miR-155-5p靶向c-SKI對冠狀動脈內(nèi)皮細胞增殖及膠原合成的影響

呂忠英 巴·巴音斯勒瑪 張 岳 王 娟

心肌纖維化(cardiac fibrosis)是多種心血管疾病的共同病理生理過程，最新研究發(fā)現(xiàn)患者發(fā)生心肌纖維化后心力衰竭風(fēng)險顯著增加，且與疾病預(yù)后密切相關(guān)[1]。內(nèi)皮細胞是心臟中數(shù)量最豐富的細胞類型之一，內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)、表型轉(zhuǎn)換及與心肌細胞的平衡關(guān)系，在心臟血管再生、心肌肥厚、心肌纖維化和心力衰竭中起著重要的調(diào)節(jié)作用[2,3]。因此，內(nèi)皮細胞增殖、膠原合成和間質(zhì)轉(zhuǎn)化等也是心肌纖維化防治研究的熱點。微小RNA(microRNA，miRNA)是低的非蛋白編碼RNA，是低分子單鏈RNA，已被證實參與調(diào)節(jié)許多細胞內(nèi)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，作用范圍廣泛。miRNA作為內(nèi)源性心肌的重要調(diào)節(jié)因子，幾乎調(diào)控著心血管系統(tǒng)所有細胞的功能，并且多方面、多途徑地參與了心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展進程，來自干細胞的外泌體miRNA可能成為治療心血管疾病的重要策略[4～6]。miR-155-5p是最具代表性的miRNA之一，研究顯示miR-155-5p在造血譜系分化、免疫、炎癥、癌癥、心血管疾病、唐氏綜合征等多種生理病理過程中均發(fā)揮著重要作用[7]。原癌基因c-SKI(cellular sloan-kettering institute)，在機體發(fā)育和許多疾病具有重要調(diào)節(jié)作用，包括血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥和糖脂代謝等[8]。因此，本研究探討了miR-155-5p在冠狀動脈內(nèi)皮細胞的增殖和膠原蛋白合成中的作用，進一步通過生物信息學(xué)軟件，預(yù)測miR-155-5p可能的靶基因并驗證，為心肌纖維化的研究提供新靶點和思路。

材料與方法

1.主要材料：人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(瑞士Lonza公司)，轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF-β1,美國R&D Systerm公司)。10%胎牛血清(美國HyClone公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司)。RIPA裂解液、BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo Fisher公司)。c-SKI抗體、collagen Ⅰ、GAPDH(美國Cell Signaling Technology公司)，collagen Ⅲ抗體(英國Abcam公司)。Trizol試劑盒、RT-qPCR和反轉(zhuǎn)錄試劑(瑞士Roche公司)。野生型和突變型c-SKI3′UTR質(zhì)粒(長沙贏潤生物技術(shù)有限公司)、miR-155-5p抑制劑(金斯瑞生物技術(shù)有限公司)。PBS(北京索萊寶科技有限公司)、MTT細胞增殖檢測試劑盒(美國Sigma公司)。雙螢光素酶基因分析系統(tǒng)(美國Promega公司)。

2.細胞培養(yǎng)：人冠狀動脈內(nèi)皮細胞用含有10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)。培養(yǎng)至匯合狀態(tài)，再用0.25%胰酶和0.02% EDTA混合液消化、傳代，取傳至第3代的細胞用于實驗。

3.細胞轉(zhuǎn)染：細胞傳代培養(yǎng)至細胞對數(shù)生長期，接種于6孔板中，待細胞融合達50%～70%，換用無血清培養(yǎng)基饑餓6～8h，后按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，每孔轉(zhuǎn)染物終濃度為50nmol/L，后置于CO2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)48h。

4.MTT實驗檢測各組細胞增殖能力：通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)測定法測量細胞的增殖。將冠狀動脈內(nèi)皮細胞以每孔2×104接種96孔板中，培養(yǎng)24h，使用TGF-β1(5ng/ml)刺激或不刺激，后使用miR-155-5p抑制劑轉(zhuǎn)染細胞。加入MTT至終濃度為0.5mg/ml，將細胞在37℃下溫育4h。通過微量板讀數(shù)器(美國Bio-Rad公司)測量490nm處的吸光度。每個實驗重復(fù)3次。

5.Western blot法檢測各組細胞蛋白的表達水平：培養(yǎng)各組人冠狀動脈內(nèi)皮細胞，收集至EP管中，后加入蛋白裂解液(Ripa)收集細胞蛋白樣品。定量后取50μg樣品上樣電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。后使用c-SKI、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和GAPDH特異性一抗(1∶1000)，用5%脫脂奶粉封閉。洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5000)，孵育 1h(37℃)，加入化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯色，掃膜拍照，以GAPDH為內(nèi)參，計算細胞中c-SKI、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的蛋白表達水平，Image軟件分析測試結(jié)果。

6.RT-PCR實驗檢測各組細胞mRNA的表達水平：使用 Trizol試劑提取冠狀動脈內(nèi)皮細胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增(根據(jù)試劑盒說明書進行操作)。分析結(jié)果并得到 Ct 值，miR-155-5p以U6為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，c-SKImRNA表達水平以GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。采用 2-ΔΔCt方法分析結(jié)果，每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次，引物序列詳見表1。

表1 PCR 反應(yīng)的引物序列

7.雙熒光素酶報告基因檢測：對數(shù)生長期的冠狀動脈內(nèi)皮細胞接種于6孔板中，接種密度為2×104/孔培養(yǎng)(37℃)。將miR-155-5p抑制劑和空白對照與野生型(wt)和突變型(mut)c-SKI 3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染冠狀動脈內(nèi)皮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h，吸去原來的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，后裂解并離心。取20μl細胞裂解液至離心管，將100μl LAR Ⅱ工作液加入，快速混勻，讀值2s。用熒光素酶活性試劑盒測試活性并分析結(jié)果。

結(jié) 果

1.TGF-β1刺激后各組細胞膠原合成及細胞增殖情況：給與不同濃度TGF-β1刺激48h后，Western blot法結(jié)果顯示，與0ng/ml比較，1、2.5、5ng/ml組細胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達均顯著上調(diào)(P<0.01)，呈濃度依賴，5ng/ml濃度誘導(dǎo)下膠原蛋白升高最顯著(圖1)，后續(xù)實驗均選取5ng/ml TGF-β1進行處理。后給予5ng/ml TGF-β1處理不同時間后，對照組給予等量的PBS，通過MTT法檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，與對照組比較，TGF-β1組在24、36、48h時細胞增殖活力檢測比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，48h增殖程度最為明顯(P<0.01)。因此后續(xù)實驗選取5ng/ml TGF-β1刺激48h繼續(xù)進行。

圖1 TGF-β1刺激后各組細胞膠原合成及細胞增殖情況

2.TGF-β1刺激后各組細胞中miR-155-5p 和c-SKI的表達情況：給予5ng/ml TGF-β1刺激48h，Western blot法檢測結(jié)果顯示，與PBS空白對照組比較，TGF-β1組細胞中c-SKI蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與PBS空白對照組比較，TGF-β1組細胞中c-SKI mRNA的表達明顯下調(diào)，而miR-155-5p mRNA的表達顯著上調(diào)(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 不同組別c-SKI、miR-155-5p表達情況比較

3.轉(zhuǎn)染miR-155-5p抑制劑后各組細胞的增殖情況：將miR-155-5P抑制劑轉(zhuǎn)染冠狀動脈內(nèi)皮細胞48h，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與PBS+空白抑制劑對照組比較，轉(zhuǎn)染后細胞中miR-155-5p的表達水平顯著下調(diào)(P<0.01，圖3A)。后續(xù)細胞分為3組，即PBS+空白抑制劑對照組、TGF-β1+空白抑制劑對照組和TGF-β1+miR-155-5p抑制劑組。轉(zhuǎn)染miR-155-5p 抑制劑至冠狀動脈內(nèi)皮細胞48h后，MTT法檢測結(jié)果顯示，與TGF-β1+空白抑制劑對照組比較，TGF-β1+miR-155-5p抑制劑組細胞增殖程度受到顯著抑制(P<0.01，圖3B)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-155-5p 抑制劑后各組細胞增殖情況

4.轉(zhuǎn)染miR-155-5p 抑制劑后各組細胞膠原合成的情況：與TGF-β1+空白抑制劑對照組比較，miR-155-5p抑制劑處理后部分逆轉(zhuǎn)了TGF-β1的誘導(dǎo)作用，冠狀動脈內(nèi)皮細胞中collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白的表達明顯下降(P<0.05，圖4)。

圖4 不同組別collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達情況

5.miR-155-5p靶基因的預(yù)測：分別運用TargetScan和miRanda對miR-155-5p與c-SKI基因的靶向配對關(guān)系進行預(yù)測，TargetScan顯示miR-155-5p在c-SKI3′UTR上有一個保守的靶位點，其類型為7mer-m8，匹配得分為79。miRanda結(jié)果表明miR-155-5p與c-SKI靶位點的 mirSVR得分為-0.3365，綜合兩個生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-155-5p與c-SKI基因配對良好，詳見圖5。

圖5 miR-155-5p與c-SKI結(jié)合位點的預(yù)測

6.miR-155-5p和c-SKI基因的靶向關(guān)系驗證:與PBS+空白抑制劑對照組比較，miR-155-5p抑制劑組中c-SKI的蛋白和mRNA表達水平均有所上調(diào)(P<0.01)，詳見圖6。熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與空白抑制劑對照組比較，c-SKI-3′UTR-WT+miR-155-5P抑制劑組的熒光素酶活性則明顯增強(P<0.05)，而c-SKI-3′UTR-MUT+miR-155-5P抑制劑組的熒光素酶活性無明顯變化，詳見表2。

圖6 不同組別c-SKI的表達變化

表2 雙熒光素酶活性相對表達量

討 論

心肌纖維化與心臟收縮和舒張功能障礙、心律失常和不良預(yù)后密切相關(guān)?；罨募〕衫w維細胞是心肌纖維化的主要效應(yīng)細胞，但越來越多的研究顯示，其他細胞類型包括內(nèi)皮細胞、周細胞、巨噬細胞和肥大細胞等，通過分泌成纖維介質(zhì)和基質(zhì)細胞蛋白，或發(fā)生細胞表型轉(zhuǎn)化，參與心肌纖維化的過程[3,9]。TGF-β1作為經(jīng)典的促纖維化因子，可作用于冠狀動脈內(nèi)皮細胞，促進其增殖、遷移或發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進心肌纖維化發(fā)生[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可成功誘導(dǎo)冠狀動脈內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞中collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表達上調(diào)，結(jié)果與既往的報道一致。

miRNA是維持臟器正常功能必需的胞內(nèi)介質(zhì)，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控，通過與3′UTR結(jié)合，并招募RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)來觸發(fā)目標(biāo)mRNA的降解，從而抑制目的蛋白的翻譯。miRNA廣泛參與心肌纖維的調(diào)節(jié)，如miR-21可以促進內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、膠原合成和成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，miR-34可以促進心肌細胞衰老、肥大和心肌纖維化，miR-327可以作用于內(nèi)皮細胞，促進其黏附遷移和分化，促進心肌纖維化[12]。miR-590-3p通過靶向ZEB1調(diào)控心臟成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成[13]。miR-155-5p目前被認(rèn)為是促纖維化因子，miR155-5p基因缺失可改善壓力負荷誘導(dǎo)的心肌纖維化[14]。在糖尿病心肌病小鼠模型中，使用miR-155-5p拮抗劑可以緩解心肌病變，改善心功能[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-155-5p可以減輕巨噬細胞極化和炎性反應(yīng)，從而減輕心肌梗死后的交感神經(jīng)重構(gòu)和室性心律失常[16]。本研究中miR155-5p在由TGF-β1誘導(dǎo)的冠狀動脈內(nèi)皮細胞中顯著上調(diào)，c-SKI mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)。此外，在TGF-β1誘導(dǎo)的冠狀動脈內(nèi)皮細胞中抑制miR155-5p能夠抑制細胞增殖活力，抑制細胞中膠原合成，上調(diào)細胞中c-SKI的表達，提示TGF-β1誘導(dǎo)的心肌纖維化機制可能涉及miR155-5p及c-SKI的調(diào)節(jié)參與，且提示miR155-5p和c-SKI的表達呈負相關(guān)。因此，抑制miR155-5p表達可能成為抑制心肌纖維化治療的一種有效手段。

c-SKI(cellular sloan-kettering institute)是SKI蛋白家族的一員，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。c-SKI不僅參與調(diào)控成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)換，具有一定的抗纖維化作用，還作為miR-34a/miR-93的靶基因參與調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖和胞外基質(zhì)的合成。使用生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanda共同預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-155-5p和c-SKI 3′-UTR 序列存在互補關(guān)系，匹配度良好。Western blot法和RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，在冠狀動脈內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)染miR-155-5p inhibitor后c-SKI蛋白和mRNA的表達均有所上調(diào)。后使用雙熒光素酶報告檢測，驗證了miR-155-5p和c-SKI存在靶向關(guān)系，miR-155-5p在冠狀動脈內(nèi)皮細胞中能夠負向調(diào)節(jié)c-SKI的表達。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TGF-β1能夠誘導(dǎo)人冠狀動脈內(nèi)皮細胞中miR-155-5p的表達，而miR-155-5p可能通過調(diào)節(jié)靶基因c-SKI介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的冠狀動脈內(nèi)皮細胞增殖和膠原合成，可能作為心肌纖維化的治療靶點。本研究存在一定的局限性，首先實驗需要在動物中進一步驗證，其次近年來研究表明，TGF-β2是內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化所致纖維化最有效的誘導(dǎo)物，TGF-β1的作用需要TGF-β2旁分泌循環(huán)的輔助，因此本實驗研究尚存在一定的不足，應(yīng)在后續(xù)實驗中深入地探討TGF-β家族和miRNA在心肌纖維化中的作用，為心肌纖維化的防治提供新的理論依據(jù)和新思路[17]。