液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定加工食品中丙烯酰胺的含量

劉 剛，王 毅*，王 鑫，雷 激，何 楠

（1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川 成都 611731；2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

丙烯酰胺是一種白色晶狀化合物，在工業(yè)生產(chǎn)中主要用于聚丙烯酰胺的生產(chǎn)。2002 年瑞典研究人員在經(jīng)過高溫加工后的食品中發(fā)現(xiàn)了丙烯酰胺的存在，而在生食材和煮制的食品中基本未發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺[1]。其在食品中產(chǎn)生的途徑源自加熱工藝過程中的美拉德反應(yīng)[2]。它通過一系列的脫氨脫羧消去反應(yīng)便產(chǎn)生了丙烯酰胺[3]。丙烯酰胺俗稱“丙毒”，具有潛在的神經(jīng)毒性和準(zhǔn)致癌性[4]。研究表明油炸、燒烤、高溫烘焙等方式加工的含淀粉食品具有較高的丙烯酰胺水平[5]，因此應(yīng)在合理膳食的基礎(chǔ)上，盡量遠(yuǎn)離這些不健康的食品。

目前關(guān)于檢測食品中丙烯酰胺水平的方法有很多，包括酶聯(lián)免疫法[6]、生物傳感器法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、離子色譜法[9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜質(zhì)譜法[11]、高效液相色譜法[12]、高效液相色譜質(zhì)譜法[13]，其中色譜法是目前被認(rèn)為最為準(zhǔn)確有效的檢測方案[14]。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，在對方法進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對日常生活中主食及日常接觸的部分零食中的丙烯酰胺含量進(jìn)行了測定，作為日常飲食攝入量的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1200 高效液相色譜儀(美國安捷倫)、Agilent 6460 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫)、XW-80A 型漩渦混合器(上海青浦瀘西儀器廠)、離心機(jī)(湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、氮吹儀(瑞典Biotage)、配氮吹發(fā)生裝置(美國Parker)、超聲波清洗器(德國ELMA)、電子天平(梅特勒?托利多精密儀器有限公司)、移液器(美國Gilson)、純水儀(美國Millipore)。

1.2 材料與試劑

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%，Dr.E)、13C-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%，Dr.E)、乙腈（質(zhì)譜級，Sigma-Aldrich）、甲酸（色譜級,Fisher Scientific）、甲醇（色譜級，Sigma-Aldrich）、正己烷（普通級，Sigma-Aldrich）、亞鐵氰化鉀(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)、硫酸鋅(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)、實(shí)驗(yàn)用水均為自制超純水，凈化小柱(Agela Technologies)。

實(shí)驗(yàn)用樣品來源于單位食堂及市售。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，用甲醇溶解定容，分別配制成1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷藏保存。

準(zhǔn)確吸取丙烯酰胺儲備液一定體積，用0.1%的甲酸水稀釋定容至刻度，配制成10 000 ng/mL 的中間稀釋液，備用；吸取一定體積13C3-丙烯酰胺儲備液，0.1%的甲酸水稀釋成1 000 ng/mL 的中間液，備用。將丙烯酰胺中間液稀以逐級稀釋的形式配制成3、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL 的工作液上機(jī)測試(其中均含100 ng/mL 的13C3-丙烯酰胺)。

1.3.2 儀器條件

液相條件：Agilent Hillic Plus 色譜柱 2.1 mm×100 mm× 3 μm；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈(A)：0.1%甲酸水(B)，采用梯度程序洗脫，洗脫程序0.00～3.10 min(A:60.0%)，3.10～4.00 min(60.0%～95.0%)，4.00～6.00 min(95.0%)，6.10～8.00 min(60.0%)；混合流動相流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。

質(zhì)譜條件：采用ESI 源正模式；離子源溫度325 ℃；錐口電壓500 V；毛細(xì)管電壓2 000 V；氮?dú)饬魉?.0 L/min；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；方法在正式加載檢測樣本時采用分段掃描，一方面可以將附近干擾峰從TIC 圖中去除，使圖譜更加整潔，另外可以減輕批量不間斷進(jìn)樣造成的錐口污染，影響質(zhì)譜靈敏度和響應(yīng)，分段情況可根據(jù)方法目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)出峰時間定義。本文分段方案如表1所示，質(zhì)譜MRM 參數(shù)如表2 所示。

1.3.3 樣品的前處理方案

液體樣品應(yīng)均質(zhì)混勻，固體樣品取可食部分用粉碎機(jī)均勻粉碎。稱取2.0 g 待測樣本于50 mL 離心管中,加入200 ng 當(dāng)量的13C-丙烯酰胺，加入35mL 的超純水(液態(tài)樣本用超純水稀釋至35 mL，較干凈樣本直接加水或稀釋至40 mL)，振蕩器上以2 000 r/min 轉(zhuǎn)速振蕩約20 min，準(zhǔn)確移取15%亞鐵氰化鉀溶液和30%硫酸鋅溶液各2.5 mL 振蕩搖勻，后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)10 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液。對于含油較多的樣本，應(yīng)加入適量正己烷強(qiáng)烈振蕩進(jìn)行脫脂，離心后轉(zhuǎn)移水相層備用，此時待凈化備用液體積為40 mL。

表1 丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)分段采集情況

表2 丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)MRM 參數(shù)

采用對堿性化合物具有高度選擇的復(fù)合型專用丙烯酰胺凈化小柱，預(yù)先分別用5 mL 甲醇、5 mL 水對小柱活化，加載上述樣液20 mL 于活化好的專用凈化小柱中，等待液體自然通過至干，用5 mL 甲醇分2 次洗脫并收集慮出液體，殘留在小柱中的液體應(yīng)用注射器活塞慢慢壓出。將收集好的濾液置于氮吹儀吹至近干(水浴溫度40 ℃)，用0.1%的甲酸水定容至1 mL，均質(zhì)后過0.22 μm 水相濾膜上機(jī)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離柱的選擇

本文對Zorbox-SB C8、Eclipse C18、T3、Hillic 4 種色譜柱對丙烯酰胺的分離情況進(jìn)行了對比。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用Zorbox-SB C18、Eclipse C18對丙烯酰胺的保留均不理想，在樣品測試中容易與干擾物質(zhì)共流出，如圖1 和圖2 所示。即使將流動相水相比例提高到分離柱最大耐受極限，也不能改善保留時間，因此可以認(rèn)為丙烯酰胺在Zorbox-SB C8、Eclipse C18上無保留。這與丙烯酰胺結(jié)構(gòu)中仲胺基團(tuán)具有較強(qiáng)極性有很大關(guān)系，因此Zorbox-SB C8、Eclipse C18不適合用于目標(biāo)物質(zhì)分離。T3、Hillic 色譜柱對丙烯酰胺具有較強(qiáng)的保留，可用于丙烯酰胺的分離。利用T3 色譜柱分離TIC 峰型尖銳，但有一定的拖尾現(xiàn)象，從峰的對稱性看，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選Hillic色譜柱用于分析，如圖1 所示。

圖1 不同類型色譜柱對丙烯酰胺對照品分離情況（左起1 為Zorbox-SB C8；2 為Eclipse C18；3 為T3；4 為Hillic）

2.2 洗脫流動相的選擇

本文選取實(shí)驗(yàn)室常用的流動相進(jìn)行比較。有機(jī)相為甲醇、乙腈，水相為超純水、0.1%甲酸水。將流動相兩兩配比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所選有機(jī)相分別和水相兩兩配對作為洗脫流動相均能夠表現(xiàn)出較好的響應(yīng)和峰型。在正模式下，由于在水相流動相中加入適量的H+更有利于被測組分的離子化，提高響應(yīng)，因此優(yōu)選甲醇、乙腈與0.1%甲酸水搭配。本實(shí)驗(yàn)選取Hillic 色譜柱進(jìn)行分離，其屬于典型的正向色譜柱反向運(yùn)用，色譜柱填料為未經(jīng)特殊處理的裸硅膠，甲醇作為流動相可能會出現(xiàn)填料硅膠的溶出，對色譜柱造成不可逆破壞，因此本實(shí)驗(yàn)選取乙腈：0.1%甲酸水作為洗脫流動相（有機(jī)相不得低于60%）。加標(biāo)樣本中丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的總離子色譜圖（TIC）及多反應(yīng)監(jiān)測圖譜(MRM)如圖3所示。

圖2 不同類型色譜柱對加標(biāo)樣本的分離情況（左起A 為Zorbox-SB C8；B 為Eclipse C18；C 為T3；D 為Hillic；A′、C′、D′均為雜質(zhì)）

圖3 加標(biāo)樣本中丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的TIC 圖及MRM 圖（加標(biāo)質(zhì)量濃度10 ng/mL）

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍的選擇及擬合相關(guān)性

按1.3 實(shí)驗(yàn)條件配制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上液相色譜質(zhì)譜，內(nèi)標(biāo)法定量，以一次線性方程擬合曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)X為質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)Y軸為響應(yīng)強(qiáng)度），結(jié)果表明在3～2 000 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)離子化效果良好，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R≥0.999。

2.3.2 檢出限和定量限

選取米飯（蒸制不含油）、餃子（蒸制含油）樣本為基質(zhì)，分別向兩種基質(zhì)中加入較低質(zhì)量濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.3 中的前處理方案處理后上機(jī)測試，所得響應(yīng)在MassHunter 定性軟件中計(jì)算信噪比（S/N），根據(jù)信噪比計(jì)算結(jié)果提示對加標(biāo)量做調(diào)整，可得到較為準(zhǔn)確的檢出限。本文選用兩種不同的基質(zhì)對檢出限進(jìn)行了評估，在丙烯酰胺加入當(dāng)量為6 ng 時基本都能滿足信噪比S/N=3，因此本方法的檢出限設(shè)定為3 μg/kg，定量限設(shè)定為10 μg/kg。

2.3.3 精密度及其回收率

以米飯（蒸制）作為空白基質(zhì)樣，均勻制樣后稱取適量樣本A、B、C、D 四組，每組各6 份。分別加入丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品6、30、60、300 ng 按1.3.3 的方案進(jìn)行前處理后上液相色譜質(zhì)譜測定，所得結(jié)果如表3 所示，從結(jié)果中可見在檢出限質(zhì)量濃度加標(biāo)回收中數(shù)據(jù)略有偏高的現(xiàn)象，這很有可能是低濃度加標(biāo)受樣本基質(zhì)影響較大的原因造成的，隨著加標(biāo)濃度的增加，平均回收率基本能達(dá)到一個較為平穩(wěn)的水平。從表3 整體數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)中累積的其他基質(zhì)的數(shù)據(jù)看，均符合相關(guān)方法確認(rèn)技術(shù)要求[15]。

表3 以米飯為基質(zhì)丙烯酰胺加標(biāo)的精密度和回收率（n=6）

2.3.4 樣品的測定

本文對作者所在單位食堂中的日常食品，攤販?zhǔn)圪u及商店中的部分典型食品進(jìn)行了不定期采樣測定，結(jié)果僅做參考，數(shù)據(jù)如表4 所示。分析發(fā)現(xiàn)一般通過蒸制、直接水煮的食物基本都不容易檢出丙烯酰胺，如日常主食蒸煮米飯、面條，水煮蔬菜、純牛奶等，這可能是由于在有充足水分條件下加熱食物，不會觸發(fā)美拉德反應(yīng)進(jìn)而抑制了丙烯酰胺的產(chǎn)生。而通過油炸、焙烤、炒制的食物，或多或少都能夠發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺的影子，其中含淀粉較高的油炸類食品、部分烘焙類食品表現(xiàn)尤為突出，農(nóng)貿(mào)市場自制售賣油炸土豆片、個別膨化食品甚至出現(xiàn)上千當(dāng)量的情況，這也說明了在油炸、烘焙等高溫條件下，含淀粉較高的食品容易出現(xiàn)褐變從而激發(fā)一系列丙烯酰胺生成的聯(lián)鎖反應(yīng)[16]。

表4 不同食品中丙烯酰胺含量統(tǒng)計(jì)

3 總結(jié)

本文對丙烯酰胺色譜分離柱進(jìn)行了初步篩查，同時對色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了加工食品中丙烯酰胺分析檢測的液相色譜質(zhì)譜分析方案。實(shí)驗(yàn)表明，不同基質(zhì)的樣本經(jīng)凈化處理，采用Hillic 色譜柱，以乙腈和0.1%甲酸水為流動相分離經(jīng)質(zhì)譜分析后具有良好的重復(fù)性和回收率，該方案適用于不同類型加工食品中丙烯酰胺含量的檢測。通過日常生活中典型食品中丙烯酰胺的初步監(jiān)測結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺含量較高的食物大多是含含碳水化合物較多且經(jīng)過高溫油炸、烘焙或炒制的，而通過蒸制、水煮的食物、傳統(tǒng)炒菜等含量較低或檢不出，因此日常以常規(guī)三餐為主的人群在丙烯酰胺這個潛在有害物質(zhì)的暴露量上是相對較小的。