②數(shù)據(jù)類型為mRNA表達(dá)譜；③物種為智人(Homo sapiens)；④平臺(tái)為GPL570[(HG-U133_Plus_2)Affymetrix人基因組U133加2.0陣列]?；谏鲜鰲l件，選擇并下載4組基因芯片：GSE45436(來(lái)源于93個(gè)HCC組織和41個(gè)癌旁肝組織)、GSE84402(來(lái)源于14個(gè)HCC組織和14個(gè)癌旁肝組織)、GSE62232(來(lái)源于81個(gè)HCC組織和10個(gè)正常肝組織)、GSE101685(來(lái)源于24個(gè)HCC組織和8個(gè)正常肝組織)。

2.篩選DEGs：使用R 3.5.1軟件的Affy和Limma包對(duì)4組基因芯片進(jìn)行分析，得到DEGs，其中Limma包的Benjamini-Hochberg算法對(duì)P值進(jìn)行校正，得到校正后的P值[4]。若校正后的P<0.05、|log2(fold change，F(xiàn)C)|(|log2FC|)>1(FC為差異倍數(shù))，則為DEGs。再分別利用“Volcano plot”和“Venn diagram”包構(gòu)建火山圖和韋恩圖，選取同時(shí)在4組基因芯片中的上調(diào)或下調(diào)基因?yàn)镈EGs。

3.GO和KEGG分析：將DEGs輸入DAVID 6.8(https:∥david.ncifcrf.gov/)，選擇物種為智人，進(jìn)行KEGG和GO分析，兩者均以P<0.01為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。其中GO分析包括生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular components，CC)及分子功能(molecular functions，MF)分析。

4.構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選核心基因:在STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥string-db.org/)中輸入DEGs,選擇最低相互作用評(píng)分為中等置信度(0.400)，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)。并使用Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)PPI數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化展示，根據(jù)“CytoHubba”插件中MCC算法，選擇前10位DEGs作為核心基因。

5.驗(yàn)證核心基因的表達(dá)和生存分析：在UALCAN(http:∥ualcan.path.uab.edu/analysis.html)中設(shè)置檢索條件為:①gene symbol：核心基因;②TCGA dataset：liver hepatocellular carcinoma;③expression;④survival。分析核心基因表達(dá)，并繪制核心基因的Kaplan-Meier生存曲線，兩者均以P<0.05為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。

6.篩選潛在治療藥物:在比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD，http:∥ctdbase.org/)中輸入疾病為hepatocellular carcinoma，從化合物-基因相互作用(chemical-genes interactions)數(shù)據(jù)中篩選能夠負(fù)調(diào)節(jié)核心基因表達(dá)的中藥有效成分，作為潛在治療HCC的低分子化合物。

結(jié) 果

1.篩選DEGs：通過(guò)R 3.5.1的Affy和Limma包分析得到DEGs，使用火山圖進(jìn)行展示，詳見(jiàn)圖1。并對(duì)4組基因芯片中DEGs取交集和繪制韋恩圖，得到173個(gè)上調(diào)基因和323個(gè)下調(diào)基因，詳見(jiàn)圖2。

圖1 4組微陣列數(shù)據(jù)的火山圖

圖2 上調(diào)基因(A)和下調(diào)基因(B)的韋恩圖

2.GO和KEGG分析：GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要參與75個(gè)BP，主要分布于29 個(gè)CC，主要具有28種MF，主要富集在20條KEGG通路，詳見(jiàn)表1。

表1 GO和KEGG分析

3.構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選核心基因：通過(guò)STRING和Cytoscape分析，得到由430個(gè)節(jié)點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)表示DEGs，其中66個(gè)DEGs在本研究中孤立存在，未參與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建)和5047個(gè)邊(邊表示DEGs間相互作用關(guān)系)組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見(jiàn)圖3A。使用cytoHubba的MCC算法，篩選得到10個(gè)明顯上調(diào)的核心基因，包括有絲分裂阻滯缺陷蛋白2樣蛋白1(mitotic arrest deficient 2 like protein 1，MAD2L1)、有絲分裂檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(mitotic checkpoint serine/threonine kinase BUB1 beta，BUB1B)、非染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)凝縮蛋白I復(fù)合體G亞基(non-SMC condensin I complex subunit G，NCAPG)、細(xì)胞周期蛋白A2(cyclin A2，CCNA2)、細(xì)胞周期蛋白B2(cyclin B2，CCNB2)、驅(qū)動(dòng)蛋白超家族11(kinesin family member 11,KIF11)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase1，CDK1)、酪氨酸和蘇氨酸蛋白激酶(tyrosine and threonine protein kinase,TTK)、苯并咪唑出芽抑制解除同源物1(budding uninhibited by benzimidazoles 1，BUB1)、細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1，CCNB1)，詳見(jiàn)圖3B。

4.驗(yàn)證核心基因的表達(dá)和生存分析：通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，核心基因在HCC組織中均顯著高表達(dá)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖4。生存分析結(jié)果顯示，核心基因高表達(dá)組生存率均低于低表達(dá)組生存率且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖5。

圖4 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中核心基因的表達(dá)情況

圖5 核心基因的Kaplan-Meier生存曲線

5.篩選潛在治療藥物：核心基因均為上調(diào)基因且與低生存率密切相關(guān)，因此，從CTD中篩選可降低核心基因表達(dá)的中藥有效成分。根據(jù)中藥有效成分對(duì)應(yīng)的核心基因的數(shù)目進(jìn)行排序，前5個(gè)中藥有效成分為槲皮苷、白藜蘆醇、姜黃素、雷公藤甲素、相思子堿，詳見(jiàn)表2。

表2 CTD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的潛在治療藥物

討 論

本研究使用生物信息學(xué)方法對(duì)基因芯片進(jìn)行分析，探討HCC的分子機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)和臨床提供潛在治療靶點(diǎn)和治療藥物。

本研究共得到496個(gè)DEGs。GO和KEGG分析表明，DEGs主要調(diào)控細(xì)胞分裂、有絲分裂等生物學(xué)過(guò)程，主要參與代謝和細(xì)胞周期等通路。上述生物學(xué)過(guò)程和通路可能在HCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，為探究HCC的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

通過(guò)PPI分析發(fā)現(xiàn)了10個(gè)高表達(dá)且與生存率密切相關(guān)的核心基因，包括MAD2L1、BUB1B、NCAPG、CCNA2、CCNB2、KIF11、CDK1、TTK、BUB1、CCNB1。其中MAD2L1是紡錘體組裝的檢查蛋白的重要組成部分，其異常表達(dá)時(shí)，可影響紡錘絲檢查點(diǎn)的活性，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生，但在HCC中研究較少，可能為新的治療靶點(diǎn)[4，5]。BUB1B又稱為BUBR1，是連接紡錘體微管和染色體的有絲分裂功能蛋白，在HCC組織中高表達(dá)，與乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性率、較大腫瘤體積、低生存率密切相關(guān)[6]。NCAPG可負(fù)責(zé)染色體的穩(wěn)定和凝聚，在HCC中，高表達(dá)NCAPG與較低的生存率密切相關(guān)，其表達(dá)降低時(shí)可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞在體內(nèi)形成的異體移植瘤減小[7]。

CCNA2為DNA復(fù)制的調(diào)控因子，在HCC中精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)與CCNA2相互作用，并通過(guò)非酶途徑促進(jìn)HCC的發(fā)生[8]。CCNB2與細(xì)胞分裂周期蛋白20(Cdc20)結(jié)合能夠引起細(xì)胞從G2期轉(zhuǎn)換至M期，在HCC中顯著高表達(dá)，下調(diào)CCNB2可引起細(xì)胞增殖和遷移的減少、凋亡增加和S期阻滯[9]。KIF11為調(diào)控依賴性運(yùn)動(dòng)蛋白，在有絲分裂紡錘體形成和維持紡錘體動(dòng)力中發(fā)揮重要作用，其在口腔鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌中顯著高表達(dá)，但在HCC中研究較少，可能為新的靶點(diǎn)基因[10，11]。CDK1與CCNB1結(jié)合后具有激酶功能，在HCC細(xì)胞中，CDK1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡素的腫瘤特異性殺傷功能和分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中比例，調(diào)控凋亡素引起的細(xì)胞凋亡[12]。

TTK是紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的一部分，在HCC組織中高表達(dá)，并與腫瘤直徑、門靜脈癌栓(PVTT)的形成密切相關(guān)，也可促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[13]。BUB1是編碼染色體分離調(diào)控的蛋白激酶，在HCC中高表達(dá)，下調(diào)BUB1的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少，凋亡增多和S期阻滯[14]。CCNB1為有絲分裂的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，在HCC中高表達(dá)的CCNB1與血管侵犯、病理分期和較低的無(wú)病生存率、總生存率密切相關(guān)[15]。結(jié)合上述分析發(fā)現(xiàn)，核心基因與細(xì)胞周期密切相關(guān)，可能為HCC的致癌基因和治療靶點(diǎn)。

本研究在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出槲皮素、白藜蘆醇、姜黃素、雷公藤甲素、相思子堿5個(gè)中藥有效成分，其中槲皮素是廣泛存在于三七、絞股藍(lán)等中藥的天然黃酮類化合物，白藜蘆醇是來(lái)源于虎杖等中藥的非黃酮類多酚化合物，兩者均能降低肝癌細(xì)胞增殖活性并促進(jìn)凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯[16，17]。姜黃素是姜黃中的天然酚類化合物，雷公藤甲素是從雷公藤中提取的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，兩者均可抑制肝癌細(xì)胞增殖，而雷公藤甲素也能降低肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[18～20]。相思子堿是從相思子或雞骨草中提取的生物堿，從雞骨草中提取的相思子堿能夠減少四氧化碳(CCl4)和異硫氰酸萘酯引起的肝損傷小鼠模型中總膽紅素和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量，具有降酶退黃護(hù)肝的藥理作用[21]。但相思子堿對(duì)HCC細(xì)胞的研究較少，可能為新的治療HCC藥物。上述5種中藥有效成分能夠影響肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡，具有抗肝癌的作用。

綜上所述，本研究使用生物信息學(xué)方法對(duì)HCC相關(guān)DEGs和潛在治療藥物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DEGs主要調(diào)控DNA復(fù)制和氧化還原過(guò)程，參與細(xì)胞周期和代謝信號(hào)通路。篩選得到10個(gè)顯著上調(diào)且與低生存率密切相關(guān)的核心基因，可能為HCC的致癌基因和潛在治療靶點(diǎn)。并且發(fā)現(xiàn)槲皮素、白藜蘆醇、姜黃素、雷公藤甲素、相思子堿具有潛在的治療作用。因此本研究有助于分析HCC的潛在分子機(jī)制和發(fā)現(xiàn)具有治療作用的中藥有效成分，為后續(xù)臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供潛在的靶標(biāo)和治療藥物。