蛻膜巨噬細(xì)胞調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的研究

沙曉燕?伍彬升?鮑俊杰?劉慧姝

【摘要】目的 探討蛻膜巨噬細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的調(diào)控。方法 取20 ～ 35歲女性正常早孕（6 ～ 7+6周）行人工流產(chǎn)的蛻膜組織15 ～ 20 g。將蛻膜組織充分清洗后使用Collagenase和Dnase消化2次，每次30 min，細(xì)胞懸液過濾后通過CD14+免疫磁珠分選，并行免疫熒光鑒定。流式細(xì)胞儀分析巨噬細(xì)胞M1型（CD80+和CD86+）和M2型（CD163+和CD206+）。獲得的巨噬細(xì)胞置于6孔板培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞上清。巨噬細(xì)胞上清與滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo共培養(yǎng)24 h，實(shí)時(shí)定量PCR檢測HTR-8/SVneo的水通道蛋白1（AQP 1）mRNA相對表達(dá)量變化，以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9 mRNA相對表達(dá)量的變化。應(yīng)用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）檢測人早孕蛻膜巨噬細(xì)胞上清對人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo侵襲力的影響。結(jié)果 成功建立人類早孕蛻膜巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。流式細(xì)胞檢測顯示，人類正常早孕蛻膜組織中巨噬細(xì)胞以M2型為主，約占全部巨噬細(xì)胞的87%。巨噬細(xì)胞上清使HTR-8/SVneo的AQP 1和MMP-9 mRNA相對表達(dá)量升高（P均< 0.001）。RTCA結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞上清明顯增強(qiáng)HTR-8/SVneo的侵襲力（P < 0.001）。結(jié)論 體外培養(yǎng)條件下，蛻膜巨噬細(xì)胞可能通過介導(dǎo)AQP1表達(dá)升高而增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。

【關(guān)鍵詞】蛻膜巨噬細(xì)胞;水通道蛋白1;滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力;實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析

Study of the regulation of trophoblast invasion by decidual macrophages Sha Xiaoyan， Wu Binsheng， Bao Junjie， Liu Huishu. Department of Obstetrics， Preterm Birth Prevention and Treatment Research Unit， Guang-zhou Women and Childrens Medical Center， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510623， China

Corresponding author， Liu Huishu， E-mail： liuhuishu@ gwcmc. org

【Abstract】Objective To investigate the regulatory effect of decidual macrophages on the invasion of trophoblast. Methods Decidual tissues （15-20 g） were collected from clinically normal first trimester （6 - 7+6 weeks） pregnant women （20-35 years old） who underwent elective termination of pregnancy for non-medical reasons. Freshly-collected decidual tissues were rinsed with PBS and digested with collagenase Type IV and DNase I for 30 min twice. Macrophages were purified using a Ficoll-Hypaque gradient followed by CD14+ selection using magnetic beads， and identified by immunofluorescence. The percentage of M1 macrophages （CD80 and CD86） and M2 macrophages （CD163 and CD206） were analyzed by flow cytometry. The macrophages were cultured in a 6-well plate and the supernatant was collected 24 h later. The macrophage supernatant was co-cultured with trophoblast cell line HTR-8/SVneo for 24 h. The changes in the relative expression of AQP1 in HTR-8/SVneo as well as those of matrix metalloproteinase 2 （MMP2） and MMP9 were detected by real-time quantitative PCR. Real-Time Cell Analysis was used to evaluate the effect of macrophage supernatant on the invasiveness of HTR-8/SVneo. Results An in vitro cell culture system of human early pregnant decidual macrophages was established. Flow cytometry results showed that M2 macrophages were predominant in normal early pregnant decidual tissues， accounting for approximately 87%. Macrophage supernatant significantly up-regulated the expression levels of AQP 1 and MMP 9 in HTR-8/SVneo （both P < 0.001）. RTCA demonstrated that macrophage supernatant significantly enhanced the invasiveness of HTR-8/SVneo （P < 0.001）. Conclusion Decidual macrophages may enhance the trophoblast invasiveness by mediating the up-regulated expression of AQP 1 in vitro.

【Key words】Decidual macrophage;Aquaporin 1;Trophoblast invasion;Real-time cell analysis

胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力異常可引起流產(chǎn)、子癇前期/子癇、胎兒生長受限、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、胎盤植入等妊娠相關(guān)性疾病[1]。巨噬細(xì)胞在母胎界面免疫狀態(tài)的形成和維持中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[2]。巨噬細(xì)胞如果發(fā)生分化異常、亞群平衡失調(diào)或功能異常時(shí)，也會導(dǎo)致流產(chǎn)、子癇前期、胎兒生長受限等病理妊娠及不良妊娠結(jié)局[3]。母胎界面巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞可能調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，但具體機(jī)制不清。多項(xiàng)研究顯示，水通道蛋白1（AQP1）不僅調(diào)控多種細(xì)胞的水通透性，而且介導(dǎo)病理生理變化過程中的細(xì)胞遷移及侵襲[4]。本研究探討蛻膜巨噬細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的調(diào)控，旨在為滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力異常相關(guān)疾病的研究提供新的思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、材 料

1. 蛻膜組織

2018年7至12月在本院計(jì)劃生育門診要求人工流產(chǎn)、孕6 ～ 7+6周的正常妊娠婦女（20 ～ 35歲）13例，取其人工流產(chǎn)術(shù)后的蛻膜組織。入組者既往月經(jīng)規(guī)律，無自然流產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史，無內(nèi)科合并疾病，本次妊娠期間無陰道異常出血，B超檢查提示胚胎發(fā)育正常。所有操作已通過廣州市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會審批，入組者均已簽署知情同意書。

2. 主要設(shè)備

包括低溫冰箱（Baxter，美國），恒溫水浴箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國），微量加液器（Eppendoff，德國），生物顯微鏡（Olympas BX 50，日本），臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠， 中國），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Eppendorf公司，德國）， 免疫磁珠細(xì)胞分選（MACS）分離器（Mihenyi Biotec， 德國）， MACS分離柱（Miltenyi Biotec， 德國），流式細(xì)胞儀（BD FACS Canto， 美國），iCelligence實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀DP（ACEA， 美國），熒光定量PCR儀Mx3000P（Agilent Stratagene， 美國）。

3. 主要材料

滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo由Gendie Lash 教授贈送，購于ATCC。其他材料包括胎牛血清（Gibco公司， 美國），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司， 美國），0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Gibco公司，美國），RPMIl640（Sigma公司，德國），CD14一抗（Sigma公司，德國），CY3-兔抗鼠二抗（Sigma公司， 德國），MACS抗CDl4抗體磁珠（Miltenyi Biotec， 德國），CD14 PerCP、HLA-DR APC、CD80 FITC、CD86 PE-Cy7、CD163 BV421、CD206 PE流式抗體（BD公司， 美國），基質(zhì)膠（Corning公司， 美國）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 蛻膜巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

收集蛻膜組織15 ～ 20 g，生理鹽水充分清洗，去除殘留血塊。將蛻膜切成小塊組織，轉(zhuǎn)移至含有15 ml 消化液（含膠原酶1 g/L和DNA酶 0.04 kU/L）的50 ml離心管中。將離心管置于MACS 轉(zhuǎn)子上，配平，轉(zhuǎn)動30 min。取出離心管，靜置2 ～ 3 min使組織沉淀。取40 μm細(xì)胞篩過濾組織上清液。重復(fù)消化2 ～ 3次。已過濾的組織上清液500×g離心5 min，棄上清。加入15 ml含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，備用（13例組織中蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)成功10例）。

次日將T75培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，500×g離心5 min;用180 μl預(yù)冷的MidiMACS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，加入20 μl CD14磁珠，置于4℃冰箱孵育15 min。將MACS磁柱固定在分離器上，提前用1 ml MidiMACS緩沖液將柱子潤濕。取800 μl預(yù)冷的MidiMACS緩沖液加入細(xì)胞中。細(xì)胞過柱，加入1 ml MidiMACS緩沖液清洗磁柱，重復(fù)3次，直至濾液澄清。收集磁柱上的細(xì)胞，500×g離心5 min，RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。免疫熒光鑒定后將蛻膜巨噬細(xì)胞傳代于6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，加入2 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清備用。

2. 流式細(xì)胞儀檢測蛻膜巨噬細(xì)胞分型

次日取T75培養(yǎng)瓶中約1×106個(gè)貼壁細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，CD14和HLA-DR標(biāo)記蛻膜巨噬細(xì)胞，CD80和CD86標(biāo)記M1型蛻膜巨噬細(xì)胞，CD163和CD206標(biāo)記M2型蛻膜巨噬細(xì)胞。

3. 滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo的表達(dá)變化檢測

滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo傳代于6孔板，每孔3×106個(gè)細(xì)胞，DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基并分組，對照組予1/2 DMEM/F12完全培養(yǎng)基+1/2 RPMI1640完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組予1/2 DMEM/F12完全培養(yǎng)基+1/2巨噬細(xì)胞上清。培養(yǎng)24 h后分別收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測AQP 1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9表達(dá)的變化，引物序列見表1，2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

4. 滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力檢測

應(yīng)用xCELLigence DP多功能實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析（RCTA）儀，使用CIM檢測板檢測滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力。CIM下室鋪基質(zhì)膠20 μl，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱4 ～ 6 h，待基質(zhì)膠完全凝固后方可用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)CIM下室分組，對照組予85 μl DMEM/F12完全培養(yǎng)基+80μl RPMI1640完全培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組予85 μl DMEM/F12完全培養(yǎng)基+80 μl巨噬細(xì)胞上清液。CIM上室與下室組合，上室加入30 μl無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37?C、5% CO2的培養(yǎng)箱平衡1 h，置于DP 系統(tǒng)上進(jìn)行基線測量。上室加入100 μl無血清DMEM/F12 HTR-8/SVneo細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)目為5×104個(gè)，均平行設(shè)置復(fù)孔。室溫放置30 min后放入培養(yǎng)箱的儀器上，每15 min監(jiān)測并記錄細(xì)胞指數(shù)值（CI，CI越高代表穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量越多，即細(xì)胞的侵襲力越高），連續(xù)觀察48 h。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、蛻膜巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

應(yīng)用MACS分離人類早孕蛻膜巨噬細(xì)胞，可得到活性較高的巨噬細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光方法進(jìn)行巨噬細(xì)胞CD14抗體的再次鑒定，確定所分離的細(xì)胞為蛻膜巨噬細(xì)胞，見圖1。

二、蛻膜巨噬細(xì)胞的M1、M2分型

應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行巨噬細(xì)胞的分型鑒定，人類早孕蛻膜巨噬細(xì)胞中以M2型為主，約占全部巨噬細(xì)胞的87%，見圖2。

三、滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo的AQP1、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量變化

實(shí)驗(yàn)組蛻膜巨噬細(xì)胞上清液與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)后，滋養(yǎng)細(xì)胞AQP1 mRNA及MMP-9 mRNA相對表達(dá)量均比對照組升高（P均< 0.001），MMP-2表達(dá)無明顯變化（P > 0.05），見圖3和表2。

四、蛻膜巨噬細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo侵襲力的影響

RCTA顯示，實(shí)驗(yàn)組的CI值更高，即巨噬細(xì)胞上清液使人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo的侵襲力更強(qiáng)（見圖4）。滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo實(shí)時(shí)監(jiān)測48 h，實(shí)驗(yàn)組CI值為2.52±0.15，對照組為1.63±0.13，實(shí)驗(yàn)組CI值高于對照組（t = 13.652，P < 0.001）。

討論

滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移至子宮的分子機(jī)制目前尚不清楚，但多項(xiàng)研究顯示其侵襲過程是分子和細(xì)胞的相互作用調(diào)節(jié)，受滋養(yǎng)細(xì)胞本身和母胎界面微環(huán)境的精細(xì)調(diào)控。生理妊娠情況下，巨噬細(xì)胞普遍存在于母胎界面，蛻膜巨噬細(xì)胞主要參與蛻膜化的進(jìn)程，促進(jìn)母胎免疫耐受環(huán)境形成、協(xié)助滋養(yǎng)細(xì)胞侵入和螺旋動脈形成等。但蛻膜巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過體外培養(yǎng)人早孕蛻膜巨噬細(xì)胞，證實(shí)早孕蛻膜組織中主要為M2 型巨噬細(xì)胞;并將蛻膜巨噬細(xì)胞在體外條件下與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，而滋養(yǎng)細(xì)胞的AQP1及MMP-9表達(dá)升高。

巨噬細(xì)胞按照其表型和分泌的細(xì)胞因子可以分為2種極化類型，即經(jīng)典活化的M1 型和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞[5]。母胎界面中的巨噬細(xì)胞主要為M2型，分泌高水平的抑制性細(xì)胞因子IL-10，低表達(dá)促炎性細(xì)胞因子IL-1β，因而有利于維持免疫耐受及正常妊娠狀態(tài)。妊娠期疾病或者母胎界面微環(huán)境的變化可使M1型和M2型巨噬細(xì)胞發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。Li等[3]的研究顯示，子癇前期孕婦蛻膜中巨噬細(xì)胞數(shù)量偏高，且粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）表達(dá)過量;而GM-CSF 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化[6]。因此，研究者認(rèn)為M1 型巨噬細(xì)胞與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。另一研究報(bào)道中，胎盤巨噬細(xì)胞CD74缺失后，活化的巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變，且高表達(dá)TNF-α、MCP-1等，而CD74基因敲除小鼠的子宮變小，螺旋動脈重塑受阻，并出現(xiàn)胚胎生長受限，研究者認(rèn)為巨噬細(xì)胞向促炎方向的活化改變，干擾了滋養(yǎng)細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致病理妊娠[7]。

研究顯示AQP1不僅調(diào)控多種細(xì)胞的水通透性，而且介導(dǎo)病理生理變化過程中的細(xì)胞遷移及侵襲[4， 8]。Mu等[9]研究顯示，AQP1在大鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中表達(dá)升高，AQP1 siRNA通過抑制β-catenin信號傳導(dǎo)通路抑制關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Shu等[10]對子宮內(nèi)膜異位癥小鼠進(jìn)行研究，結(jié)果顯示AQP1在子宮內(nèi)膜異位癥中呈高表達(dá)，通過siRNA抑制AQP1基因表達(dá)使子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附和侵襲能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增加，且血管生成受到抑制。

本研究通過體外培養(yǎng)人早孕蛻膜巨噬細(xì)胞，證實(shí)早孕蛻膜巨噬細(xì)胞中主要為M2型巨噬細(xì)胞，蛻膜巨噬細(xì)胞在體外條件下與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力，而滋養(yǎng)細(xì)胞的AQP1及MMP-9表達(dá)升高。因此，蛻膜巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，這可能與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞AQP1的表達(dá)有關(guān)。至于是否能通過調(diào)節(jié)蛻膜巨噬細(xì)胞的活性來調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞AQP1 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，預(yù)防胎盤發(fā)育異常相關(guān)疾病，還需進(jìn)一步探索。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 楊建波， 陳漢青. 胎盤種植異常的產(chǎn)前診斷與預(yù)防. 新醫(yī)學(xué)， 2009， 40（1）：9-11.

[2] Ning F， Liu H， Lash GE. The role of decidual macrophages during normal and pathological pregnancy. Am J Reprod Immunol， 2016， 75（3）：298-309.

[3] Li M， Piao L， Chen CP， Wu X， Yeh CC， Masch R， Chang CC， Huang SJ. Modulation of decidual macrophage polarization by macrophage colony-stimulating factor derived from first-trimester decidual cells： implication in preeclampsia. Am J Pathol， 2016，186（5）：1258-1266.

[4] Sha XY， Liu HS， Ma TH. Osmotic water permeability diversi-fication in primary trophoblast cultures from aquaporin 1-deficient pregnant mice. J Obstet Gynaecol Res， 2015， 41（9）：1399-1405.

[5] Brown MB， von Chamier M， Allam AB， Reyes L. M1/M2 macrophage polarity in normal and complicated pregnancy. Front Immunol， 2014， 5：606.

[6] Weiss G， Sundl M， Glasner A， Huppertz B， Moser G. The trophoblast plug during early pregnancy： a deeper insight. Histochem Cell Biol， 2016， 146（6）：749-756.

[7] Przybyl L， Haase N， Golic M， Rugor J， Solano ME， Arck PC， Gauster M， Huppertz B， Emontzpohl C， Stoppe C， Bernhagen J， Leng L， Bucala R， Schulz H， Heuser A， Weedon-Fekj?r MS， Johnsen GM， Peetz D， Luft FC， Staff AC， Müller DN， Dechend R， Herse F. CD74-downregulation of placental macrophage-trophoblastic interactions in preeclampsia. Circ Res， 2016， 119（1）：55-68.

[8] Tomita Y， Dorward H， Yool AJ， Smith E， Townsend AR， Price TJ， Hardingham JE. Role of aquaporin 1 signalling in cancer development and progression. Int J Mol Sci， 2017， 18（2）：299.

[9] Mu YR， Zhou MY， Cai L， Liu MM， Li R. Overexpression of aquaporin 1 in synovium aggravates rat collagen-induced arthritis through regulating β-catenin signaling： an in vivo and in vitro Study. J Inflamm Res， 2020， 13：701-712.

[10] Shu C， Shu Y， Gao Y， Chi H， Han J. Inhibitory effect of AQP1 silencing on adhesion and angiogenesis in ectopic endometrial cells of mice with endometriosis through activating the Wnt signaling pathway. Cell Cycle， 2019， 18（17）：2026-2039.

（收稿日期：2020-10-09）

（本文編輯：林燕薇）