RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)在牙齦癌中臨床意義

秦 晗 龔永慶 徐宏志

牙齦癌發(fā)生率高且易早期侵犯頜骨引起骨質(zhì)破壞，目前主要以手術(shù)切除為主配合放化療，治療效果欠佳[1]。近年發(fā)展起來(lái)的靶向治療因在多種腫瘤中療效顯著已使其成為新的有效治療手段[2]。研究牙齦癌發(fā)生過(guò)程中分子機(jī)制，尋找有效治療靶點(diǎn)，對(duì)于牙齦癌的徹底治療具有重要意義。核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，通過(guò)與核因子-κB受體活化因子(RANK)結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，發(fā)揮骨吸收作用。骨保護(hù)蛋白(OPG)是誘餌受體，與RANKL結(jié)合后可阻斷RANKL/RANK結(jié)合[3,4]。局部微環(huán)境中RANKL和OPG表達(dá)的相對(duì)水平即RANKL/OPG比值是決定破骨細(xì)胞形成和活性的關(guān)鍵，若比值升高，則破骨細(xì)胞形成活躍，反之則破骨細(xì)胞形成受抑[5]。

近年來(lái)RANKL與腫瘤之間關(guān)系引發(fā)關(guān)注，研究表明，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中RANKL處于持續(xù)性激活狀態(tài)，抑制RANKL可阻止腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移引起的骨質(zhì)破壞，因此認(rèn)為RANKL與腫瘤的發(fā)生、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷標(biāo)志物和有效治療靶點(diǎn)[6]。NF-κB是重要轉(zhuǎn)錄因子，主要以p65/p50二聚體形式與抑制因子(I-κB)綁定并長(zhǎng)期處于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞膜受體相應(yīng)配體刺激后，I-κB激酶通過(guò)泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)I-κB復(fù)雜磷酸化，使p65/p50二聚體被釋放進(jìn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[7,8]。NF-κBp65參與NF-κB通路激活的經(jīng)典和非經(jīng)典通路中，被視為NF-κB通路激活的重要證據(jù)。本研究將RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白和RANKL/OPG比值變化作為研究對(duì)象，以期揭示牙齦癌的發(fā)生可能與RANKL過(guò)表達(dá)后激活NF-κBp65，進(jìn)而通過(guò)NF-κB通路正反饋機(jī)制引起牙齦上皮細(xì)胞異常分化相關(guān)。

材料與方法

1.主要材料：牙齦癌臨床標(biāo)本(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院)、牙齦癌和牙齦上皮細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))、胎牛血清(上海威正翔禹生物科技有限公司)、免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)、蛋白質(zhì)預(yù)染標(biāo)志物(上海賽默飛世爾有限公司)、ECL-PLUS試劑盒(上海賽默飛世爾有限公司)、SDS-PAGE 蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司)、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)、離心機(jī)(上海賽默飛世爾有限公司)、倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)、生物安全柜(上海振樣創(chuàng)科技有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(日本三洋貿(mào)易株式會(huì)社)。

2.免疫組化檢測(cè)臨床標(biāo)本：收集2018年7月～2019年12月筆者醫(yī)院診治的牙齦癌標(biāo)本，制備組織切片，脫蠟至水，染色前60℃放置1h。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，分別加入RANKL[小鼠，美國(guó)Proteintech公司，66610-1-Ig，1∶500，(35～38)kDa]、OPG(兔，英國(guó)Abcam公司，ab9986，1∶500，56kDa)、NF-κBp65(兔，美國(guó)CST公司，#8242，1∶100，65kDa)多克隆抗體，4℃冰箱過(guò)夜，標(biāo)本徹底清洗后加入稀釋好的兔抗或鼠抗IgG抗體(兔，美國(guó)CST公司，#7074，1∶2000，小鼠，#7076，1∶2000)孵育30min。蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)并分析RANKL/OPG比值。

3.牙齦癌細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)的人牙齦癌細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞凍存管，完全解凍后，1300r/min，離心3min。而后吸去上清，加入MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，晃勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右傳代。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶消化制成(3～5)×104個(gè)/毫升單細(xì)胞懸液，以2×104/cm2的密度接種到相應(yīng)培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

4.Western blot法檢測(cè)RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá):收集牙齦癌和牙齦上皮細(xì)胞，PBS 洗滌，2×Lysis Buffer裂解，4℃、12000r/min、離心15min，而后取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白大小配制不同濃度膠，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠法進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，4℃、300mA 恒流電轉(zhuǎn)150min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。分別將稀釋好的RANKL(1∶2000)、OPG(1∶2000)、NF-κBp65(1∶500)多克隆抗體(廠家批號(hào)同免疫組化)與封閉好的PVDF 膜孵育過(guò)夜。徹底清洗后再將稀釋好的兔抗或鼠抗IgG(1∶2000)抗體(廠家批號(hào)同免疫組化)與PVDF 膜孵育1.5h。再次清洗PVDF 膜后X線顯影、定影、晾干、結(jié)果分析。內(nèi)參為GAPDH(小鼠，上海SANTA CRUZ生物技術(shù)有限公司，sc-32233，1∶2000，36kDa)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.免疫組化結(jié)果：分別在實(shí)驗(yàn)組牙齦癌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中見(jiàn)到棕色沉淀分布,RANKL、OPG在細(xì)胞質(zhì)中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，NF-κBp65在細(xì)胞核中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組免疫組化染色弱陽(yáng)性(圖1)。與對(duì)照組比較，RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)及RANKL/OPG比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2、圖3)。

圖1 免疫組化法檢測(cè)牙齦癌蛋白表達(dá)(×200)

圖2 免疫組化檢測(cè)牙齦癌蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖3 免疫組化法檢測(cè)RANKL/OPG蛋白比值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.Western blot法檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)均升高(圖4)。與對(duì)照組比較，RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)及RANKL/OPG比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5、圖6)。

圖4 Western blot法檢測(cè)牙齦癌細(xì)胞RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)結(jié)果

圖5 Western blot法檢測(cè)牙齦癌細(xì)胞RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖6 Western blot法檢測(cè)RANKL/OPG蛋白比值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

討 論

RANKL是腫瘤壞死因子超家族成員，存在膜結(jié)合和分泌型兩種形式,可與破骨前體細(xì)胞RANK相結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟。以往研究認(rèn)為，RANKL參與骨代謝、免疫、心血管等多種生理病理過(guò)程，近年來(lái)RANKL與腫瘤間關(guān)系越發(fā)受到重視[9,10]。大量研究表明，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中RANKL處于持續(xù)性激活狀態(tài)，因此認(rèn)為RANKL與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這將為相關(guān)疾病治療提供新的思路和方法。通過(guò)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓瘤細(xì)胞和骨髓間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)RANKL表達(dá)升高[11]。乳腺癌研究中提示RANKL升高可能與乳腺癌細(xì)胞表達(dá)或誘導(dǎo)多種促進(jìn)骨代謝因子，致使骨髓基質(zhì)細(xì)胞大量產(chǎn)生RANKL有關(guān)[12]。通過(guò)臨床標(biāo)本和體外培養(yǎng)的牙齦癌細(xì)胞研究顯示，牙齦癌細(xì)胞中RANKL表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示同大多數(shù)腫瘤一樣，牙齦癌中RANKL也處于激活狀態(tài)，這為本研究的最初設(shè)想即將RANKL作為牙齦癌的治療靶點(diǎn)提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

OPG作為誘餌受體，主要功能是抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，并誘導(dǎo)其凋亡。作用機(jī)制為直接抑制RANK/RANKL復(fù)合體活性，或者通過(guò)與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，間接抑制骨吸收以及OPG獨(dú)立于RANKL直接抑制破骨細(xì)胞活性，抑制骨吸收[13,14]。人體內(nèi)骨代謝平衡或失調(diào)更多取決于RANKL/OPG比值，而不是RANKL或OPG絕對(duì)含量值，比值降低，破骨細(xì)胞分化和活性降低，反之則升高。介于RANKL和OPG相互拮抗作用，因此觀察RANKL/OPG比值變化較單獨(dú)觀察RANKL和OPG變化更有意義[15]。本研究對(duì)臨床標(biāo)本和體外培養(yǎng)牙齦癌細(xì)胞中OPG蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組OPG蛋白表達(dá)升高，但牙齦癌中RANKL/OPG比值仍高于對(duì)照組。此結(jié)果提示當(dāng)RANKL和OPG表達(dá)量均升高而骨吸收沒(méi)有被相應(yīng)抑制時(shí)，可能是因?yàn)檠例l癌細(xì)胞中RANKL表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于OPG的表達(dá)，即RANKL/OPG比值增加的緣故。

NF-κB調(diào)節(jié)免疫球蛋白κ輕鏈在B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，若失調(diào)易導(dǎo)致各種惡性腫瘤發(fā)生，因此，很多研究著力于探索實(shí)體瘤中NF-κB表達(dá)的臨床意義，以提示疾病預(yù)后[16]。NF-κB主要以p65/p50二聚體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，未激活時(shí)，NF-κB與I-κB結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中，若受到細(xì)胞膜外信號(hào)刺激，I-κB激酶復(fù)合體將I-κB磷酸化，使NF-κB暴露核定位點(diǎn)。游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[17]。NF-κB信號(hào)通路可以被RANKL等炎性介質(zhì)激活，其活化后也可以作為外界刺激因子進(jìn)一步活化NF-κB，形成NF-κB自身活化的正反饋機(jī)制[18]。p65參與NF-κB激活的經(jīng)典和非經(jīng)典通路，被視為NF-κB通路激活的重要證據(jù)[19]。本研究選擇NF-κBp65作為牙齦癌檢測(cè)指標(biāo)，旨在觀察NF-κBp65激活是否與局部微環(huán)境中RANKL/OPG比值增加有關(guān)，以及NF-κB信號(hào)通路是否是牙齦癌發(fā)生的重要信號(hào)通路，進(jìn)而分析靶向RANKL治療牙齦癌時(shí)NF-κBp65表達(dá)變化與臨床效果和生存的關(guān)系。筆者臨床標(biāo)本和體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究結(jié)果同時(shí)提示，與正常對(duì)照組比較，牙齦癌中NF-κBp65存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，提示局部微環(huán)境中RANKL/OPG比值增加可能導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路激活進(jìn)而引起牙齦上皮細(xì)胞異常分化。

近年來(lái)雖然牙齦癌的基礎(chǔ)和臨床診療方法的研究取得很大進(jìn)展，但治療效果未見(jiàn)顯著提高[20]。靶向治療是針對(duì)細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因、調(diào)控分子等生物靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，達(dá)到阻止腫瘤發(fā)生、發(fā)展并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的特異性治療，因其發(fā)展迅速、療效較佳，引起眾多學(xué)者關(guān)注[21]。因此，明確牙齦癌發(fā)生過(guò)程中調(diào)控牙齦上皮細(xì)胞異常分化的分子信號(hào)機(jī)制對(duì)于牙齦癌有效治療靶點(diǎn)的選擇至關(guān)重要。本研究通過(guò)觀察RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達(dá)及RANKL/OPG比值變化，初步探討牙齦癌細(xì)胞分化的可能調(diào)控機(jī)制，從而為尋找牙齦癌有效治療靶點(diǎn)提供幫助。