鐵皮石斛益消方對(duì)肝胃不和型功能性消化不良模型大鼠的作用研究

許銀銀 蔣澤天 熊桃秀 雷珊珊 李波 陸婷婷 俞巧仙 呂圭源 陳素紅*

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床上較常見的一種消化系統(tǒng)疾病，具有包括餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛、上腹燒灼感等癥狀，經(jīng)各項(xiàng)檢查排除相關(guān)器質(zhì)性病變的疾?。?］。研究顯示，當(dāng)前全球FD 的患病率為10%～30%［2］，本病一般病程較長，影響患者生活，且容易反復(fù)發(fā)作，難以徹底治愈［3］。中醫(yī)藥治療功能性消化不良在緩解癥狀、減少復(fù)發(fā)等方面具有其特色和優(yōu)勢［4］。鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛的干燥莖，藥用歷史悠久?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曰：“久服厚腸胃，輕身延年”。鐵皮石斛“厚腸胃”的療效可使胃腸生理強(qiáng)壯，胃腸功能增強(qiáng)，表現(xiàn)為維護(hù)胃腸健康和促進(jìn)功能改善［5-10］。鐵皮石斛益消方在鐵皮石斛“厚腸胃”的藥效基礎(chǔ)上配伍“疏肝解郁”中藥加減組方，有利于鐵皮石斛防治FD 等胃腸道疾病的藥物研究與開發(fā)，以期開發(fā)防治肝胃不和型FD 的方藥。FD 被認(rèn)為是生物因素和社會(huì)心理因素共同作用的體現(xiàn)，胃腸動(dòng)力障礙與精神情志障礙是導(dǎo)致FD 發(fā)病的重要因素，腦腸軸功能的異常是發(fā)病的核心機(jī)制［11］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M人“情志不暢”加“飲食不節(jié)”的不良生活方式，采用夾尾刺激復(fù)合饑飽失常法制備肝胃不和型FD 大鼠模型，通過觀察鐵皮石斛益消方對(duì)FD 大鼠的胃腸功能以及相關(guān)腦腸肽指標(biāo)評(píng)價(jià)綜合藥效，同時(shí)為探索其可能的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72 只SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：保持飼養(yǎng)房通風(fēng)良好，燈光照明12 h/d，溫度22～25 ℃，濕度60%～70%。

1.2 藥物與試劑 鐵皮石斛（批號(hào)20180610）購自浙江森宇有限公司，香附（批號(hào)1906035）購自浙江英特醫(yī)藥股份有限公司，枸櫞酸莫沙必利分散片（批號(hào)190425）購于成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，大鼠胃動(dòng)素（MTL）（批號(hào)201912）、大鼠血管活性肽（VIP）（批號(hào)201912）、大鼠5-羥色胺（5-HT）（批號(hào)201912）ELISA 試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，胃蛋白酶試劑盒（批號(hào)20191217）購于南京建成生物生物工程研究所；H&E 染色液（批號(hào)J22D9Y78310）購于上海源葉生物科技有限公司。受試藥的制備：鐵皮石斛益消方（鐵皮石斛、香附等藥材煎煮濃縮而成）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所制備，取復(fù)方加蒸餾水浸泡煎煮，取濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至生藥濃度為1.16、0.58、0.29 g/ml，置4 ℃冰箱備用。陽性藥的配制：枸櫞酸莫沙必利分散片（規(guī)格5 mg/片），與蒸餾水配比成濃度0.15 mg/ml 的混懸液，置4 ℃冰箱備用。半固體營養(yǎng)糊的制備［12］：將10 g 羧甲基纖維素鈉溶于250 ml蒸餾水中，依次加入16 g 奶粉、8 g 白糖、8 g 淀粉和2ml 黑色墨汁，充分?jǐn)嚢杈鶆颍苽浼s300 ml 左右的黑色半固體糊，置4 ℃冰箱備用。

1.3 儀器 EPOCH2C 酶標(biāo)儀（美國Bio Tek），VIP5JR脫水機(jī)（日本SAKURA），RM2245 切片機(jī)（德國LEICA公司），JPWS-10T 超純水儀（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申盛生物科技有限公司），MiCRoc117 離心機(jī)（德國Thermo），BAS124S 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（常州諾基有限公司），P10/P200/P1000移液槍（德國Eppendorf）。

1.4 造模與給藥方法 72 只SPF 級(jí)健康SD 大鼠，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，稱重，隨機(jī)分成正常組，模型組，莫沙必利組，鐵皮石斛益消方高、中、低劑量組（11.66、5.83、2.92 g/kg），每組12 只。采用饑飽失常復(fù)合夾尾刺激法造模：每天晚上9 點(diǎn)到第2 天早上9 點(diǎn)禁食，飲水自由；夾尾法刺激大鼠，用紗布包裹止血鉗輕度鉗夾鼠尾后1/3 處，立即放開，30 min/次，2 次/d。正常組大鼠不予任何干預(yù)。造模2 周后各給藥組每天上午分別給予陽性藥或受試藥（10 ml/kg）1 次/d，正常組和模型組灌胃等量飲用水，邊造模邊給藥，連續(xù)2 周。

1.5 觀察指標(biāo) （1）體質(zhì)量、進(jìn)食量、背溫的測定：給藥期間，每天下午14 ∶00 對(duì)大鼠進(jìn)行稱重記錄。每日上午9 ∶00 每籠大鼠給予100 g 普通固體飼料，至晚上9 ∶00，記錄每籠大鼠的日進(jìn)食量，并計(jì)算平均每只大鼠的日進(jìn)食量。用紅外溫度顯示儀測背溫并拍照，用FIRE 軟件處理圖像。（2）血清D-木糖的測定：給藥2 周后，每只大鼠禁食、不禁水18 h 后，按照10 ml/kg 的灌胃劑量灌胃3%的D-木糖，1 h 后眼眶取血備用。根據(jù)間苯三酚法檢測血清D-木糖的濃度。（3）胃殘留率和小腸推進(jìn)率的測定：末次給藥后，禁食18 h（自由飲水），大鼠灌胃給予半固體營養(yǎng)糊1 ml/100 g。20 min 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉開腹，剪取完整的胃，將胃內(nèi)容物取下，剔除胃表面黏膜，擦凈表面粘液、血液，稱量全胃重量，然后沿胃彎處剪開胃體，以生理鹽水洗去胃內(nèi)固體糊，拭干后拍照并稱量胃凈重。胃殘留率（%）=胃殘留物重（g）/灌胃的營養(yǎng)糊重（g）×100%。剪取腸管幽門至回盲部，用卷尺測量腸管的長度，即小腸總長度；測量幽門至碳墨前沿的距離，即碳墨在小腸內(nèi)推進(jìn)的距離。小腸推進(jìn)率（%）=碳墨推進(jìn)長度（cm）/小腸總長度（cm）×100%。（4）血清指標(biāo)檢測：大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血，3500 r/min離心10 min，分離上層血清備用。采用ELISA 法檢測大鼠血清中MTL、VIP、5-HT 的含量。（5）胃蛋白酶活力檢測：取大鼠胃組織，按比例加入勻漿介質(zhì)，組織勻漿機(jī)碾磨，取上清液，嚴(yán)格按照胃蛋白酶測試盒說明書操作。（6）胃組織病理學(xué)觀察：取大鼠胃組織置于4%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水后，包埋切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠一般體征、體質(zhì)量及進(jìn)食量情況 正常組大鼠毛色光澤，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，排便正常。模型組大鼠毛色灰暗，稀疏易脫，精神萎靡，易怒，喜打斗，或扎堆聚集，排便量減少，糞便質(zhì)地改變，偶見不成形，也有質(zhì)地干硬。經(jīng)藥物干預(yù)后，給藥組大鼠精神狀態(tài)有所改善，行動(dòng)敏捷，大便成形。

2.2 鐵皮石斛益消方對(duì)FD 大鼠體重的影響 見表1。

表1 鐵皮石斛益消方對(duì)FD大鼠體重的影響［n=12，（±s）］

表1 鐵皮石斛益消方對(duì)FD大鼠體重的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別 給藥劑量 造模2 周（g） 給藥2 周（g） 體重增長率（%）正常組 - 283.08±36.21 373.95±50.38 32.10模型組 - 252.99±25.43* 300.20±33.90# 18.66莫沙必利組 1.56 mg/kg 253.43±23.81* 335.83±45.45 32.51鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 252.76±23.78* 333.44±39.46 31.92鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 252.82±25.47* 336.53±44.06 33.11鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 253.05±23.79* 330.77±41.48 30.71

2.3 鐵皮石斛益消方對(duì)FD 大鼠攝食量的影響 見表2。

表2 鐵皮石斛益消方對(duì)FD大鼠攝食量的影響［n=12，（±s）］

表2 鐵皮石斛益消方對(duì)FD大鼠攝食量的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

組別 劑量 攝食量（g）給藥1 周 給藥2 周正常組 - 24.47±3.40 19.60±1.61模型組 - 15.04±2.20* 15.58±0.19*莫沙必利組 1.56 mg/kg 20.06±0.80 ▲ 19.59±4.29鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 18.83±0.89# 19.11±2.00#鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 22.79±0.82 ▲ 19.23±1.99#鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 19.57±1.73# 20.91±3.59#

2.4 對(duì)模型大鼠背溫的影響 見表3 和圖1。

表3 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠背溫的影響［n=12，（±s）］

表3 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠背溫的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量 背溫（℃）正常組 - 29.45±1.94模型組 - 31.14±0.40*莫沙必利組 1.56 mg/kg 30.77±0.60鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 30.64±1.36鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 30.34±0.88#鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 30.46±0.67#

圖1 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠背溫的影響。注：A． 正常組；B． 模型組；C． 莫沙必利組；D． 鐵皮石斛益消方高劑量組；E． 鐵皮石斛益消方中劑量組；F． 鐵皮石斛益消方低劑量組

2.5 對(duì)模型大鼠血清D-木糖含量的影響 見表4。

表4 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠血清D-木糖的影響［n=12，（±s）］

表4 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠血清D-木糖的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量 血清D-木糖（μmol/L）正常組 - 0.22±0.04模型組 - 0.16±0.04*莫沙必利組 1.56 mg/kg 0.18±0.06鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 0.20±0.05#鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 0.19±0.03#鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 0.17±0.03

2.6 對(duì)模型大鼠胃內(nèi)殘留率及小腸推進(jìn)率的影響 見圖2。

圖2 鐵皮石斛益消方對(duì)模型大鼠胃內(nèi)殘留率（A）及小腸推進(jìn)率（B）的影響。注：與正常組比較，★P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01

2.7 對(duì)模型大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響 胃黏膜大體觀結(jié)果顯示，各組大鼠胃黏膜成淺紅色，皺襞正常，無明顯潰瘍、糜爛和出血點(diǎn)（見圖3），各組大鼠胃黏膜無明顯形態(tài)學(xué)改變。進(jìn)一步的HE 染色結(jié)果顯示，正常組和各給藥組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞完整，下層可見少量中性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列整齊，腺體排列比較整齊；模型組可少見腺體缺失，可見充血的毛細(xì)血管，部分上皮細(xì)胞脫落，無明顯病理形態(tài)學(xué)改變（見圖4）。

圖3 鐵皮石斛益消方對(duì)胃黏膜大體觀的影響。注：A． 正常組；B． 模型組；C． 莫沙必利組；D． 鐵皮石斛益消方高劑量組；E． 鐵皮石斛益消方中劑量組；F． 鐵皮石斛益消方低劑量組

圖4 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠胃黏膜病理形態(tài)影響（HE，×200）。注：A．正常組；B． 模型組；C． 莫沙必利組；D． 鐵皮石斛益消高劑量組；E． 鐵皮石斛益消中劑量組；F． 鐵皮石斛益消方低劑量組

2.8 對(duì)模型大鼠胃蛋白酶活力的影響 見表5。

表5 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠胃蛋白酶活力的影響［n=8，（±s）］

表5 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠胃蛋白酶活力的影響［n=8，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量 胃蛋白酶活力（u/mgprot）正常組 24.18±2.77模型組 20.88±2.19*莫沙必利組 1.56 mg/kg 23.39±2.07#鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 23.05±2.77鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 23.95±3.97鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 21.92±2.81

2.9 對(duì)模型大鼠血清MTL、VIP、5-HT 含量的影響 見圖5。

圖5 鐵皮石斛益消方對(duì)大鼠血清MTL（A）、VIP（B）及5-HT（C）的影響。注：與正常組比較，★P＜0．05，★★P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01

3 討論

功能性消化不良在中醫(yī)學(xué)屬于“痞滿”、“胃脘痛”范疇［13］。中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)在2017 年的《消化不良中醫(yī)診療共識(shí)意見》中，根據(jù)中醫(yī)辨證將FD 分為脾虛氣滯證、肝胃不和證、脾胃濕熱證、脾胃虛寒（弱）癥和寒熱錯(cuò)雜證五類。其中肝胃不和證是臨床上最為常見的類型之一，本證大多為情志不舒，肝郁氣滯而影響胃腸功能，或飲食損傷胃氣，胃病及肝所致。多以理氣解郁，和胃降逆法治之。鐵皮石斛益消方中以鐵皮石斛清火養(yǎng)胃生津；香附，疏肝解郁，理氣寬中，兩者共為君藥。綜合全方，散收并用，疏養(yǎng)結(jié)合，肝脾胃同治，氣血兼顧，共奏疏肝理氣，調(diào)脾和胃之功。

本實(shí)驗(yàn)采用了夾尾刺激模擬人的“情志不暢”、“怒傷肝，久則郁”，制作大鼠肝郁模型；復(fù)合不規(guī)則喂養(yǎng)法，模擬人的“飲食不節(jié)”、“饑飽失常，腸胃乃傷”，造成大鼠胃腸動(dòng)力障礙。兩種復(fù)合因素造模，更符合FD臨床發(fā)病情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型大鼠毛發(fā)凌亂，精神萎靡，易怒或蜷縮在角落，自主活動(dòng)能力減少，同時(shí)體重和攝食量顯著下降，胃腸動(dòng)力顯著下降，小腸吸收能力下降，成功制備出符合肝胃不和型的FD 大鼠模型。

鐵皮石斛益消方的藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠給予鐵皮石斛益消方后，體重和攝食量均有一定程度的恢復(fù)，還可改善肝郁內(nèi)熱所導(dǎo)致的背溫升高。由于D-木糖在小腸吸收后，不被肝臟代謝，直接被小腸黏膜吸收進(jìn)入血液，所以血清D-木糖常被用來評(píng)價(jià)小腸的吸收功能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清D-木糖含量顯著降低，小腸吸收能力減弱。給藥鐵皮石斛益消方后，大鼠血清D-木糖含量有所提高，提示鐵皮石斛益消方可以提高小腸的吸收能力。胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率是研究胃腸功能的基本實(shí)驗(yàn)方法，為評(píng)價(jià)FD 嚴(yán)重程度的兩個(gè)最主要指標(biāo)。與正常組相比，模型組胃內(nèi)殘留量顯著升高，小腸推進(jìn)率顯著下降，鐵皮石斛益消方給藥后增強(qiáng)了模型大鼠的胃排空能力和小腸推動(dòng)能力，初步證實(shí)了鐵皮石斛益消方治療FD 的效果。

雙向腦-腸相互作用在FD 患者中起著重要作用，腦-腸肽如MTL、VIP 等來源于胃腸道的物質(zhì)被輸送至血液循環(huán)中，下丘腦通過來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的激素信號(hào)和外周神經(jīng)信息調(diào)節(jié)生理功能。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步研究了鐵皮石斛益消方治療對(duì)FD 相關(guān)的腦腸肽（MTL、VIP、5-HT）水平的影響。MTL 和VIP 作為胃腸動(dòng)力相關(guān)的腦腸肽在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。MTL 是由上小腸分泌的含有22 個(gè)氨基酸的肽，可通過增強(qiáng)遷移運(yùn)動(dòng)復(fù)合物通過內(nèi)分泌和神經(jīng)途徑刺激胃腸運(yùn)動(dòng)收縮。VIP 是一種28 個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽，該神經(jīng)肽參與許多生理腸道功能，在胃腸道中抑制胃腸運(yùn)動(dòng)及胃排空、減慢小腸運(yùn)動(dòng)等作用。臨床發(fā)現(xiàn)FD 患者的胃排空障礙、收縮力減弱、小腸運(yùn)動(dòng)減弱與血漿MTL 水平的降低［14］、VIP 水平的升高有關(guān)［15］。在給藥組中，造模導(dǎo)致血清MTL 和VIP 水平顯著改善。因此，模型組中大鼠血清MTL 的減少和VIP 的升高可能是FD 胃腸動(dòng)力減弱癥狀的原因之一，鐵皮石斛益消方通過提高其水平促進(jìn)了胃腸動(dòng)力功能。

5-HT 是一種具有多重生物學(xué)效應(yīng)的腦腸肽，具有促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、刺激胃腸激素分泌等作用，并參與調(diào)節(jié)情感、認(rèn)知、情緒等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。同時(shí)5-HT的表達(dá)降低也是抑郁癥發(fā)病的重要生物學(xué)基礎(chǔ)之一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清的5-HT 含量降低，這與大鼠的肝郁，情志不暢的狀態(tài)相符；鐵皮石斛益消方可使模型大鼠的5-HT 含量恢復(fù)至正常水平，使大鼠的精神狀態(tài)得到改善。提示鐵皮石斛益消方改善FD 模型大鼠的作用機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)，表現(xiàn)為血清5-HT 含量的增加，改善了模型大鼠精神狀態(tài)，自主活動(dòng)和探索能力增加，從而促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)。鐵皮石斛益消方可以通過調(diào)節(jié)這些腦腸肽的水平，進(jìn)而改善FD 大鼠的胃腸道功能。

綜上所述，鐵皮石斛益消方改善肝胃不和型FD 大鼠的作用機(jī)制與雙向調(diào)節(jié)胃腸激素有關(guān)，表現(xiàn)為增加模型大鼠血清MTL 含量，下調(diào)血清VIP 水平，并通過促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的釋放，促進(jìn)模型大鼠的胃排空及小腸推進(jìn)，增加小腸的吸收能力，最終改善胃腸道動(dòng)力障礙。